CN110074022A - 锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法，大致包括如下步骤：通过人工催产获得团头鲂成熟卵子和锦鲤精液，用18‑20W紫外灯对锦鲤精液进行灭活处理26‑30min后与团头鲂卵子混合，在常温水中进行卵子激活2‑3min，然后在4‑6℃的冷水中进行冷处理20‑22min，再在常温水中进行流水孵化，继续培养，即得到雌核发育的团头鲂。本发明采用锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育成功选育得到雌核发育团头鲂后代，在养殖过程中，生长速度、肉质、抗逆性、耐低氧方面明显强于普通团头鲂，在养殖方面明显具备优势，不仅为改良团头鲂种质资源提供了良好基础，而且在遗传育种和生物进化方面也具有重大的意义。

Description

锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法及其应用

技术领域

本发明属于鱼类种质资源改良领域，尤其涉及一种锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法及其应用。

背景技术

团头鲂(Megalobrama amblycephala)隶属于鲤科，鲌亚科，鲂属，因其体态优美、肉质鲜美、草食性而受广大养殖户喜爱，是淡水鱼混养中主要的经济鱼类，在我国水产养殖中占有非常重要的地位。但是近年来，团头鲂生长速度变慢，肉质变差，此外，团头鲂极不耐低氧，闷热的夏天很容易导致泛塘，造成巨大的经济损失。所以对团头鲂的种质资源改良迫在眉睫。

申请人实验室非常注重雌核发育技术对鱼类种质资源改良方面的研究，在以前的研究中，本实验室研究人员在异源精子刺激的雌核发育子代中发现了来自异源精子的染色体片段，产生了异精“杂交”效应，这种“杂交”效应使其具备父本的一些优良性状，“杂交”优势在养殖过程中表现出来，并且应用在生产实践中。申请人实验室以前用翘嘴红鲌精液刺激团头鲂雌核发育，获得雌核发育团头鲂，但是雌核发育后代中产生了团头鲂与翘嘴红鲌杂交子代，很难从雌核发育后代中区分出来，此外，团头鲂本身不耐低氧，而翘嘴红鲌的耐低氧能力也相对比较差，故而不能很好的改良团头鲂种质资源；并且翘嘴红鲌的性情暴躁，经过催产后，大部分翘嘴红鲌都难以存活，造成相当大的经济损失，这些问题都限制了雌核发育技术在团头鲂中推广使用。

因此，针对改良团头鲂种质资源选择更适合的异源精子供体，并成功选育出生长速度快、耐低氧、肉质鲜美、存活率高的雌核发育团头鲂对遗传育种与生产实践具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法，包括如下步骤：

(1)选育雌性团头鲂和雄性锦鲤作为亲鱼进行精养，然后进行人工催产获得团头鲂成熟卵子和锦鲤精液；

(2)用冷冻培养皿收集所述步骤(1)后得到的锦鲤精液，用Hank’s液进行稀释，得到的稀释精液放置于摇床上进行离心处理，同时用18-20W紫外灯照射进行灭活处理26-30min，紫外灯与摇床的距离为18-20cm；

(3)将所述步骤(2)照射灭活后得到的锦鲤精液与所述步骤(1)后得到的团头鲂成熟卵子混合，平铺于盛有常温水的培养皿中进行卵子激活2-3min，然后把培养皿中的常温水换成4-6℃的冷水进行冷处理20-22min，再把培养皿中的冷水换成常温水进行流水孵化；

(4)待所述步骤(3)流水孵化得到的团头鲂鱼苗出现“腰点”时，把鱼苗转入事先肥化好的水泥池中进行培育，再转入土池继续进行饲养，即得到雌核发育的团头鲂。

雌核发育对精子的要求相对比较高，使用合适的精液作为刺激源，不但可以增加雌核发育后代的产量，而且能够获得优良的性状。锦鲤隶属于鲤科，鲤亚科，鲤属，体型美观，颜色鲜艳，生长速度快，繁殖能力强，抗逆性强，耐低氧，是非常好的景观鱼类。本发明中使用锦鲤精液诱导团头鲂雌核发育具有明显优势，锦鲤耐低氧，生长速度快，抗逆性强，并且精液量大，质量高，精子的活性好，是作为雌核发育精子来源的良好供体。且在本实验室长期的远源杂交实验中，团头鲂与锦鲤杂交不能产生存活的后代，非常容易区分雌核发育后代。以前使用翘嘴红鲌精液(70％精子具有较好活力)刺激团头鲂雌核发育，很容易产生杂交后代，导致雌核发育子代难以辨别，统计发生误差，使用锦鲤精液作为刺激源很好的解决了这个问题。

本实验室使用翘嘴红鲌精液诱导雌核发育团头鲂时，发现催产过的翘嘴红鲌性情暴躁，催产过后，翘嘴红鲌几乎很难存活，造成相当大的经济损失。但是使用锦鲤就能很好的避免这些问题，锦鲤可以持续提供精液，锦鲤性情温和，不会影响锦鲤的存活，避免没有必要的损失。

申请人实验室以前使用锦鲤精液成功刺激草鱼雌核发育，但使用锦鲤精液作为诱导源时，灭活时间短(5-10min)，锦鲤的精液灭活后仍有70％的精子有较好的活力，由于团头鲂与锦鲤的亲缘关系较远且杂交致死，难以高效率地激活团头鲂卵子，导致雌核发育子代孵化率非常低。并且没有对雄性锦鲤进行选择培育，锦鲤精液的质量比较差，使得雌核发育团头鲂孵化率不高。经过反复试验，本发明中采用灭活比较完全的锦鲤精液(使用18-20W紫光灯灭活26-30min，只有20％数量的精子具有微弱的活性，更优选使用220W紫光灯灭活30min)作为刺激源就很好的解决了孵化率的问题，使雌核发育团头鲂的孵化率大大的提高。除此之外，用锦鲤刺激的雌核发育团头鲂更耐低氧，原因是紫外灭活后微弱的锦鲤精液也能够形成异精“杂交”效应。

此外，进行团头鲂雌核发育，为了保证团头鲂卵子的质量，对团头鲂选育和催产的注射剂量最优化是必须的。这些技术方面的改进，对提高雌核发育鱼的存活率，改良种质资源是至关重要的。

上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，所述精养的具体操作包括如下步骤：在繁殖前3-4个月，选择体态优美、无病无伤、性成熟特征明显的雌性团头鲂和雄性锦鲤分池精养，精养期间用精饵喂食，水质保持良好，在繁殖季节前1个月，每隔2天进行流水刺激以促进亲鱼的性腺成熟。

优选的，所述步骤(1)中，所述人工催产的具体操作包括如下步骤：当水温达到20℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A)与绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产，雌性团头鲂注射黄体素释放激素类似物的注射量为10ug/kg，注射绒毛膜促性腺激素的注射量为500IU/kg；雄性锦鲤注射黄体素释放激素类似物的注射量为5ug/kg，注射绒毛膜促性腺激素的注射量为250IU/kg。

本实验室长期进行催产实验，结果表明对母本亲鱼的HCG和LRH-A注射量分别为500IU/kg和10ug/kg，是比较理想的催产剂量，能促使团头鲂正常产卵，获得质量非常好的团头鲂卵子，使得雌核发育子代有更强的特征，雌核发育后代的孵化率也得以大大的提高。以前的发明中对母本亲鱼的(HCG和LRH-A注射量分别为800～1000IU/kg和20～30ug/kg)催产剂量不确定，并且剂量偏高，由于强行催产，导致鱼的卵子质量非常差，有时剂量偏高还会起抑制作用，母本亲鱼不能正常的产卵，使雌核发育技术在团头鲂中的推广受到限制。

优选的，所述步骤(2)中，所述Hank’s液包括以下质量份的各组分：KCL 0.4份，NaCL 8份，NaHCO₂ 0.35份，KH₂PO₄ 0.06份，Na₂HPO₄·7H₂O 0.09份，Na₂HPO₄·12H₂O 0.1份，MgSO₄·7H₂O 0.1份，MgCL·6H₂O 0.1份，CaCl₂ 0.14份，葡萄糖1份，最后加去离子水至1000份；所述Hank’s液与精液按体积比5︰1进行稀释。

优选的，所述步骤(2)中，冷冻培养皿的温度为4℃，所述摇床的转数为80-85r/min。

优选的，所述步骤(2)中，进行灭活处理时使用光学显微镜观察精子的活力，每隔5min观察一次，待只有20％数量的精子有微弱的活力的时候停止照射，照射好的精液在4℃环境下保存。

优选的，所述步骤(3)中，常温水的温度为24℃。

优选的，所述步骤(4)中，所述水泥池的肥化过程具体包括如下步骤：在水泥池中加入1/4体积的井水，然后加入土池中的淤泥，再辅以豆浆进行肥化至少3天。

优选的，所述步骤(4)中，所述鱼苗在水泥池中进行培育的时间为90-95天。

基于一个总的技术构思，本发明还提供上述的方法用于培育耐低氧团头鲂的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的方法，采用锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育成功选育得到雌核发育团头鲂后代，在养殖过程中，生长速度、肉质、抗逆性、耐低氧方面明显强于普通团头鲂，在养殖方面明显具备优势，不仅为改良团头鲂种质资源提供了良好基础，而且在遗传育种和生物进化方面也具有重大的意义。

2、本发明选用比较容易获得的鲤科鱼类作为精子源，其自身耐低氧，生长速度快，抗逆性强，并且精液量大，质量高，精子的活性好，是作为雌核发育精子来源的良好供体；由于团头鲂与锦鲤杂交不能产生存活的后代，非常容易区分雌核发育后代；由于锦鲤可以持续提供精液，锦鲤性情温和，不会影响锦鲤的存活，避免没有必要的损失；由于锦鲤精子活性较好，在紫外灭活处理时，轻易就能观察到精子运动能力明显减弱，很容易判断精子的灭活程度，因此在使用锦鲤精子激活团头鲂卵子进行雌核发育时效率非常高，并且在雌核发育团头鲂中形成异精“杂交”效应。

3、本发明中得到的雌核发育后代，还可以进一步通过性反转技术，把雌核发育团头鲂变成生理雄性的个体，性成熟后再与雌核发育团头鲂进行交配，获得大量优良性状的单性团头鲂进行养殖，具有良好的市场前景和经济价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为普通团头鲂外形图；

图2为雌核发育团头鲂外形图；

图3为普通团头鲂染色体中期图；

图4为雌核发育团头鲂染色体中期图；

图5为普通团头鲂流式图；

图6为雌核发育团头鲂流式图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种本发明的锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法，包括如下步骤：

(1)亲鱼的选择与培育：在繁殖前3个月，选择体态优美，无病无伤，性成熟特征明显的雄性锦鲤和雌性团头鲂作为亲鱼分池进行精养，在精养的这段时间，精饵喂食，水质保持良好；在繁殖季节前1个月，每隔2天进行流水刺激，用来促进亲鱼的性腺成熟；

(2)人工催产：在当年的5月初到5月底，当水温达到20℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A)与绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产，所述LRH-A的用量为10ug/kg，HCG的用量为500IU/kg；父母本亲鱼同时注射，父本亲鱼剂量减半；注射时，特别要小心，从胸鳍基部无鳞处进行注射，尽量减少对亲鱼的伤害；

(3)锦鲤精液收集与灭活：时刻观察、记录催产的鱼，当观察到团头鲂在产卵池中快速追逐，且事先挂好的纱窗网中有少量卵粒时，用软质网开始打捞(动作要轻，在水中进行检测)，选择催产良好的亲本进行雌核发育实验；首先，用干净，冰冷的培养皿小心收集精液，并稀释精液，精液与Hank’s按1:5体积比进行稀释，然后平铺于培养皿，形成薄薄的一层，在放置于80r/min的摇床上进行紫外照射，使用20W的紫外灯进行照射，紫外灯与摇床的距离为20cm，照射30min，用于灭活精子；使用显微镜观察精子活性，每隔5min观察一次，当在显微镜下观察到精子的运动能力明显减弱，且只有20％左右的精子仍保持活性的时候，停止紫外照射，并把照射好的精液保存到4℃的黑色玻璃管中；

Hank’s液包括以下质量份的各组分：KCL 0.40g，NaCL 8.00g，NaHCO₂ 0.35g，KH₂PO₄ 0.06g，Na₂HPO₄·7H₂O 0.09g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.10g，MgSO₄·7H₂O 0.10g，MgCL·6H₂O 0.10g，CaCl₂ 0.14g，葡萄糖1.00g，最后加去离子水至1L；

(4)卵子激活与冷处理：然后把团头鲂卵子挤入干净的瓷盆中，加入照射好的精液，使用羽毛混合均匀，再平铺于盛有24℃左右常温水的培养皿中，在常温水中激活3min，再把培养皿中的水倒掉，换上5℃的冷水进行冷处理，冷处理21min，倒掉培养皿中的冷水，再换成常温水放入流水系统进行流水孵化；流水系统水温控制在24℃左右，每天看守；

(5)饲养：鱼苗全部孵化后，转移到白色瓷盆，待鱼苗出现“腰点”后，再把鱼苗转移至事先肥化好的水泥池中进行培育，在水泥池前期饲养90天左右后，转入土池继续进行饲养，就得到了雌核发育团头鲂；

水泥池的肥化过程具体包括如下步骤：在水泥池中加入1/4体积的井水，然后少许加入土池中的淤泥，在80m²的水泥池中，每天有专门的养殖人员取1L新鲜的豆浆沿着水泥池璧慢慢的浇洒一圈，每天早、中、晚三次，豆浆连续进行肥化3天；在肥化过程中，我们时刻关注水质还有水中的微生物生长，当水质良好，水体中微生物丰富时，把出现“腰点”的鱼苗转入水泥池中。

孵化期间，我们也对雌核发育团头鲂的受精率和孵化率进行了统计，雌核发育团头鲂的受精率和孵化率分别为80％左右和30％左右，相对来说，采用锦鲤刺激的雌核发育团头鲂有相对比较高的受精率和孵化率。

鱼苗饲养三个月左右后，我们检测了雌核发育团头鲂的可数性状，并与普通团头鲂进行了比较，如下表1。

表1.雌核发育团头鲂与普通团头鲂可数性状比较

注：上表中大写的罗马数字代表硬棘条的数目，阿拉伯数字代表鳍条的数目。

从表1检测的可数性状可知，雌核发育团头鲂与普通团头鲂在可数性状上基本一致，但是在体背和体宽等有些许差别，雌核发育团头鲂体背更高，体宽上稍宽(普通团头鲂见图1，雌核发育团头鲂见图2)。

我们把普通团头鲂和雌核发育团头鲂分别养殖在相同的条件下，随机称量了三个月的雌核发育团头鲂的体重与普通团头鲂的体重，并进行了比较，结果如表2所示。

表2.雌核发育团头鲂与普通团头鲂平均体重比较(g)

从表2可知，雌核发育团头鲂在生长速度方面，明显快于普通团头鲂，造成这种差别的原因有可能是锦鲤的DNA片段整合到了雌核发育团头鲂的基因组中，产生了“杂交”效应。

在养殖过程中，普通团头鲂与雌核发育团头鲂养殖在相同的环境下，九月的天气闷热时，经常可以观察到普通团头鲂出现缺氧的情况，但是雌核发育团头鲂很少观察到缺氧的情况，从养殖经验中，我们知道雌核发育团头鲂比普通团头鲂更耐低氧。雌核发育团头鲂更耐低氧的原因可能是锦鲤精子的DNA片段渗入雌核发育团头鲂的基因组中，形成了“杂交”效应，展现出杂交优势。

我们使用分子标记的方法对雌核发育团头鲂进行了检测，在雌核发育团头鲂中发现了锦鲤精子的DNA片段，说明这些DNA片段在雌核发育团头鲂中产生了“杂交”效应。进一步证明了本发明使用20W紫光灯灭活30min，并控制20％数量的精子具有微弱的活性，该活性程度不仅能够提高雌核发育团头鲂的孵化率，而且刚好能够形成异精“杂交”效应。

采用尾鳍细胞培养法培养尾鳍细胞制备染色体检测倍性，检测发现雌核发育团头鲂染色体数目与普通团头鲂相同，都是二倍体2n＝48。图3、图4显示的分别是普通团头鲂和雌核发育团头鲂的中期染色体图。

同时，我们用普通团头鲂作为参照，用流式细胞仪检测了雌核发育团头鲂的DNA含量，图5、图6分别为普通团头鲂与雌核发育团头鲂的流式图。普通团头鲂、雌核发育团头鲂的DNA平均含量分别为70.03、70.46，普通团头鲂与雌核发育团头鲂的DNA平均含量的比值为1，与预期的比值1︰1没有差异，符合尾鳍细胞培养法检测的倍性结果，证明雌核发育团头鲂是二倍体2n＝48，雌核发育团头鲂的主要遗传物质来源于团头鲂。

用尾鳍细胞培养法对三月龄的雌核发育团头鲂尾鳍细胞进行培养制备染色体，用于鉴定倍性。尾鳍细胞培养方法如下：

剪刀、镊子预先在180℃烘箱消毒、灭菌，用络合碘在鱼的尾部擦拭几遍，然后用剪刀剪取部分尾鳍，放入2.0ml经过120℃蒸汽灭菌的EP管中，接着用75％的酒精反复清洗两次，清洗干净之后再转移到新的已灭菌的2.0ml EP管中，再用含双抗的PBS试剂清洗8次，800rpm离心3min，同时在细胞培养皿上铺撒0.3％的明胶，等待30min，使尾鳍细胞尽量剪碎，然后800rpm/3min再离心2次，加入血清轻轻进行吹打，等待明胶固定之后，将尾鳍细胞铺洒在上面，放置在28℃的细胞培养箱进行培养，培养两小时后，观察尾鳍细胞贴壁的情况，再加入1.5ml培养基。培养1天后，对细胞贴壁生长情况进行观察。当细胞分裂旺盛，生长状态好，且密度在70～80％时，在细胞培养基中按1:200加入20ug/ml秋水仙素至终浓度为0.1ug/ml；把培养皿取出后，用0.25％胰酶使尾鳍细胞消化成单细胞悬液；然后再将细胞悬液转移至15ml离心管，1500r/min离心10min，弃上清。把4mL事先预热至37℃的0.0375％KCL低渗液加入到获取的细胞沉淀中，用滴管吹打成单细胞悬液，28℃水浴低渗处理15～20min；事先准备好的10ml固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)，放置于4℃冰箱进行预冷；把1ml预冷的固定液加入到低渗的离心管中，轻轻吹打混匀后，1500r/min离心5min；弃掉上清，加入4ml预冷的固定液，再轻轻吹打成单细胞悬液，放于4℃冰箱固定30min以上；重复固定2次；弃上清，加入0.5mL固定液重悬细胞；取一事先放置于-20℃冰箱的干净冰冻载玻片，用移液枪吸取细胞悬液到冰冻玻片的上方50cm处进行滴片，将玻片水平放置；再把玻片放在酒精灯上进行烘干、固定，现配10ml Giemsa染液；染色15～20min；自来水缓慢冲洗干净，再用蒸馏水冲洗5s，观察拍照。中期染色体(见图4)。

流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；加DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测。

实施例2：

一种本发明的锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法，包括如下步骤：

(1)亲鱼的选择与培育：在繁殖前4个月，选择体态优美，无病无伤，性成熟特征明显的雄性锦鲤和雌性团头鲂作为亲鱼分池进行精养，在精养的这段时间，精饵喂食，水质保持良好；在繁殖季节前1个月，每隔2天进行流水刺激，用来促进亲鱼的性腺成熟；

(2)人工催产：在当年的5月初到5月底，当水温达到20℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A)与绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产，所述LRH-A的用量为10ug/kg，HCG的用量为500IU/kg；父母本亲鱼同时注射，父本亲鱼剂量减半；注射时，特别要小心，从胸鳍基部无鳞处进行注射，尽量减少对亲鱼的伤害；

(3)锦鲤精液收集与灭活：时刻观察、记录催产的鱼，当观察到团头鲂在产卵池中快速追逐，且事先挂好的纱窗网中有少量卵粒时，用软质网开始打捞(动作要轻，在水中进行检测)，选择催产良好的亲本进行雌核发育实验；首先，用干净，冰冷的培养皿小心收集精液，并稀释精液，精液与Hank’s按1:5体积比进行稀释，然后平铺于培养皿，形成薄薄的一层，在放置于85r/min的摇床上进行紫外照射，使用18W的紫外灯进行照射，紫外灯与摇床的距离为18cm，照射26min，用于灭活精子；使用显微镜观察精子活性，每隔5min观察一次，当在显微镜下观察到精子的运动能力明显减弱，且只有20％左右的精子仍保持活性的时候，停止紫外照射，并把照射好的精液保存到4℃的黑色玻璃管中；

Hank’s液包括以下质量份的各组分：KCL 0.40g，NaCL 8.00g，NaHCO₂ 0.35g，KH₂PO₄ 0.06g，Na₂HPO₄·7H₂O 0.09g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.10g，MgSO₄·7H₂O 0.10g，MgCL·6H₂O 0.10g，CaCl₂ 0.14g，葡萄糖1.00g，最后加去离子水至1L；

(4)卵子激活与冷处理：然后把团头鲂卵子挤入干净的瓷盆中，加入照射好的精液，使用羽毛混合均匀，再平铺于盛有24℃左右常温水的培养皿中，在常温水中激活2min，再把培养皿中的水倒掉，换上4℃的冷水进行冷处理，冷处理20min，倒掉培养皿中的冷水，再换成常温水放入流水系统进行流水孵化；流水系统水温控制在24℃左右，每天看守；

(5)饲养：鱼苗全部孵化后，转移到白色瓷盆，待鱼苗出现“腰点”后，再把鱼苗转移至事先肥化好的水泥池中进行培育，在水泥池前期饲养95天左右后，转入土池继续进行饲养，就得到了雌核发育团头鲂；

水泥池的肥化过程具体包括如下步骤：在水泥池中加入1/4体积的井水，然后少许加入土池中的淤泥，在80m²的水泥池中，每天有专门的养殖人员取1L新鲜的豆浆沿着水泥池璧慢慢的浇洒一圈，每天早、中、晚三次，豆浆连续进行肥化3天；在肥化过程中，我们时刻关注水质还有水中的微生物生长，当水质良好，水体中微生物丰富时，把出现“腰点”的鱼苗转入水泥池中。

孵化期间，我们也对雌核发育团头鲂的受精率和孵化率进行了统计，雌核发育团头鲂的受精率和孵化率分别为70％左右和22％左右，相对来说，采用锦鲤刺激的雌核发育团头鲂有相对比较高的受精率和孵化率。

实施例3：

一种本发明的锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法，包括如下步骤：

(1)亲鱼的选择与培育：在繁殖前3个月，选择体态优美，无病无伤，性成熟特征明显的雄性锦鲤和雌性团头鲂作为亲鱼分池进行精养，在精养的这段时间，精饵喂食，水质保持良好；在繁殖季节前1个月，每隔2天进行流水刺激，用来促进亲鱼的性腺成熟；

(2)人工催产：在当年的5月初到5月底，当水温达到20℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A)与绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产，所述LRH-A的用量为10ug/kg，HCG的用量为500IU/kg；父母本亲鱼同时注射，父本亲鱼剂量减半；注射时，特别要小心，从胸鳍基部无鳞处进行注射，尽量减少对亲鱼的伤害；

(3)锦鲤精液收集与灭活：时刻观察、记录催产的鱼，当观察到团头鲂在产卵池中快速追逐，且事先挂好的纱窗网中有少量卵粒时，用软质网开始打捞(动作要轻，在水中进行检测)，选择催产良好的亲本进行雌核发育实验；首先，用干净，冰冷的培养皿小心收集精液，并稀释精液，精液与Hank’s按1:5体积比进行稀释，然后平铺于培养皿，形成薄薄的一层，在放置于83r/min的摇床上进行紫外照射，使用19W的紫外灯进行照射，紫外灯与摇床的距离为19cm，照射28min，用于灭活精子；使用显微镜观察精子活性，每隔5min观察一次，当在显微镜下观察到精子的运动能力明显减弱，且只有20％左右的精子仍保持活性的时候，停止紫外照射，并把照射好的精液保存到4℃的黑色玻璃管中；

Hank’s液包括以下质量份的各组分：KCL 0.40g，NaCL 8.00g，NaHCO₂ 0.35g，KH₂PO₄ 0.06g，Na₂HPO₄·7H₂O 0.09g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.10g，MgSO₄·7H₂O 0.10g，MgCL·6H₂O 0.10g，CaCl₂ 0.14g，葡萄糖1.00g，最后加去离子水至1L；

(4)卵子激活与冷处理：然后把团头鲂卵子挤入干净的瓷盆中，加入照射好的精液，使用羽毛混合均匀，再平铺于盛有24℃左右常温水的培养皿中，在常温水中激活3min，再把培养皿中的水倒掉，换上6℃的冷水进行冷处理，冷处理22min，倒掉培养皿中的冷水，再换成常温水放入流水系统进行流水孵化；流水系统水温控制在24℃左右，每天看守；

(5)饲养：鱼苗全部孵化后，转移到白色瓷盆，待鱼苗出现“腰点”后，再把鱼苗转移至事先肥化好的水泥池中进行培育，在水泥池前期饲养90天左右后，转入土池继续进行饲养，就得到了雌核发育团头鲂；

水泥池的肥化过程具体包括如下步骤：在水泥池中加入1/4体积的井水，然后少许加入土池中的淤泥，在80m²的水泥池中，每天有专门的养殖人员取1L新鲜的豆浆沿着水泥池璧慢慢的浇洒一圈，每天早、中、晚三次，豆浆连续进行肥化3天；在肥化过程中，我们时刻关注水质还有水中的微生物生长，当水质良好，水体中微生物丰富时，把出现“腰点”的鱼苗转入水泥池中。

孵化期间，我们也对雌核发育团头鲂的受精率和孵化率进行了统计，雌核发育团头鲂的受精率和孵化率分别为75％左右和28％左右，相对来说，采用锦鲤刺激的雌核发育团头鲂有相对比较高的受精率和孵化率。

本发明主要使用了雌核发育技术，雌核发育技术在遗传育种中使用非常频繁，顾名思义，雌核发育主要是依赖卵子自身的遗传物质发育成个体，所以对鱼的卵子质量要求非常高，特别是团头鲂的卵子，有经验的本领域技术人员都知道，团头鲂的卵子质量最好的状态在鱼体内不会保持太久，最好状态保持在半个小时左右，质量稍差的团头鲂卵子在经过雌核发育的冷处理后就很难获得存活的雌核发育团头鲂。因此，进行雌核发育的卵子存活下来，并且发育成鱼，卵子的质量是非常高的，可想而知，雌核发育团头鲂有形成更强性状的潜力。

我们在实施本发明的时候，选择锦鲤精子作为刺激源，这是非常有意义的，首先，锦鲤自身就具备很多优良性状，如生长速度快，抗逆性强，耐低氧，繁殖能力强，分布广泛，精液产量大、活力强；其次，使用锦鲤精子作为刺激源，在获取精液方面非常方便，并且在使用紫外灯对精子灭活时，非常容易判断灭活的效果；最重要的是，在使用锦鲤精液诱导团头鲂雌核发育的长期研究过程中，我们观察到锦鲤精液不仅能有效的激活团头鲂的卵子，而且有精子的少量DNA片段整合到了雌核发育后代的基因组中，产生了“杂交”效应，并且展现出“杂交”优势，使雌核发育团头鲂在生长速度，耐低氧，抗逆性方面强于普通团头鲂。不仅为改良团头鲂种质资源提供了良好基础，而且在遗传育种和生物进化方面也具有重大的意义。此外，我们在照射精子时，选择了合适的紫外剂量，这对本领域的研究人员是非常有借鉴意义。

在生产上，我们可以进一步结合性反转技术，把雌核发育团头鲂诱导成生理雄性的团头鲂，使其再与雌核发育团头鲂杂交，获得大量具有优势的单性团头鲂后代。可以在许多地方引进具有优势的单性团头鲂进行养殖，既能获得大量的鱼类蛋白质，又能控制过度繁殖的危险，具有良好的市场前景和经济价值。

Claims (10)

1.一种锦鲤精子诱导团头鲂雌核发育的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选育雌性团头鲂和雄性锦鲤作为亲鱼进行精养，然后进行人工催产获得团头鲂成熟卵子和锦鲤精液；

(2)用冷冻培养皿收集所述步骤(1)后得到的锦鲤精液，用Hank’s液进行稀释，得到的稀释精液放置于摇床上进行离心处理，同时用18-20W紫外灯照射进行灭活处理26-30min，紫外灯与摇床的距离为18-20cm；

(3)将所述步骤(2)照射灭活后得到的锦鲤精液与所述步骤(1)后得到的团头鲂成熟卵子混合，平铺于盛有常温水的培养皿中进行卵子激活2-3min，然后把培养皿中的常温水换成4-6℃的冷水进行冷处理20-22min，再把培养皿中的冷水换成常温水进行流水孵化；

(4)待所述步骤(3)流水孵化得到的团头鲂鱼苗出现“腰点”时，把鱼苗转入事先肥化好的水泥池中进行培育，再转入土池继续进行饲养，即得到雌核发育的团头鲂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述精养的具体操作包括如下步骤：在繁殖前3-4个月，选择体态优美、无病无伤、性成熟特征明显的雌性团头鲂和雄性锦鲤分池精养，精养期间用精饵喂食，水质保持良好，在繁殖季节前1个月，每隔2天进行流水刺激以促进亲鱼的性腺成熟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述人工催产的具体操作包括如下步骤：当水温达到20℃以上时，为亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，雌性团头鲂注射黄体素释放激素类似物的注射量为10ug/kg，注射绒毛膜促性腺激素的注射量为500IU/kg；雄性锦鲤注射黄体素释放激素类似物的注射量为5ug/kg，注射绒毛膜促性腺激素的注射量为250IU/kg。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述Hank’s液包括以下质量份的各组分：KCL 0.4份，NaCL 8份，NaHCO₂ 0.35份，KH₂PO₄ 0.06份，Na₂HPO₄·7H₂O 0.09份，Na₂HPO₄·12H₂O 0.1份，MgSO₄·7H₂O 0.1份，MgCL·6H₂O 0.1份，CaCl₂ 0.14份，葡萄糖1份，最后加去离子水至1000份；所述Hank’s液与精液按体积比5︰1进行稀释。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，冷冻培养皿的温度为4℃，所述摇床的转数为80-85r/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，进行灭活处理时使用光学显微镜观察精子的活力，每隔5min观察一次，待只有20％数量的精子有微弱的活力的时候停止照射，照射好的精液在4℃环境下保存。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，常温水的温度为24℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述水泥池的肥化过程具体包括如下步骤：在水泥池中加入1/4体积的井水，然后加入土池中的淤泥，再辅以豆浆进行肥化至少3天。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述鱼苗在水泥池中进行培育的时间为90-95天。

10.一种如权利要求1-9中任一项所述的方法用于培育耐低氧团头鲂的应用。