CN115349496B - 一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法 - Google Patents
一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115349496B CN115349496B CN202211000404.1A CN202211000404A CN115349496B CN 115349496 B CN115349496 B CN 115349496B CN 202211000404 A CN202211000404 A CN 202211000404A CN 115349496 B CN115349496 B CN 115349496B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- water
- gynogenesis
- siniperca chuatsi
- sperms
- largehead
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000264847 Siniperca chuatsi Species 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 241001125889 Micropterus salmoides Species 0.000 title claims description 77
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 34
- 241000321429 Epinephelus itajara Species 0.000 claims abstract description 29
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 18
- 239000004568 cement Substances 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 12
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 241000218652 Larix Species 0.000 claims description 9
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 241000238571 Cladocera Species 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims description 4
- 238000003892 spreading Methods 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims description 3
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005375 lutein Drugs 0.000 claims description 3
- ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N 0.000 claims description 3
- 235000012680 lutein Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001656 lutein Substances 0.000 claims description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 claims description 3
- FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N xanthophyll Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C=C(C)C(O)CC2(C)C FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N 0.000 claims description 3
- 241000238578 Daphnia Species 0.000 claims description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 2
- 241001125875 Micropterus Species 0.000 claims 2
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 claims 2
- 102100031951 Oxytocin-neurophysin 1 Human genes 0.000 claims 2
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 claims 2
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 claims 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 abstract description 10
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000002196 ecbolic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 2
- 241000269794 Lateolabrax Species 0.000 description 2
- 241000264848 Siniperca Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010028690 Fish Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 1
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 1
- 241001235216 Larix decidua Species 0.000 description 1
- 241000269795 Lateolabrax japonicus Species 0.000 description 1
- 241001275890 Megalobrama amblycephala Species 0.000 description 1
- 241000291280 Micropterus floridanus Species 0.000 description 1
- 241000595940 Notostraca Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000034004 oogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 230000008771 sex reversal Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
Abstract
本发明属于鱼类种质资源改良领域，公开了一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法，通过人工催产获得大口黑鲈成熟卵子和翘嘴鳜精液，用Hank’s液将翘嘴鳜精液稀释，在40w紫外灯对翘嘴鳜精液进行灭活处理5‑10min后与大口黑鲈成熟卵子混合，在常温水中进行受精2‑3min，然后在4℃的冷水中进行冷处理10‑15min，再在18‑20℃水中进行静水孵化即得到雌核发育的大口黑鲈。本发明采用翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育成功选育得到雌核发育大口黑鲈后代，生长速度和肉质方面明显强于普通大口黑鲈，在不仅为改良大口黑鲈种质资源提供了良好基础，而且在遗传育种和生物进化方面也具有重大的意义。
Description
技术领域
本发明属于鱼类种质资源改良领域，尤其涉及一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus Salmoides)又名加州鲈，原产于北美洲，在分类学上隶属于鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属。20世纪80年代从国外引进并取得养殖、繁殖的成功。大口黑鲈是一种肉质鲜美、无肌间刺、生长快、易起捕、适温较广的肉食性鱼类，逐渐成为名优养殖品种。2020年，我国大口黑鲈养殖产量达到61万吨。虽然大口黑鲈的养殖人工繁育取得了一定的进展和可喜的成绩，但是在过去的十多年里，大口黑鲈产业迅速发展，苗种需求量急剧上升，传统的育种手段已经不能满足市场需求，因此迫切需要良种繁育和品种改良来满足产业发展。
人工诱导鱼类雌核发育技术作为获得优良品种、加快种群选育、性别控制的有效手段，其核心技术包括精子遗传物质灭活与受精卵染色体加倍。精子遗传物质灭活与受精卵染色体加倍方法都有物理法和化学法，应用得较多的均为物理法，其中精子遗传物质灭活物理法中应用得较多的为紫外线法；受精卵的染色体加倍物理法中应用得较多的为冷休克法。大口黑鲈作为深受广大消费者喜爱的特色淡水鱼类，其消费需求日益增长，为满足广大消费者的需求优良品种的培育必不可少。目前大口黑鲈种质改良主要集中在群体选育及近缘杂交上，还未有利用雌核发育对大口黑鲈进行种质改良的报道。大口黑鲈人工诱导雌核发育技术的难点主要集中在一下几方面：第一，大口黑鲈卵子发育不同步，属于分批产卵的鱼类，雌鱼经人工催产后每次产卵的数量较少；第二，大口黑鲈雌鱼人工催产后的效应时间不固定，催产后2-15天都可能产卵；第三，大口黑鲈属于鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属的鱼类，难以找到一种合适的异源精子对其进行雌核发育诱导，既能保证成功激活卵子发育，又能不产生杂交子代。
为此，针对改良大口黑鲈种质资源选择更适合的异源精子供体，并成功培育出生长速度快、肉质好的雌核发育大口黑鲈对其种质改良与生产实践有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法
(1)选育II龄的雌性大口黑鲈和雄性翘嘴鳜作为亲鱼进行精养，然后进行人工催产获得雌性大口黑鲈成熟卵子和雄性翘嘴鳜精液；
(2)用预冷的培养皿收集步骤(1)后得到的翘嘴鳜精液，用预冷的Hank’s液稀释，得到的稀释精液放置于铺有冰板的摇床上，同时用40W紫外灯照射进行灭活处理5-10min，紫外灯与摇床的距离为18-20cm，显微镜观察灭活后的精子90％以上丧失运动能力即可；
(3)将步骤(2)灭活处理后得到的翘嘴鳜精液与所述步骤(1)后得到的大口黑鲈成熟卵子混合，平铺于盛有常温水的培养皿中受精2-3min，然后把培养皿中的常温水换成4℃的冷水进行冷处理10-15min，再把培养皿中的冷水换成常温水进行静水孵化，孵化出的正常鱼苗即雌核发育的大口黑鲈。
合适的外源精液诱导是雌核发育成功的重要因素。翘嘴鳜隶属于鲈形目，鮨科，鳜属，其分布范围广，生长速度较快，繁殖能力强，无小刺且肉质好，是具有重要经济价值的名优鱼类。本发明中使用翘嘴鳜精液诱导大口黑鲈雌核发育具有明显优势，翘嘴鳜肉质好，生长速度快，并且精液量大，质量高，精子的活性好，是作为雌核发育精子来源的良好供体。且在前期的远源杂交实验中，证实大口黑鲈与翘嘴鳜杂交不能产生正常的后代，用其精液诱导大口黑鲈雌核发育得到的存活后代即为雌核发育后代，无需进行进一步的甄别。
进行大口黑鲈雌核发育，为了保证大口黑鲈卵子的质量，对大口黑鲈选育和催产的注射剂量最优化是必须的。这些技术方面的改进，对提高雌核发育鱼的存活率，改良种质资源是至关重要的。
上述的方法，优选的，在步骤(1)中，所述精养的具体操作包括如下步骤：在繁殖前3-4个月，选择II龄、无伤病、性成熟特征明显的雌性大口黑鲈和雄性翘嘴鳜分池精养，精养期间用活饵饲养，水质保持良好，在繁殖季节前1个月，每隔2天进行流水刺激以促进亲鱼的性腺成熟。
优选的，在步骤(1)中，所述人工催产的具体操作包括如下步骤：当水温达到18℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A2)、绒毛膜促性腺激素(HCG)与地欧酮(DOM)的混合催产剂进行催产，雌性大口黑鲈LRH-A2的注射量为20-25μg/kg，HCG的注射量为1500-2000IU/kg，DOM的注射量为5mg/kg；雄性翘嘴鳜LRH-A2的注射量为8-10μg/kg，HCG的注射量为500IU/kg。在该催产剂量下，水温18℃-20℃时，雌鱼效应时间为36-40h，每尾雌鱼产卵量约为2万颗。
大口黑鲈属于分批产卵鱼类，每尾雌鱼每次产卵数量通常只有几百颗到千多科，而雌核发育的存活率本身就低，产卵量少无疑加大了其雌核发育操作难度。此外，大口黑鲈且催产效应时间很难把控，催产后的1天到15天内都有可能进行产卵，不能准确把控催产时间无疑又加大了其雌核发育难度。经过申请人长期催产实验，结果表明，虽然大口黑鲈I龄即可性成熟，但用I龄雌鱼催产进行人工诱导雌核发育，产卵量及催产效应时间把控不好，催产效果不理想。而对II龄的雌性大口黑鲈进行人工诱导雌核发育，可以取得较理想的结果。具体体现在对II龄的雌性大口黑鲈注射HCG、LRH-A和DOM注射量分别为1500-2000IU/kg，20-25μg/kg和5mg/kg，能促使II龄的雌性大口黑鲈正常产卵，每尾雌鱼每次产卵数量可达2万颗，且催产后的效应时间可控制在36h左右。
优选的，在步骤(2)中，每升Hank’s液包括以下各组分：KCl 0.4g，NaCl 8.01g，NaHCO30.35g，KH2PO40.06 g，Na2HPO4·2H2O 0.6g，MgSO4·7H2O 0.1g，MgCl2·6H2O 0.1g，CaCl22H2O 0.14g，葡萄糖10g，最后加去离子水至1L；所述Hank’s液与精液按体积比15-20︰1进行稀释。
优选的，在步骤(2)中，预冷的培养皿及预冷的Hank’s液的温度为4℃，所述摇床的转数为80-100r/min。
优选的，在步骤(2)中，进行灭活处理时使用光学显微镜观察精子的活力，每隔30-60s观察一次，待只有10％的精子有运动能力时停止紫外照射，照射好的精液在4℃避光环境下保存，2h之内完成受精。
优选的，在步骤(3)中，所述静水孵化时定时将停止发育的受精卵剔除并保持5-7h换一次水，待鱼苗能平游时，把鱼苗转入前期培育出大量水蚤的水泥池中进行培育及驯食，再转入土池继续进行饲养。
更优选的，所述水泥池的水蚤培育具体包括如下步骤：在水泥池中加入1/4体积的泉水，然后加入土池中的淤泥，再辅以豆浆进行肥化至少7天，培育水蚤。
更优选的，所述驯食具体包括如下步骤：水泥池塘用遮光布遮住，使池塘水体保持黑暗环境，在水泥池一角安置一强光手电筒，同时安置一套点滴系统，点滴瓶放置浮游动物(水蚤或丰年虫等)，通过浮游动物滴管滴至强光手电筒附近，使雌核发育大口黑鲈能聚集到灯光附近摄食，逐渐减少滴瓶浮游动物的量，添加饲料粉，当大口黑鲈能完全摄食饲料粉的时候，即驯化成功了。
更优选的，所述鱼苗在水泥池中进行培育的时间为40-60天。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的方法，采用翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育成功选育得到雌核发育大口黑鲈后代，这在大口黑鲈人工诱导雌核发育尚属首次；在养殖过程中，雌核发育的大口黑鲈在生长速度、肉质等方面明显强于普通大口黑鲈，不仅为改良大口黑鲈种质资源提供了良好基础，而且在遗传育种和生物进化方面也具有重大的意义。
2、本发明中，选取II龄的雌性大口黑鲈作为亲本诱导其雌核发育，并对催产药物剂量进行优化，既确保了大口黑鲈可以在预定的时间内产卵，又能得到较多的卵子数量，这对雌核发育的成功奠定了坚实的基础。
3、本发明选用鲈形目鮨科鳜属翘嘴鳜作为精子源，其生长速度较快，繁殖能力强，无小刺且肉质好，是具有重要经济价值的名优鱼类；本发明中使用翘嘴鳜精液诱导大口黑鲈雌核发育具有明显优势，翘嘴鳜肉质好，生长速度快，并且精液量大，质量高，精子的活性好，是作为雌核发育精子来源的良好供体；且在前期的远源杂交实验中，证实大口黑鲈与翘嘴鳜杂交不能产生正常的后代，用其精液诱导大口黑鲈雌核发育得到的存活后代即为雌核发育后代，无需进行进一步的甄别；由于翘嘴鳜可以持续提供精液，每尾雄性翘嘴鳜可提供10-15mL精液，可供10-15次雌核发育实验，且取精液后不会影响其存活，避免没有必要的损失；由于翘嘴鳜与大口黑鲈都属于鲈形目鱼类，因此在使用翘嘴鳜精子激活大口黑鲈卵子进行雌核发育时效率非常高，并且在雌核发育大口黑鲈中形成异精“杂交”效应。
4、本发明中得到的雌核发育后代，还可以进一步通过性反转技术，把雌核发育大口黑鲈变成生理雄性的个体，性成熟后再与雌核发育大口黑鲈进行交配，获得大量优良性状的单性大口黑鲈进行养殖，具有良好的市场前景和经济价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为普通大口黑鲈外形图；
图2为雌核发育大口黑鲈外形图；
图3为雌核发育大口黑鲈性别特异性引物胶图；
图4为普通大口黑鲈流式图；
图5为雌核发育大口黑鲈流式图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种本发明的翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法，包括如下步骤：
(1)亲鱼的选择与培育：在繁殖前3个月，选择体态健硕，无伤病，性成熟特征明显的雄性翘嘴鳜和雌性大口黑鲈作为亲鱼分池进行精养，在精养期间，活鱼喂食，水质保持良好；在繁殖季节前1个月，每天保持流水刺激，用来促进亲鱼的性腺成熟；
(2)人工催产：在当年的5月初到6月底，当水温达到18℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A2)、绒毛膜促性腺激素(HCG)与地欧酮(DOM)的混合催产剂进行催产，雌性大口黑鲈LRH-A2的注射量为20-25μg/kg，HCG的注射量为1500-2000IU/kg，DOM的注射量为5mg/kg；雄性翘嘴鳜LRH-A2的注射量为8-10μg/kg，HCG的注射量为500IU/kg；
(3)翘嘴鳜精液收集与灭活：时刻观察、记录催产的鱼，当观察到大口黑鲈在产卵池中开始追逐，且事先挂好的棕榈片上有少量卵粒时，用软质网开始打捞(动作要轻，在水中进行检测)，轻按雌鱼腹部可从泄殖腔流出卵粒的鱼即可用于进行雌核发育实验；首先，用干净，预冷的培养皿小心收集精液，并稀释精液，精液与Hank’s按1:15-20体积比进行稀释，然后平铺于预冷培养皿，形成薄薄的一层，在放置于80-100r/min的铺有冰板的摇床上进行紫外照射，使用40W的紫外灯进行照射，紫外灯与摇床的距离为20cm，照射5-10min，用于灭活精子；使用显微镜观察精子活性，前期每隔60s观察一次，当精子活力明显降低时，每隔30s观察一次，观察到只有10％左右的精子仍保持活性的时候，停止紫外照射，并把照射好的精液保存到4℃的避光管中；
1LHank’s液包括以下质量份的各组分：KCl 0.4g，NaCl 8.01g，NaHCO30.35 g，KH2PO40.06g，Na2HPO4·2H2O 0.6g，MgSO4·7H2O 0.1g，MgCl2·6H2O 0.1g，CaCl22H2O 0.14g，葡萄糖10g，最后加去离子水至1L；
(4)卵子激活与冷处理：然后把大口黑鲈卵子挤入干净的瓷盆中，加入照射好的翘嘴鳜精液，使用羽毛轻轻搅拌，使其混合均匀，然后加入20℃左右的水使其受精，再平铺于到培养皿中，受精2-3min，把培养皿放置于事先调好的4℃的冷水中进行冷处理，冷处理10-15min，将培养皿拿出，再换成常温水，静水孵化；定时将发育停止的胚胎用吸管吸走，5h左右换一次水；水温20℃左右，约3d鱼苗能出膜，5-7d能平游；
(5)饲养：鱼苗能平游后，再把鱼苗转移至事先培育出水蚤的水泥池中进行养殖，在水泥池前期饲养40-60d，转入土池继续进行饲养，就得到了雌核发育大口黑鲈；普通大口黑鲈外形如图1，雌核发育大口黑鲈外形如图2。
水泥池的水蚤培育的过程具体包括如下步骤：在水泥池中加入约半池泉水，然后少许加入土池中的淤泥，每天早、中、晚三次泼洒都加，时刻关注水体蚤类等浮游动物生长情况，当水质良好，水体中水蚤丰富时，把能平游的鱼苗转入水泥池中。
孵化期间，我们也对雌核发育大口黑鲈的受精率、孵化率及畸形率进行了统计，雌核发育大口黑鲈的受精率为30-60％，孵化率为0.1-5％，畸形率为20-50％。
鱼苗饲养三个月左右后，我们检测了雌核发育大口黑鲈的可数性状，并与普通大口黑鲈进行了比较，如下表1。
表1雌核发育团头鲂大口黑鲈、大口黑鲈及翘嘴鳜的可数性状比较
注：+前的数字表示硬棘数目，+后的数字表示除硬棘之外的鳍条数
我们把普通大口黑鲈和雌核发育大口黑鲈分别养殖在相同的条件下，3和6月龄的雌核发育大口黑鲈与普通大口黑鲈的重量并进行了比较，结果如表2所示。
表2雌核发育大口黑鲈与普通大口黑鲈平均体重比较(g)
我们使用性别特异性分子标记的方法对雌核发育大口黑鲈进行了检测，发现雌核发育大口黑鲈全部为雌性，进一步证实了大口黑鲈的性别决定方式为雌性同配-雄性异配(XX-XY)(图3所示)。
分子标记检测方法为：剪雌核发育大口黑鲈及普通雄性大口黑鲈尾鳍，用DNA提取试剂盒(生工生物，上海)提取DNA。以提取的DNA作为模板，用大口黑鲈性别特异性(F-TGAGCTACAGCCACCCAAAT，R-GCCGTGCAGAAGTAACATAACA)进行PCR扩增，PCR反应体系包括0.25单位Taq聚合酶，1μL 10×PCR缓冲液，100μM dNTP混合物，50ng基因组DNA模板，正反引物个0.1μM，总体积25μL。PCR反应条件为94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s，循环35次。最后，PCR产物在1.5琼脂糖凝胶上检测。雄性大口黑鲈在400bp左右会有一条带，雌性大口黑鲈无条带。
同时，我们用普通大口黑鲈作为参照，用流式细胞仪检测了雌核发育大口黑鲈的DNA含量，图4、图5分别为普通大口黑鲈与雌核发育大口黑鲈的流式图。普通大口黑鲈、雌核发育大口黑鲈的DNA平均含量分别为，其DNA平均含量的比值为1，与预期的比值1︰1没有差异，证明雌核发育大口黑鲈是二倍体，雌核发育大口黑鲈的主要遗传物质来源于大口黑鲈。
流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.1mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；加DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测。
本发明主要使用了雌核发育技术，雌核发育技术是重要的鱼类遗传育种手段。雌核发育主要是依赖卵子自身的遗传物质发育成个体，由于需要对卵子进行加倍处理，其孵化率通常很低。对于大口黑鲈来说，其分批产卵及催产效应时间的不确定性的特点无疑加大了其雌核发育的难度。在本发明中，我们通过前期大量的探索实验，发现采用II龄的雌性大口黑鲈，对其注射HCG、LRH-A和DOM注射量分别为1500-2000IU/kg，20-25μg/kg和5mg/kg，能达到很好的催产效果，这为雌核发育的成功奠定了坚实的基础。
我们在实施本发明的时候，选择翘嘴鳜精子作为刺激源，这是非常有意义的，首先，翘嘴鳜自身就具备很多优良性状，如生长速度快，肉质好，繁殖能力强，分布广泛，精液产量大、活力强；其次，使用翘嘴鳜精子作为刺激源，在获取精液方面非常方便，并且在使用紫外灯对精子灭活时，非常容易判断灭活的效果；最重要的是，在使用翘嘴鳜精液诱导大口黑鲈雌核发育的长期研究过程中，我们观察到翘嘴鳜精液不仅能有效的激活大口黑鲈的卵子，而且有精子的少量DNA片段整合到了雌核发育后代的基因组中，产生了“杂交”效应，并且展现出“杂交”优势，使雌核发育大口黑鲈在生长速度，肉质方面强于普通大口黑鲈。不仅为改良大口黑鲈种质资源提供了良好基础，而且在遗传育种和生物进化方面也具有重大的意义。此外，我们在灭活精子时，选择了合适的紫外剂量，在卵子加倍的时候选择了合适的冷处时间和温度，这对本领域的研究人员是非常有借鉴意义。
在生产上，我们可以进一步结合性反转技术，把雌核发育大口黑鲈诱导成生理雄性的大口黑鲈，使其再与雌核发育大口黑鲈杂交，获得大量具有优势的单性大口黑鲈后代。可以在许多地方引进具有优势的单性大口黑鲈进行养殖，既能获得大量的鱼类蛋白质，又能控制过度繁殖的危险，具有良好的市场前景和经济价值。
Claims (5)
1.一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选育II龄的雌性大口黑鲈和雄性翘嘴鳜作为亲鱼进行精养，然后进行人工催产获得雌性大口黑鲈成熟卵子和雄性翘嘴鳜精液；
所述精养的具体操作包括如下步骤：在繁殖前3-4个月，选择II龄、无伤病、性成熟特征明显的雌性大口黑鲈和雄性翘嘴鳜分池精养，精养期间用活饵饲养，水质保持良好，在繁殖季节前1个月，每隔2天进行流水刺激以促进亲鱼的性腺成熟；
所述人工催产的具体操作包括如下步骤：当水温达到18-20℃时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素与地欧酮的混合催产剂进行催产；雌性大口黑鲈LRH-A2的注射量为20-25μg/kg，HCG的注射量为1500-2000IU/kg，DOM的注射量为5mg/kg；雄性翘嘴鳜LRH-A2的注射量为8-10μg/kg，HCG的注射量为500IU/kg；
(2)用预冷的培养皿收集步骤(1)后得到的翘嘴鳜精液，用预冷的Hank’s液稀释，得到的稀释精液放置于铺有冰板的摇床上，同时用40W紫外灯照射进行灭活处理5-10min，紫外灯与摇床的距离为18-20cm，显微镜观察灭活后的精子90％以上丧失运动能力即可；
每升Hank’s液包括以下各组分：KCl 0.4g，NaCl 8.01g，NaHCO3 0.35g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·2H2O 0.6g，MgSO4·7H2O 0.1g，MgCl2·6H2O 0.1g，CaCl2 2H2O 0.14g，葡萄糖10g，最后加去离子水至1L；所述Hank’s液与精液按体积比15-20︰1进行稀释；
预冷的培养皿及预冷的Hank’s液的温度为4℃，所述摇床的转数为80-100r/min；
进行灭活处理时使用光学显微镜观察精子的活力，每隔30-60s观察一次，待只有10％的精子有运动能力时停止紫外照射，照射好的精液在4℃避光环境下保存，2h之内完成受精；
(3)将步骤(2)灭活处理后得到的翘嘴鳜精液与所述步骤(1)后得到的大口黑鲈成熟卵子混合，平铺于盛有常温水的培养皿中受精2-3min，然后把培养皿中的常温水换成4℃的冷水进行冷处理10-15min，再把培养皿中的冷水换成常温水进行静水孵化，孵化出的正常鱼苗即雌核发育的大口黑鲈。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述静水孵化时定时将停止发育的受精卵剔除并保持5-7h换一次水，待鱼苗能平游时，把鱼苗转入前期培育出大量水蚤的水泥池中进行培育及驯食，再转入土池继续进行饲养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水泥池的水蚤培育具体包括如下步骤：在水泥池中加入1/4体积的泉水，然后加入土池中的淤泥，再辅以豆浆进行肥化至少7天，培育水蚤。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述驯食具体包括如下步骤：水泥池塘用遮光布遮住，使池塘水体保持黑暗环境，在水泥池一角安置一强光手电筒，同时安置一套点滴系统，点滴瓶放置浮游动物，通过浮游动物滴管滴至强光手电筒附近，使雌核发育大口黑鲈能聚集到灯光附近摄食，逐渐减少滴瓶浮游动物的量，添加饲料粉，当大口黑鲈能完全摄食饲料粉的时候，即驯化成功了。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鱼苗在水泥池中进行培育的时间为40-60天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211000404.1A CN115349496B (zh) | 2022-08-19 | 2022-08-19 | 一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211000404.1A CN115349496B (zh) | 2022-08-19 | 2022-08-19 | 一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115349496A CN115349496A (zh) | 2022-11-18 |
| CN115349496B true CN115349496B (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=84003536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211000404.1A Active CN115349496B (zh) | 2022-08-19 | 2022-08-19 | 一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115349496B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101120660A (zh) * | 2007-08-28 | 2008-02-13 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法 |
| CN103734037A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-04-23 | 中山大学 | 一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法及其应用 |
| CN103891711A (zh) * | 2014-03-26 | 2014-07-02 | 中国海洋大学 | 花鲈精液的处理方法 |
| CN106818552A (zh) * | 2017-01-11 | 2017-06-13 | 武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所 | 一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法 |
| CN108834957A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-11-20 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种尼罗罗非鱼与翘嘴鳜雌核发育的方法 |
| CN112262794A (zh) * | 2020-10-24 | 2021-01-26 | 武汉市农业科学院 | 一种可持续规模化生产全雌鳜鱼的方法 |
| CN112535123A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-23 | 武汉市农业科学院 | 一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法 |
-
2022
- 2022-08-19 CN CN202211000404.1A patent/CN115349496B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101120660A (zh) * | 2007-08-28 | 2008-02-13 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法 |
| CN103734037A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-04-23 | 中山大学 | 一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法及其应用 |
| CN103891711A (zh) * | 2014-03-26 | 2014-07-02 | 中国海洋大学 | 花鲈精液的处理方法 |
| CN106818552A (zh) * | 2017-01-11 | 2017-06-13 | 武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所 | 一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法 |
| CN108834957A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-11-20 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种尼罗罗非鱼与翘嘴鳜雌核发育的方法 |
| CN112262794A (zh) * | 2020-10-24 | 2021-01-26 | 武汉市农业科学院 | 一种可持续规模化生产全雌鳜鱼的方法 |
| CN112535123A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-23 | 武汉市农业科学院 | 一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 异源精子诱导条斑星鲽雌核发育;杨景峰;陈松林;苏鹏志;邵长伟;田永胜;廖小林;翟介明;李波;;水产学报(第03期) * |
| 翘嘴鳜人工雌核发育的初步研究;余锐;梁旭方;张进;易提林;符云;叶卫;;淡水渔业(第03期) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115349496A (zh) | 2022-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102047851B (zh) | 养殖草鱼家系的构建和良种选育方法 | |
| CN101720698B (zh) | 团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法 | |
| CN109819914B (zh) | 一种卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的人工杂交育种方法 | |
| CN101884314B (zh) | 草鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 | |
| Brämick et al. | Testing of triploid tilapia (Oreochromis niloticus) under tropical pond conditions | |
| CN101690469A (zh) | 半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法 | |
| CN112400762B (zh) | 一种许氏平鲉的工厂化全人工繁殖方法 | |
| CN110521641B (zh) | 一种生长快石斑鱼的人工杂交育种方法 | |
| CN103931525A (zh) | 新疆裸重唇鱼的人工繁殖和鱼苗培育方法 | |
| CN105850812A (zh) | 一种具有生长率高、耐低氧的鲂鲌回交新品系的构建方法 | |
| CN110214753B (zh) | 选育四倍体金冠鱼的方法及其品系的建立方法和应用 | |
| CN106818552A (zh) | 一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法 | |
| Liu et al. | Interspecific hybridization and genetic characterization of Larimichthys polyactis (♀) and L. crocea (♂) | |
| CN112119948A (zh) | 鳙鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 | |
| CN109329122B (zh) | 一种改良日本白鲫的选育方法及其品系的建立方法 | |
| CN1172581C (zh) | 大鲵人工繁殖方法 | |
| CN107318719A (zh) | 锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法及雌核发育草鱼的应用 | |
| CN114793957B (zh) | 人工大规模诱导雌核发育花䱻的方法及应用 | |
| CN115349496B (zh) | 一种翘嘴鳜精子诱导大口黑鲈雌核发育的方法 | |
| CN111700007B (zh) | 锦鲤与鳙鱼亚科间远缘杂交的方法和四倍体锦鳙的应用 | |
| CN109496922A (zh) | 一种静水压诱导虹鳟四倍体的制种方法 | |
| CN114467808A (zh) | 源于远缘杂交天然雌核发育鳙鱼的规模化制备方法 | |
| CN109874707B (zh) | 一种高效创制异源八倍体银鲫的方法 | |
| CN104488759B (zh) | 一种分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法 | |
| CN107646759A (zh) | 草鱼与翘嘴红鲌亚科间远缘杂交的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |