CN103734037A - 一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法及其应用。该翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法包括如下步骤：取翘嘴鳜精液稀释后置于紫外线下照射，使精子遗传失活；失活的精子与卵子混合受精，启动卵子雌核发育；卵子受精后转移到淡水中进行热体克处理，使染色体组加倍，产生雌核发育二倍体；将翘嘴鳜雌核发育二倍体卵转入淡水中，室温孵化，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理，即得翘嘴鳜雌核发育二倍体鱼苗。本方法诱导产生的翘嘴鳜后代只含雌性亲本的基因，可加速优良基因纯合化，使优良的遗传性状得以迅速固定，在翘嘴鳜遗传分析和育种上具有广阔的应用前景；且该翘嘴鳜雌核发育二倍体诱导方法条件易得、便于控制，具有很大的生产实践推广价值。
Description
技术领域
本发明属于鱼类遗传育种领域，涉及一种鱼类雌核发育方法。更具体地，涉及一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法及其应用。
背景技术
翘嘴鳜隶属鲈形目，鮨科，鳜属。其肉质细嫩、厚实、少刺，营养丰富，味道鲜美，在我国已经成为经济价值很高、市场需求量很大的名特水产养殖品种之一。然而，我国鳜鱼养殖产量的提高主要是依靠扩大养殖面积，增加养殖密度来实现的，而鳜鱼育苗亲鱼多数采用自繁、自养、自留或从市场购买的活鱼中选留培育。由于养殖群体遗传结构单一，经过长期的近交繁殖后，种质退化现象严重，致使翘嘴鳜生长速度减慢，病害严重，影响翘嘴鳜养殖的经济效益。种质问题己成为当前翘嘴鳜养殖生产的主要问题之一。然而传统的育种模式基因纯合速度慢，育种周期长，不符合翘嘴鳜养殖业发展的迫切需要，因此有必要开展可加速育种进程的人工雌核发育技术研究。
雌核发育是单性生殖的一种，指卵子依靠自身的遗传物质发育成个体的生殖行为。人工雌核发育在鱼类育种中主要应用于两个方面，一是加速鱼类优良基因纯合化，使优良的遗传性状得以迅速固定，从而实现快速育种，缩短育种周期。主要是通过人工雌核发育诱导出具有优良性状的后代后，再进行大规模扩繁，这对雌核发育二倍体孵化率的要求并不高。目前已应用在草鱼优良生长性状品系选育，白鲢抗逆性状品系选育等方面，实践证明一次雌核发育相当于6～8次的近亲交配，可大大提高遗传纯度。连续两代的雌核发育就可以形成基因高度纯合的群体。二是在某些雌雄个体生长差异较大、雌性比雄性生长快的鱼类中，通过人工雌核发育诱导出全雌种苗，直接进行养殖，为提高经济效益需要较高的雌核发育二倍体孵化率，如牙鲆、半滑舌鳎等鱼类的全雌育种。
纵观国内外鱼类人工雌核发育的研究现状，使卵子染色体二倍化的方法最常用的是温度休克法。温度休克法是一种使卵子染色体二倍化的最简便、最有效和最常用的方法，冷休克法是目前最常用的温度休克法。温度休克法诱导卵子染色体二倍体化需要稳定的热源或者冷源。现有热源的获得方式主要有两种，一是通过恒温水浴设备，二是通过热水调节水温；冷源的获得同样有两种方式，一是通过低温恒温设备，二是通过冰块等调节水温。
热休克法相比冷休克法具有以下优势：（1）热源的获得成本要远远低于冷源的获得成本，相比热源获得所需要的恒温水浴设备，低温恒温设备的价格是其的3~5倍；如果不使用专门的设备，而是采用热水或冰块调节水温的话，温度休克时需要大量的热水或者冰块，冰块的获得需要专门的制冰设备或者大量购买，而热水只需要使用常用的加热装置便可获得。（2）热休克法相比冷休克法更易实现应用，不管用上述哪种方式获得热源和冷源，如果不考虑成本，在一些条件便利的地区实现应用的问题不大，而在某些条件简陋、交通不便的地方则难以获得大量的冷源，因此在这些地方热休克法更易实现应用。（3）热休克法比冷休克法处理更为快捷、控制更加容易。热休克法诱导卵子染色体二倍体化只需处理2~3min，而冷休克法诱导鱼类雌核发育处理时间一般需要10~60min。因此在大批量诱导鱼类雌核发育时，热休克法更为快捷。而且由于冷休克法处理的时间更长，维持冷休克所需稳定的处理温度更加困难。
热休克法具有成本低、易于推广应用、处理更为快捷、控制更加容易的优势，但是通过热休克法诱导雌核发育二倍体的方法并不适用于所有鱼类，如大黄鱼、团头鲂以及大部分鲆鲽类均是利用冷休克法诱导人工雌核发育，而热休克法未见报道。
目前，本领域人员公识认为，对翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导均是采用冷休克法。但是，冷休克法诱导鱼类雌核发育的最适温度一般为0℃~4℃，而翘嘴鳜繁殖期主要集中在6月~8月，这时繁殖水温较高，使用冷休克法诱导翘嘴鳜雌核发育二倍体所需最适水温条件在生产中难以获得；并且在冷休克时调节水温需要专门的制冷仪器等，所需成本高，很难在生产实践中大规模推广应用。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有翘嘴鳜传统育种模式基因纯合速度慢、育种周期长以及条件不易控制、难以大规模推广等技术不足，提供一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法。
本发明另一目的是提供上述方法在翘嘴鳜育种方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法，包括如下步骤：
S1.翘嘴鳜精子的遗传失活：取新鲜翘嘴鳜精液，按1：4~1：40的比例经Hanks液稀释后用紫外线照射，紫外线照射剂量为80 mJ/cm2~640 mJ/cm2；
S2.卵子雌核发育的启动：将S1得到的遗传失活的翘嘴鳜精子与翘嘴鳜成熟卵子混合受精；
S3. 卵子单倍体染色体组加倍：卵子经S2步骤受精后，转移到淡水中进行热休克处理，得到二倍体卵；
S4.将S3得到的二倍体卵转入淡水中，室温孵化，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理，得到翘嘴鳜雌核发育二倍体鱼苗；
步骤S3所述热休克处理温度为41℃，热休克处理的起始时间是在卵子受精后2min~10min，热休克持续时间1min~2.5min。
优选地，步骤S1所述经Hanks液稀释是按1：8的比例经Hanks液稀释。
优选地，步骤S1所述紫外线照射剂量为640 mJ/cm2。
优选地，步骤S2所述的混合是在25℃~27℃的温度条件下进行的。
优选地，步骤S3所述热休克的起始时间是在卵子受精后4min。
优选地，步骤S3所述热休克的热休克持续时间2min。
本发明还提供所述翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法在翘嘴鳜育种方面的应用。
人工诱导鱼类雌核发育二倍体需要解决两个问题：（1）使精子染色体遗传物质失活。精子遗传失活的目的是让精子的染色体去除或不参与合子核的形成，又要让精子保持刺激卵子开始胚胎发育的能力；（2）使单倍体卵子染色体组加倍。雌核发育单倍体均能较好地通过胚胎发育，但到孵化期或孵化后数天由于“单倍体综合症”均会陆续死亡。因此，如果要获得成活的雌核发育二倍体，还必须使其染色体加倍。
首先，对于精子染色体遗传物质的失活，如果同源精子灭活不完全，进行雌核发育诱导时，会产生正常的二倍体或是杂交个体，如果不能从形态上将其和雌核发育二倍体个体相区别，则不能证明诱导后的群体是否全部为雌核发育二倍体个体，因而要求灭活用的紫外线照射剂量越大灭活越完全。但是紫外线照射剂量的加大，将会影响精子的受精能力，进而影响孵化率。因此，在筛选灭活条件时，最佳的灭活条件是可以使精子遗传完全失活的最低紫外线照射剂量。不同鱼类间，精子的密度、活力、对紫外线的耐受能力等都存在着巨大差异。本发明通过不断分析总结并结合大量的实验确定了翘嘴鳜精子遗传失活的紫外线照射剂量为80 mJ/cm2~640 mJ/cm2，在所述紫外线照射剂量条件下，就可以完全排除诱变的随机性，既能保证同源精子灭活完全，又能保证一定的孵化率，最佳的紫外线照射剂量为640 mJ/cm2。
另外，要获得较多的纯合二倍体雌核发育个体，一般都要采用人工诱导的方法，即用遗传灭活的精子与正常卵受精后，再阻止第二极体排出使染色体加倍。不同鱼类第二极体的排出时间不同，一般冷水性鱼类较迟，如鲑科鱼类大多在受精后15min~40min。温水性鱼类较早，如水晶彩鲫卵子在受精后4min~5min开始处理最好。鲤在受精后1min~9min处理效果最好。因此，雌核发育人工诱导中染色体加倍的效果受处理起始时间、处理持续时间和处理强度的影响，在每次诱导处理之时，确定最适水温下受精卵排放第二极体时的时间，及时地进行温度休克处理，才能获得最佳的雌核发育二倍体诱导效果，处理起始时间过早或过晚均可导致雌核发育二倍体诱导率过低或雌核发育二倍体诱导失败。同时在采用热休克处理时通常要用亚致死温度才能有效地抑制第二极体的排出，并且，处理时间太短无抑制作用，太长则会对胚体造成较大损伤，导致孵化率下降、畸型率上升而影响整体诱导效果。另外，受精卵发育的速率与当时的水温也有很大关系，不同鱼类耐受水温和对高温耐受时间不同。因此，不同鱼类雌核发育二倍体诱导的休克处理温度、休克处理的起始时间和持续时间均完全不同。
目前，本领域人员公识认为，对翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导均是采用冷休克法。但是，冷休克法诱导鱼类雌核发育的最适温度一般为0℃~4℃，而翘嘴鳜繁殖期主要集中在6月~8月，这时繁殖水温较高，使用冷休克法诱导翘嘴鳜雌核发育二倍体所需最适水温条件在生产中难以获得；并且在冷休克时调节水温需要专门的制冷仪器等，所需成本高，很难在生产实践中大规模推广应用。
为了克服上述翘嘴鳜雌核发育二倍体诱导的技术问题，本发明通过研究首次发现也可以通过热休克法诱导翘嘴鳜雌核发育二倍体。相比于冷休克法而言，热休克法具有成本低、易实现、处理更为快捷、容易控制的优势，适合大范围的推广应用，但是通过热休克法诱导雌核发育二倍体的方法并不适用于所有鱼类，如大黄鱼、团头鲂以及大部分鲆鲽类均是利用冷休克法诱导人工雌核发育。本发明经过反复试验确定了翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导条件为热休克处理温度为41℃，热休克处理起始时间是在卵子受精后2 min~10min，热休克处理持续时间为1~2.5min，在所述热休克处理条件下，可以获得稳定的诱导效果。最佳诱导条件：热休克处理温度为41℃，热休克处理起始时间是在卵子受精后4min，热休克处理持续时间为2min。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次采用热休克法，并结合紫外线照射使精子遗传失活，经过大量实验摸索确定了翘嘴鳜雌核发育二倍体的最佳诱导方法，并且该诱导方法条件易得、成本低、便于控制、育种周期短。同时，本发明方法利用紫外线照射遗传失活的翘嘴鳜精子，启动卵子雌核发育以及染色体加倍的措施，精子失活率100%，再经过热休克法诱导产生的二倍体后代全部为只含有雌性亲本基因的雌核发育二倍体，可加速优良基因纯合化、使优良的遗传性状得以迅速固定，在翘嘴鳜遗传分析和育种上有广阔的应用前景，具备很大的生产实践推广价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备及方法为本技术领域常规试剂、设备及方法。
实施例1 翘嘴鳜精子的遗传物质灭活条件的选择
利用成熟度良好的翘嘴鳜雌鱼和雄鱼各10尾，经人工催产后采集精子和卵子。
取新鲜翘嘴鳜精液500μL，用预冷的Hanks液按1:8比例稀释后，平铺于直径为7cm的预冷培养皿中，设置0、80、160、240、320、400、480、560、640 mJ/cm2等9个不同紫外线强度照射；将处理后的精液立即与3mL翘嘴鳜卵在25℃~27℃水温下人工授精；授精后室温孵化，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理。统计受精率、孵化率和单倍体率，统计结果如表1所示。
表1不同紫外线照射剂量对受精率、孵化率和单倍体诱导率的影响
结果显示，综合考虑受精率、孵化率和单倍体率的情况，翘嘴鳜精液遗传灭活效果紫外线照射剂量为80 mJ/cm2~640 mJ/cm2，最佳的最低紫外照射剂量为640 mJ/cm2，本发明经过重复上万次实验，证明实验效果稳定。
实施例2 热休克最佳起始时间的确定
热休克起始时间设定6个实验组，每个实验组均取由3mL翘嘴鳜卵子，与500μL经过640 mJ/cm2剂量紫外线照射的新鲜翘嘴鳜精液在25℃~27℃水温下人工授精，分别在卵子受精后2min、4min、6min、8min、10min、12min，将卵转入41℃的热水浴中进行处理，处理时间为2min，热休克处理后的卵取出后室温孵化，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理；另外取3mL翘嘴鳜卵子与经过Hanks液稀释的500μL正常精液人工授精作为正常对照组，3mL翘嘴鳜卵子与500μL经过640 mJ/cm2剂量紫外线照射的新鲜翘嘴鳜精液人工授精作为单倍体对照组。统计受精率以及正常二倍体孵化率。统计结果如表2所示。
表2 不同热休克起始时间对受精率和正常二倍体孵化率的影响
结果显示，在卵子受精后2min~10min中均能诱导产生雌核发育二倍体，其中受精后4min的正常二倍体孵化率最高。
实施例3 热休克处理持续时间和最佳处理温度的选择
设定2个正交实验组，每个实验组均取3mL翘嘴鳜卵子，与500μL经过640 mJ/cm2剂量紫外线照射的新鲜翘嘴鳜精液在25℃~27℃水温下人工授精，实验组1在卵子受精4min后，将卵转入41℃的热水浴中处理2min，实验组2在卵子受精4min后，将卵转入40℃的热水浴中处理3min，热休克处理后的卵取出后室温孵化，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理；另外取3mL翘嘴鳜卵子与经过Hanks液稀释的500μL正常精液人工授精作为正常对照组，3mL翘嘴鳜卵子与500μL经过640 mJ/cm2剂量紫外线照射的新鲜翘嘴鳜精液人工授精作为单倍体对照组。统计受精率以及正常二倍体孵化率，统计结果如表3所示。
表3 不同热休克处理持续时间及处理温度对受精率和正常二倍体孵化率的影响
结果显示，能诱导产生雌核发育二倍体的最佳条件为在卵子受精4min后，41℃热休克处理2min。
Claims (7)
1.一种翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.翘嘴鳜精子的遗传失活：取新鲜翘嘴鳜精液，按1：4~1：40的比例经Hanks液稀释后用紫外线照射，紫外线照射剂量为80 mJ/cm2~640 mJ/cm2；
S2.卵子雌核发育的启动：将S1得到的遗传失活的翘嘴鳜精子与翘嘴鳜成熟卵子混合受精；
S3.卵子单倍体染色体组加倍：卵子经S2步骤受精后，转移到淡水中进行热休克处理，得到二倍体卵；
S4.将S3所得到的二倍体卵转入淡水中，室温孵化，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理，得到翘嘴鳜雌核发育二倍体鱼苗；
步骤S3所述热休克处理的温度为41℃，热休克处理的起始时间是在卵子受精后2min~10min，热休克处理持续时间为1min~2.5min。
2.根据权利要求1所述的翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S1所述经Hanks液稀释是按1：8的比例经Hanks液稀释。
3.根据权利要求1所述的翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S1所述紫外线照射剂量为640 mJ/cm2。
4.根据权利要求1所述的翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S2所述的混合是在25℃~27℃的温度条件下进行的。
5.根据权利要求1所述的翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S3所述热休克处理起始时间是在卵子受精后4min。
6.根据权利要求1所述的翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S3所述热休克处理的持续时间为2min。
7.权利要求1所述翘嘴鳜雌核发育二倍体的诱导方法在翘嘴鳜育种方面的应用。
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