CN101669448A - 红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法 - Google Patents

红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法，包括以下步骤：首先选取性腺成熟、体征良好的红鲫、黄尾密鲴分别作为杂交的母本亲鱼和父本亲鱼，在繁殖季节对所述的父、母本亲鱼进行人工催产，再选择催产效果良好的父、母本亲鱼进行人工干法授精，授精完成后进行流水自动孵化，待鱼苗孵化完成后进行饲养，再对饲养后的鱼苗进行检测、筛分，获得红鲫与黄尾密鲴杂交三倍体鱼、红鲫与黄尾密鲴杂交四倍体鱼和天然雌核发育红鲫。本发明培育出的杂交后代不仅性状改善，显著提高了远缘杂交的受精率和孵化率，而且是一种产生四倍体鱼和天然雌核发育鱼的新途径，在生物进化和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。

Description

红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法
技术领域
本发明涉及鱼类杂交方法，尤其涉及鲤科鱼类中亚科间的远缘杂交方法。
背景技术
杂交技术是改良鱼类性状常用的方法，而亲缘关系在种间或种间以上的杂交一般称为远缘杂交。通过远缘杂交后，杂交后代可以整合亲本的优良性状，使其可能在繁殖力、生长速度、抗病力、体形、肉质等方面表现出杂交品种的优势，进而使鱼类的性状得到改良。如红鲫与湘江野鲤的属间远缘杂交形成的杂交后代具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗病力强、存活率高等优点；红鲫与团头鲂的亚科间远缘杂交形成的杂交后代除具有鲫鲤杂交鱼以上优点外，体背还明显增高，外形优美，具有良好的经济效应。然而，远缘杂交也存在杂交后代不可存活或存活率较低等问题。
CN1108469A号中国专利文献公开了一种以红鲫鱼为父本、以红鲤等鲤鱼为母本的杂交和驯养方法，CN1135834A号中国专利文献则公开了一种以红鲫鱼为父本、以锦鲤为母本的杂交和驯养方法，这两篇文献公开的杂交方法中都是用相同亚科(鲤亚科)内的不同品种鱼作为父母本鱼，且红鲫均是作为父本鱼进行杂交，杂交方法简单，后代中性状改良程度不显著。
如何在现有的鱼品种中挑选更加合适的父、母本亲鱼进行远缘杂交，如何改进远缘杂交的方法和步骤，以获得性状更为优良、品种更加丰富、对遗传研究和育种更具意义的新型杂交鱼，就成为本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种受精率高、孵化率高、操作方便、能有效改善杂交后代性状的红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法，该方法在今后的生物进化研究和遗传育种等方面也具有非常重要的意义。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案包括以下步骤：首先选取性腺成熟、体征良好的红鲫、黄尾密鲴分别作为杂交的母本亲鱼和父本亲鱼，在繁殖季节对所述的父、母本亲鱼进行人工催产，再选择催产效果良好的父、母本亲鱼进行人工干法授精，授精完成后进行流水自动孵化，待鱼苗孵化完成后进行饲养，再对饲养后的鱼苗进行检测、筛分，获得红鲫与黄尾密鲴杂交三倍体鱼、红鲫与黄尾密鲴杂交四倍体鱼和天然雌核发育红鲫。
具体来说，上述方法可按下述操作进行：
1)亲鱼的挑选和培育：在繁殖期前2～3个月挑选性成熟特征明显、体征良好的雌性红鲫和雄性黄尾密鲴作为远缘杂交的亲鱼进行专池培育，促进亲鱼性腺发育成熟；体征良好的亲鱼一般表现为体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤；
2)人工催产：在繁殖季节使水温稳定在20℃以上，然后先向母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与地欧酮(DOM)的混合催产剂进行催产，所述绒毛膜促性腺激素的用量为800～1000IU/kg，所述地欧酮的用量为3～6mg/kg；母本亲鱼注射后4～5h开始向父本亲鱼注射所述混合催产剂，父本亲鱼的注射剂量减半；注射后按1∶(1.5～2)的数量比将母、父本亲鱼放入同一产卵池中直至其开始顺利产卵和产精；注射时优选采用胸鳍基部无鳞处腹腔一次性注射的方法，以提高亲鱼(特别是黄尾密鲴)的存活率；
3)授精孵化：挑选产卵量大的母本和产精量大的父本进行人工干法授精，并将受精卵置于水温为22℃～25℃的孵化池中进行流水自动孵化；
4)饲养：鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育3～4天，待鱼苗出现腰点、开始平游、能够主动开口摄食后转入池塘饲养，鱼苗长成后进行检测、筛分即可得到红鲫与黄尾密鲴杂交三倍体鱼、红鲫与黄尾密鲴杂交四倍体鱼和天然雌核发育红鲫。
红鲫(Carassius auratus red var.)属于鲤科、鲤亚科中的二倍体鱼(2n＝100)，黄尾密鲴(Xenocypris davidi Bleeker)属于鲤科、鲴亚科中的二倍体鱼(2n＝48)，黄尾密鲴具有内脏少、食性杂、生长快、适应性强、易捕捞等特点，其肉质细嫩，味道鲜甜，含肉率高，营养丰富，深受人们的青睐，但该鱼的性情急躁，人工繁殖难度较大。我们通过反复实验最终选择红鲫为母本，黄尾密鲴为父本，通过远缘杂交方法获得了性状优良的红鲫与黄尾密鲴杂交鱼和天然雌核发育红鲫；相比同类杂交试验，本发明的受精率和孵化率都得到了显著提高，获得的杂交后代兼有亲本的优良特征，相比于其他种类父母本亲鱼得到的远缘杂交后代，优势更加明显。此外，红鲫与黄尾密鲴杂交鱼的父母本隶属于不同的亚科，在遗传、分类和体形等生物学特性方面存在较大的差异，尤其是他们的体细胞染色体数目之间差异很大(红鲫的染色体数目为100，而黄尾密鲴的染色体数目为48)，而且不成倍性关系，因此远缘杂交的困难程度也比其他种类的杂交更大。在迄今国内外尚未出现红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交成功的报道的情况下，本发明利用远缘杂交和天然雌核发育方法成功获得了红鲫与黄尾密鲴杂交三倍体鱼、红鲫与黄尾密鲴杂交四倍体鱼和天然雌核发育红鲫，这些新型杂交鱼品种的成功培育，在今后的生物进化研究和遗传育种等方面具有非常重要的意义。
附图说明
图1为红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00021
后代中四倍体鱼的外形照片；
图2为红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00031
后代中四倍体鱼的染色体图(4n＝148)；
图3为红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00032
后代中三倍体鱼的外形照片；
图4为红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00033
后代中三倍体鱼的染色体图(3n＝124)；
图5为红鲫(♀)×黄尾密鲴后代中天然雌核发育鱼的外形照片；
图6为红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00035
后代中天然雌核发育鱼的染色体图(2n＝100)。
具体实施方式
实施例：
一种本发明的红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法，包括以下步骤：
1)亲鱼的挑选和培育：在繁殖期前2～3个月挑选性成熟特征明显、体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤的红鲫和黄尾密鲴个体作为亲鱼进行专池培育，合理投喂饲料，保持池水活爽，促进亲鱼性腺发育成熟；
2)人工催产：在上述亲鱼的繁殖季节(当年4月下旬至五月初)开始进行人工催产，先使水温稳定在20℃以上，然后先向雌性亲鱼体内注射绒毛膜促性腺激素与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的注射用量为800～1000IU/kg，地欧酮的注射用量为3～6mg/kg，向雌性亲鱼注射后4～5h再向雄性亲鱼注射该混合催产剂，雄性亲鱼的注射剂量减半；上述注射均采用胸鳍基部无鳞处腹腔一次性注射方法，以尽量提高亲鱼(特别是黄尾密鲴)的存活率；注射后将亲鱼按雌雄1∶(1.5～2)的比例放入产卵池中，水面吊一纱窗网片，以检测亲鱼的发情产卵情况；在完全静水条件下，经过6～8h后药物开始发挥效用；
3)授精孵化：当发现亲鱼在产卵池中呈“螺旋状”追逐、纱窗网片上沾有适量卵粒后，拉网并开始打捞亲鱼进行检测(注意要用软质网，操作要轻，水中检测)；挑选产卵顺利的母本和产精量大的父本，揩干体表水分，将精卵挤入干净的瓷盆中，用干净的羽毛迅速不停地搅拌2min～3min，然后铺于浸入水中的2m2左右的网片之上，密度控制在1万粒/m2左右，于孵化池中22℃～25℃水温下流水自动孵化；
4)饲养：鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育3～4天，待其出现腰点、开始平游、能够主动开口摄食后转入池塘中用适口饵料进行饲养，可先用豆浆喂养1～2个星期，再换喂磨碎的常规鱼饲料，直至鱼苗长到能正常摄食。
实验证明，在红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00036
组合中能够产生存活的后代，其受精率和孵化率分别为59.2％和48.7％，相比同类杂交试验，其受精率和孵化率得到了显著地提高。而其反交组合红鲫
Figure G2009100444660D00037
×黄尾密鲴(♀)不能产生存活的后代。
对上述长成后的鱼苗进行检测分析，发现在红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00038
的杂交后代中出现有三种不同体色的杂交鱼，一种体色为青灰色(图1所示的杂交后代鱼)，一种体色较深(图3所示的杂交后代鱼)，还有一种体色呈红色(图5所示的杂交后代鱼)。在体形上，前两种杂交后代鱼兼有红鲫和黄尾密鲴的特征，例如它们的头部偏像于黄尾密鲴，身体部位却类似于红鲫，体形优美，肉质鲜嫩。而红色杂交后代鱼则头小背高、尾巴短小，与图1、图3所示的杂交后代鱼存在较明显的差异。
等鱼苗长到适当大小(10g左右)的时候用肾细胞直接制片法对红鲫(♀)×黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00041
杂交后代鱼的体细胞染色体数目进行检测。检测后发现杂交后代中的青灰色鱼为红鲫(♀)与黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00042
的杂交四倍体鱼(4n＝148)，染色体图如图2所示；体色较深的杂交鱼为红鲫(♀)与黄尾密鲴
Figure G2009100444660D00043
的杂交三倍体鱼(3n＝124)，其染色体图如图4所示；体色为红色的杂交鱼为天然雌核发育二倍体红鲫(2n＝100)，其染色体图如图6所示。
肾细胞直接制片法的方法为：在18℃～22℃水温下培育实验鱼1～3d后，对实验鱼注射PHA 1次～3次，每次剂量为2～8μg/克体重，间隔时间为12～24h，在解剖取材前2～6h，注射秋水仙素，剂量为2～4μg/克体重；取出肾组织，在生理盐水下剪碎肾组织，0.075mol/LKCL低渗处理，在20℃温度下低渗40～60min；用冰醋酸∶甲醇为1∶3的混合液固定肾细胞1～3次；在冰冻载玻片上滴片；Giemsa染液染色一个小时左右，然后镜检。
本实施例的方法利用雌性红鲫与雄性黄尾密鲴进行亚科间远缘杂交，为四倍体鱼的形成提供了新的途径，也为生物的进化研究提供了新的证据。并且，有望进一步选育出可育的四倍体个体，用其制备具有优良性状的多倍体鱼，以期产生显著的经济效益。另外，本实施例获得的天然雌核发育红鲫为天然雌核发育鱼的制备提供了新的方法和途径。
本实施例方法制备的新型四倍体鱼和天然雌核发育鱼在生物进化和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。

Claims (3)

1、一种红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法，包括以下步骤：首先选取性腺成熟、体征良好的红鲫、黄尾密鲴分别作为杂交的母本亲鱼和父本亲鱼，在繁殖季节对所述的父、母本亲鱼进行人工催产，再选择催产效果良好的父、母本亲鱼进行人工干法授精，授精完成后进行流水自动孵化，待鱼苗孵化完成后进行饲养，再对饲养后的鱼苗进行检测、筛分，获得红鲫与黄尾密鲴杂交三倍体鱼、红鲫与黄尾密鲴杂交四倍体鱼和天然雌核发育红鲫。
2、根据权利要求1所述的红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1)亲鱼的挑选和培育：在繁殖期前2～3个月挑选性成熟特征明显、体征良好的雌性红鲫和雄性黄尾密鲴作为远缘杂交的亲鱼进行专池培育，促进亲鱼性腺发育成熟；
2)人工催产：在繁殖季节使水温稳定在20℃以上，然后先向母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与地欧酮的混合催产剂进行催产，所述绒毛膜促性腺激素的用量为800～1000IU/kg，所述地欧酮的用量为3～6mg/kg；母本亲鱼注射后4～5h再向父本亲鱼注射所述混合催产剂，父本亲鱼的注射剂量减半；注射后按1∶(1.5～2)的数量比将母、父本亲鱼放入同一产卵池中直至其开始顺利产卵和产精；
3)授精孵化：挑选产卵量大的母本和产精量大的父本进行人工干法授精，并将受精卵置于水温为22℃～25℃的孵化池中进行流水自动孵化；
4)饲养：鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育3～4天，待鱼苗出现腰点、开始平游、能够主动开口摄食后转入池塘饲养，鱼苗长成后得到红鲫与黄尾密鲴杂交三倍体鱼、红鲫与黄尾密鲴杂交四倍体鱼和天然雌核发育红鲫。
3、根据权利要求2所述的红鲫与黄尾密鲴亚科间远缘杂交的方法，其特征在于：所述人工催产时对亲鱼的注射是采用胸鳍基部无鳞处腹腔一次性注射的方法。
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