CN101720697A - 雌核发育团头鲂的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雌核发育团头鲂的培育方法，包括以下步骤：首先选育雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼，然后进行人工催产获得翘嘴红鲌精子与团头鲂的成熟卵子，用经紫外线灭活的翘嘴红鲌精子与团头鲂的成熟卵子混合，经3～4min后将被激活的卵子置于0℃～4℃温度条件下冷休克处理20～30min，冷休克处理后的胚胎在23℃～24℃水温下孵化后，经过流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法，获得二倍体雌核发育团头鲂。本发明的雌核发育团头鲂的培育方法具有培育时间短、生长速度快、孵化率高、后代性状优良等优点，其在鱼类遗传育种以及生物进化研究方面具有重要意义。

Description

雌核发育团头鲂的培育方法

技术领域

本发明涉及鱼类的培育方法，尤其涉及一种鲤科鱼类的雌核发育方法。

背景技术

雌核发育技术在鱼类提纯育种、探讨鱼类的性别决定和鱼类单性养殖等方面具有重要的作用。一般人工雌核发育鱼的培育是采用异源精子来激活单倍体卵子的发育，然后卵子经过染色体加倍处理形成主要依靠卵子的遗传物质来发育的二倍体后代。虽然异源精子经过灭活处理，但是异源精子部分遗传物质可以通过“异精效应”整合到卵子的遗传物质之中，从而对雌核发育后代可能产生积极的作用。但是，由于精子的活力、密度、对射线的耐受能力等随种的不同而不同，所以应当选择有效的刺激源、合适的照射源、摸索最佳的照射剂量及争取均匀辐射，以使精子达到完全遗传失活的同时还能让精子具有适当的活力，保证较高的受精率；此外，优化卵子最佳处理起始时间、处理强度、持续时间也成为人工雌核发育鱼制备所需面临的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种培育时间短、生长速度快、孵化率高、后代性状优良的雌核发育团头鲂的培育方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种雌核发育团头鲂的培育方法，包括以下步骤：首先选育雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼，然后进行人工催产获得翘嘴红鲌精子与团头鲂的成熟卵子，用经紫外线灭活的翘嘴红鲌精子与团头鲂的成熟卵子混合，经3～4min后将被激活的团头鲂的成熟卵子置于0℃～4℃温度条件下冷休克处理20～30min，冷休克处理后的胚胎在23℃～24℃水温下孵化后，再经过流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对孵化后实验鱼的生物学特性进行检测，获得二倍体雌核发育团头鲂。

上述雌核发育团头鲂的培育方法中，所述紫外线灭活的具体操作步骤优选为：将所述翘嘴红鲌精子用Hank’s液按6∶1的比例稀释，并以薄层分布在培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰袋的摇床上，并距离10～12cm用紫外灯照射处理，照射过程中实时检测所述翘嘴红鲌精子活性，当60％～70％的翘嘴红鲌精子仍具有较好的游动活力时，停止照射，完成紫外线灭活处理。

上述雌核发育团头鲂的培育方法中，所述紫外灯照射处理的时间优选为30～40min。

上述雌核发育团头鲂的培育方法中，所述选育雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼是指：在繁殖期前挑选体征良好、性成熟特征明显的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼进行专池精养，促进其性腺良好发育；

所述人工催产是指：在繁殖季节，当水温稳定在24℃～25℃后，选取性腺发育良好的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌，注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液催产；先注射雌性团头鲂，其中所述绒毛膜促性腺激素的用量为800～1000IU/kg，所述黄体素释放激素类似物的用量为20～30μg/kg；3～4h后再注射雄性翘嘴红鲌，剂量减半；注射后按1∶(1～1.5)的数量比将雌、雄鱼放入同一圆形产卵池；注射时均采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一针注射法。

上述各技术方案中的团头鲂(Megalobrama amblycephala)属于鲤科、鲌亚科、鲂属中的二倍体鱼(2n＝48)，体高侧扁，尾柄高而短，体型优美，草食性，生长速度快，肉质细嫩、腴美，脂肪丰富。上述各技术方案中的翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis Bleeker)隶属于鲤科、鲌亚科、鲌属中的二倍体鱼(2n＝48)，为大型淡水经济鱼类，生长迅速，耐低氧，适应性与抗病力极强，常年摄食(含严冬季节)，肉质洁白鲜嫩，营养价值高。

与现有技术相比，本发明的优点在于选用翘嘴红鲌精子作为刺激源来人工诱导雌核发育团头鲂，并对精子灭活和卵子染色体加倍技术进行了改进，同时利用流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法来检测实验鱼，最终获得了改良的雌核发育团头鲂，大大缩短了获得纯系团头鲂的育种时间，方便了团头鲂的遗传学研究，对快速选育生长优势和抗逆品种具有重要意义。

本发明方法获得的雌核发育团头鲂在鱼类多倍体育种和生物进化方面也具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中培育的雌核发育二倍体团头鲂的外形照片；

图2为本发明实施例中培育的雌核发育二倍体团头鲂的染色体图(2n＝48)；

图3为本发明实施例中团头鲂的DNA含量图；

图4为本发明实施例中培育的雌核发育团头鲂的DNA含量图。

具体实施方式

实施例：

在繁殖期前2～3个月挑选性成熟特征明显、体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌个体作为亲鱼进行专池精养，合理投喂饲料，促进亲鱼性腺良好发育。

到了繁殖季节，当水温稳定在24℃～25℃后，挑选体征良好、性腺发育良好的上述亲鱼进行人工催产，注射HCG与LRH-A的混合液。先注射雌性团头鲂，其中HCG的用量为800～1000IU/kg、LRH-A的用量为20～30μg/kg，3～4h后再注射雄性翘嘴红鲌，剂量减半；注射后按1∶1.3左右的数量比将雌、雄鱼放入同一圆形产卵池，水面吊一纱窗网片，以检测亲鱼的发情产卵情况；注射时均采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一次性注射的方法，以减少实验操作对亲鱼的损害，提高亲鱼的产后存活率。

当发现亲鱼在产卵池中呈“螺旋状”追逐、纱窗网片上沾有适量卵粒后，开始拉网打捞亲鱼进行检测(注意要用软质网，操作要轻，水中检测)；按一对一配对原则挑选2～3组催产效果良好的亲鱼进行雌核发育团头鲂的诱导培育。首先将挤出的翘嘴红鲌精子用Hank’s液按6∶1的比例稀释，以薄层分布在培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰袋的摇床上，并距离10～12cm用紫外灯照射处理30～40min，视精子活力情况而定。在照射过程中，不时用牙签沾一点精液用水激活后于显微镜下检测其活性，当60％～70％的翘嘴红鲌精子仍具有较好的游动活力的时候，停止照射，马上与团头鲂的成熟卵子混合，并用干净羽毛充分搅拌，再把卵子平铺到盛有清水的培养皿中。3～4min后，将被激活的卵子置于0℃～4℃温度条件下冷休克处理20～30min，冷休克处理后的胚胎在23℃～24℃水温下孵化。

鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育1～2天，待其出现腰点、开始平游、能够主动开口摄食后转入池塘中用适口饵料进行饲养，先用豆浆喂养1～2个星期，再换喂磨碎的常规鱼饲料，直至鱼苗长到能正常摄食；对长成后的实验鱼进行检测、筛分，进而得到雌核发育团头鲂。

本实施例用到的Hank’s液的配方如下：KCL 0.40g、NaCl 8.00g、NaHCO₃ 0.35g、KH₂PO₄0.06g、Na₂HPO₄·7H₂O 0.09g、Na₂HPO₄·12H₂O 0.10g、MgSO₄·7H₂O 0.10g、MgCl₂·6H₂O 0.10g、CaCl₂ 0.14g和葡萄糖(Glucose)1.00g；加蒸馏水配至1L。

孵化期间，统计胚胎的受精率和孵化率。用灭活的翘嘴红鲌精子人工诱导雌核发育团头鲂的过程中，有85％～90％的胚胎能发育到原肠胚，35％～40％的胚胎能发育到脱膜，相比同类杂交试验，其受精率和孵化率得到了显著地提高。

鱼苗饲养三到四个月后，随即抽样、测量分析其生物学性状相关数据，并分别与团头鲂和翘嘴红鲌成体鱼的各项已知数据进行比较，结果如下表1所示：

表1：雌核发育团头鲂、翘嘴红鲌及杂交后代的可数性状比较(单位：片或条)

注：上表中大写的罗马数字代表硬棘条的数目，阿拉伯数字代表鳍条的数目。

上述可数性状相关数据表明：雌核发育团头鲂基本上保留了团头鲂的大部分可数性状特征，而像侧线鳞片数与侧线上鳞片数偏离团头鲂而靠近翘嘴红鲌的特点可能与雌核发育的“异精效应”有关。本实施例培育的雌核发育团头鲂的外形照片如图1所示，由图1可见其外形与团头鲂基本一致，但体背更高。

再用外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对本实施例培育的雌核发育团头鲂的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现用翘嘴红鲌精子诱导的雌核发育团头鲂为二倍体(2n＝48)，其染色体图如图2所示。

同时，以普通团头鲂为参照，用流式细胞仪测定雌核发育团头鲂红细胞中的DNA含量，测定结果分别如图3和图4所示。分析图中数据可知，团头鲂与雌核发育团头鲂的DNA平均含量分别为74.55和70.39，雌核发育团头鲂与对照的普通团头鲂的DNA平均含量比值分别为0.944，该比值与预计的1∶1理论比值间无显著差异。流式细胞DNA含量测定法获得的试验结果与外周血细胞培养的染色体倍性检测方法获得的结果是一致的。

上述实施例中外周血细胞培养的染色体倍性检测方法操作步骤为：1)在超净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成分：84ml RPMI-1640(1640培养液)，15ml小牛血清，2支PHA(植物血凝素)，1ml 0.1％肝素钠，以7.5％NaHCO₃(无菌)或1NHCl调pH至7.2～7.4；2)用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；3)按每10ml培养液中加入约0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃5％的二氧化碳浓度的培养箱中培养68～72h，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；4)终止培养前24h，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05～0.07μg/ml。以上步骤均需无菌操作。

上述实施例中染色体制备步骤为：1)将培养物全部转入洁净的10ml离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清液；2)向离心管中加入低渗液9ml，混匀，低渗25～30min；3)加入1ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心5min，弃上清液；4)加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20min后1000rpm离心5min，弃上清液；5)重复步骤4一次；6)视最后细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1～2ml)后，吸取细胞悬液自20～30cm高处滴片，轻吹散，空气中自然干燥；7)Giemsa染液染色20～40min，细水流冲洗载玻片背面去除染液，气干后镜检、拍照。

上述实施例中流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10～15min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测。

本实施例方法获得的大量雌核发育团头鲂，不仅性状得到进一步改良，而且显著提高了人工雌核发育的成功率，表明翘嘴红鲌精子是进行人工雌核发育的理想材料，在生物进化研究和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。

Claims (4)

1.一种雌核发育团头鲂的培育方法，包括以下步骤：首先选育雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼，然后进行人工催产获得翘嘴红鲌精子与团头鲂的成熟卵子，用经紫外线灭活的翘嘴红鲌精子与团头鲂的成熟卵子混合，经3～4min后将被激活的卵子置于0℃～4℃温度条件下冷休克处理20～30min，冷休克处理后的胚胎在23℃～24℃水温下孵化后，再经过流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对孵化后实验鱼的生物学特性进行检测，获得二倍体雌核发育团头鲂。

2.根据权利要求1所述的雌核发育团头鲂的培育方法，其特征在于，所述紫外线灭活的具体操作步骤为：将所述翘嘴红铂精子用Hank’s液按6∶1的比例稀释，并以薄层分布在培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰袋的摇床上，并距离10～12cm用紫外灯照射处理，照射过程中实时检测所述翘嘴红鲌精子活性，当60％～70％的翘嘴红鲌精子仍具有较好的游动活力时，停止照射，完成紫外线灭活处理。

3.根据权利要求1或2所述的雌核发育团头鲂的培育方法，其特征在于，所述紫外灯照射处理的时间为30～40min。

4.根据权利要求1或2所述的雌核发育团头鲂的培育方法，其特征在于，所述选育雌性团头鲂和雄性翘嘴红铂作为亲鱼是指：在繁殖期前挑选体征良好、性成熟特征明显的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼进行专池精养，促进其性腺良好发育；

所述人工催产是指：在繁殖季节，当水温稳定在24℃～25℃后，选取性腺发育良好的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌，注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液催产；先注射雌性团头鲂，其中所述绒毛膜促性腺激素的用量为800～1000IU/kg，所述黄体素释放激素类似物的用量为20～30μg/kg；3～4h后再注射雄性翘嘴红鲌，剂量减半；注射后按1∶(1～1.5)的数量比将雌、雄鱼放入同一圆形产卵池；注射时均采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一针注射法。

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