CN111387097B - 一种雌核发育青鱼的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雌核发育青鱼的培育方法，包括以下步骤：首先挑选性成熟雄性锦鲤和雌性青鱼进行人工催产，然后将经过紫外灭活的锦鲤精子和青鱼的成熟卵子混合，激活卵子，将被激活的卵子置于0～4℃温度条件下冷休克处理12～15min，然后依次置于8～10℃、16～18℃水中各处理1～2min，再将其置于水温为25～28℃的孵化槽中孵化，孵化出的鱼苗转入池塘中进行养殖，经鉴定筛选后，得到二倍体雌核发育青鱼。该方法有效克服了常规方法难以获得可存活雌核发育青鱼的技术障碍，成功获得了雌核发育青鱼群体，填补了青鱼雌核发育技术方面的空白。

Description

一种雌核发育青鱼的培育方法

技术领域

本发明属于鱼类培育技术领域，尤其涉及一种雌核发育青鱼的培育方法。

背景技术

雌核发育是一种重要的遗传育种方法，是快速建立纯合系的有效途径，1～2代雌核发育相当于8～10代传统近亲交配的连续选育。通过基因纯化，携带有害基因的个体在雌核发育过程中被自然淘汰，因此雌核发育后代往往表现出抗病、抗逆能力强、生长速度快等优良性状。

青、草、鲢、鳙是我国传统的“四大家鱼”，长期以来为我国的粮食安全作出了重要贡献，其养殖规模大，产量高，2017年“四大家鱼”总产量达1298.1万吨，占淡水养殖鱼类总产量的51％。因此，其养殖安全在我国水产产业中具有举足轻重的地位。然而，随着我国水产养殖规模的不断扩大，各种水产养殖对象病害频发，据农业农村部渔业渔政管理局和全国水产技术推广总站统计数据，2017年我国水产业由病害导致的经济损失达300多亿元，病害的发生已成为制约我国水产业健康可持续发展重要因素。实施动物疫病净化计划，选育推广抗病新品种，以及推动动物疫病防控从有效控制到逐步净化消灭转变是目前解决上述问题的主要举措。

鱼类是脊椎动物中，物种数量最多的类群，不同鱼类之间生活习性、繁殖特性差异很大。因此，不同鱼类的雌核发育难度不同。在一些鱼类，如鲫鱼中，利用传统雌核发育发育方法，可以较轻松的获得大量雌核发育后代。而青鱼作为我国“四大家鱼”之首，由于其育种周期过长(雌性性成熟需5-7年，雄性性成熟需4-6年)，雌核发育难度大(尚未有雌核发育青鱼成功的报道)，目前全国范围内仍然缺乏抗病能力强的优良品种，因此开发创新育种技术对于青鱼新品种的选育具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种雌核发育青鱼的培育方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种雌核发育青鱼的培育方法，包括以下步骤：首先挑选性成熟雄性锦鲤和雌性青鱼进行人工催产，然后将经过紫外灭活的锦鲤精子和青鱼的成熟卵子混合，激活卵子，将被激活的卵子置于0～4℃温度条件下冷休克处理12～15min，然后依次置于8～10℃、16～18℃水中各处理1～2min，再将其置于水温为25～28℃的孵化槽中孵化，经鉴定筛选后即得到二倍体雌核发育青鱼。

鱼类受精卵在孵化过程中，温度急剧变化会导致其大量死亡。在我们以前的多次试验中，我们将冷休克处理后的被激活卵子直接转入水温为25～28℃水中，未经过梯度升温处理，均没有获得雌核发育青鱼后代，而在冷休克处理后将被激活的卵子进行梯度升温，可以明显提高受精卵的孵化率和后代存活率。

上述的培育方法，优选的，所述雌性青鱼的人工催产具体包括如下步骤：采用二次注射法对雌性青鱼进行人工催产，第一次注射每尾按照5μg/kg的剂量注射黄体素释放激素类似物，10～12h后进行第二次注射，每尾再注射10～12μg/kg黄体素释放激素类似物和5～10mg地欧酮；所述雌性青鱼进行第二次注射时，采用一次注射法对雄性青鱼进行人工催产，每尾按照5-6μg/kg的剂量注射黄体素释放激素类似物；两次注射完毕后按1∶1的数量比将雌、雄青鱼放入同一产卵池中，直至催产完成。

优选的，对于青鱼，在催产前10～15天，每尾按照0.1～0.2μg/kg的剂量注射黄体素释放激素类似物进行催熟。

优选的，所述雄性锦鲤的人工催产具体包括如下步骤：采用一次注射法对所述雄性锦鲤进行人工催产，每尾注射400-500IU/Kg绒毛膜促性腺激素和10-15μg/kg黄体素释放激素类似物；注射后将雄性锦鲤放于不同于雌、雄青鱼的具有流水刺激的产卵池中。

优选的，进行人工催产时维持池塘水温在22～28℃。

优选的，所述青鱼优选六龄以上，无病态、发育良好、性成熟特征明显的个体；所述锦鲤选取两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显的个体；所述青鱼和锦鲤，在人工催产前先放入亲鱼池内人工精养3～4个月。

优选的，所述紫外灭活的锦鲤精子由以下方法得到：在青鱼产卵前1～2h，选择催产效果良好的雄性锦鲤，轻压雄性锦鲤腹部将精子从泄殖腔中挤出，用干燥洁净的容器接取后迅速用4℃预冷的Hank’s液按1:4～6的体积比稀释，然后以薄层形式平铺在4℃预冷的培养皿中，将培养皿置于垫有冰板的摇床上，并用紫外灯照射，直至得到紫外灭活的锦鲤精子。

更优选的，所述紫外灯照射的具体操作包括如下步骤：用2支15W的紫外灯在距离10～12cm处进行照射处理，在照射15min后，每隔1～2min沾取精液涂于载玻片上，用水激活，于显微镜下镜检判断其活性，当90％左右数量的精子游动能力明显减弱时停止照射，得到紫外灭活的锦鲤精子。在雌核发育过程中，精子的灭活程度与雌核发育成功率密切相关。灭活不彻底将产生杂交后代，过度灭活则精子不能激活卵子启动发育。因为不同个体来源的精子可能活力不同，因此灭活时间是不同的。本发明中采用90％左右的精子游动能力明显减弱时作为标准，可提高雌核发育的成功率。

优选的，所述卵子的激活时间为2～3min。

优选的，所述孵化槽中孵化出的鱼苗转入池塘中进行养殖，然后采用流式细胞DNA含量检测法和外周血细胞染色体检测法进行鉴定筛选，可在不处死样本的前提下准确获得其DNA含量和染色体数目。

青鱼的育种周期长(其性成熟一般需要5～7年)，催产过程繁琐(需采用2-3次注射的方法)，青鱼亲本在养殖过程中，必须摄食充足的螺丝、蚌壳等天然饵料才能保证性腺发育良好，人工繁殖难度相对较大。而目前有关青鱼育种的研究较少，其人工雌核发育研究更是未有报道。我们在研究中发现，青鱼受精卵在孵化过程中，对温度变化较为敏感。采用传统的雌核发育方法来研制雌核发育青鱼，即冷休克处理后将受精卵直接转入孵化池中进行孵化，在多次试验中后代存活率均为0，很难获得雌核发育青鱼后代。利用本发明中的提供的梯度升温方法，使青鱼受精卵在冷休克处理后，从0～4℃的环境下，逐步升温至25～28℃的孵化温度，可以减少温度急剧升高对受精卵的损伤，从而突破了青鱼人工雌核发育技术瓶颈，成功获得了雌核发育发育青鱼后代。同时，在后续的多次重复试验中，该方法的有效性均得到了验证。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的培育方法，采用雄性锦鲤精子作为刺激源，使青鱼受精卵在冷休克处理后，从0～4℃的环境下，逐步升温至25～28℃的孵化温度，结合这样的梯度升温方法，可以减少温度急剧升高对受精卵的损伤，提高受精卵的孵化率和后代存活率，从而有效克服了常规方法难以获得可存活雌核发育青鱼的技术障碍，成功获得了雌核发育青鱼群体，填补了青鱼雌核发育技术方面的空白。

2、本发明的培育方法，在异源精子的选择方面，采用与青鱼杂交不能形成可存活后代的锦鲤精子，经过遗传灭活后来刺激青鱼卵子发育，杜绝了因异源精子灭活不彻底导致雌核发育后代中可能存在的杂交后代的出现，大大简化了雌核发育后代的检测难度。

3、本发明的培育方法，在母本青鱼人工催产过程中，同时对同种的雄性青鱼进行人工催产，利用其来对雌性进行刺激，促进了雌性青鱼的发情及产卵，提高了卵子质量，为后续雌核发育青鱼的成功获得提供了重要保障。

4、本发明的培育方法，获得的雌核发育青鱼具有性状优良、成活率高、遗传稳定等特点，为后续青鱼优良品种的选育提供了重要的种质资源；利用性状优良的雌核发育青鱼进行二次雌核发育有望获得具有多种优良性状的雌核发育青鱼品系，进而研制抗病优良品种，这在水产养殖上具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中雌核发育青鱼外形照片；

图2为本发明中普通青鱼DNA含量图；

图3为本发明中雌核发育青鱼DNA含量图；

图4为本发明中雌核发育青鱼细胞染色体中期分裂相图片(2n＝48)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一种本发明的雌核发育青鱼的培育方法，包括如下步骤：

1、人工催产：在每年1～2月份，分别挑选六龄以上，无病态、发育良好、性成熟特征明显的青鱼，两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显雄性锦鲤放入亲鱼池内人工精养，对青鱼精养池每天投喂的螺、蚬等天然饵料的比例不低于饵料总量的70％；在5月中下旬，当池塘水温稳定在22～28℃之间时，对青鱼和锦鲤进行人工催产；在催产前10～15天，每尾青鱼按照0.1μg/kg的剂量注射黄体素释放激素类似物(LRH-A₂)进行催熟；催产时，雌性青鱼采用二次注射法，第一次注射按照每尾5μg/kg的剂量注射LRH-A₂，10-12h后，每尾注射10μg/kg的LRH-A₂和8mg地欧酮(DOM)；雄性青鱼采用一次注射法，在雌性青鱼进行第二次注射时按照每尾5μg/kg的剂量注射LRH-A₂进行催产；雄性锦鲤同样采用一次注射法，在雌性青鱼第一次注射时，注射绒毛膜促性腺激素(HCG)和LRH-A₂进行人工催产，HCG的用量为500IU/Kg，LRH-A₂用量为10μg/kg；注射后按1∶1的数量比将雌、雄青鱼放入有流水刺激的同一产卵池中待产，雄性锦鲤放于另一有流水刺激的产卵池中。

2、精子灭活：在预计青鱼产卵前的1～2h，开始取锦鲤精子进行紫外灭活处理；选择催产效果良好的雄性锦鲤，轻压腹部将精子从泄殖腔中挤出，用干燥洁净的50ml锥底离心管接取后迅速用4℃预冷的Hank’s液按1:4的体积比稀释，然后以薄层形式平铺在4℃预冷的培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰板的摇床上，并用紫外灯在距离10cm处进行照射处理；在照射15min后，每隔1min沾取少量精液涂于载玻片上，用水激活，于显微镜下镜检判断其活性，当90％左右的精子游动能力明显减弱时停止照射，得到紫外灭活的锦鲤精子，收集后置于4℃环境下，避光保存，等待青鱼产卵。

3、受精：当雌、雄青鱼开始追逐，尾部露出水面拍打时，拉网检查青鱼产卵情况，挑选产卵顺畅、卵子质量高的母本亲鱼，将卵子挤入干燥、洁净的瓷盆中，立即加入适量遗传灭活的锦鲤精子，用干净的羽毛迅速搅拌均匀后，加入适量常温水后，继续搅拌2～3min激活卵子启动发育。

4、冷休克处理：卵子激活后，用滤网迅速将其捞出后，置于预先调好的0～4℃冷水中冷休克处理12～15min，然后依次置于8～10℃，16～18℃水中各处理1min，再将其置于孵化槽中，25～28℃水温下流水孵化；同时设置对比试验，在冷休克处理后，直接将受精卵置于25～28℃水温下流水孵化，试验结果见表1所示。

表1：不同处理方法对雌核发育发育青鱼的效果

5、饲养：雌核发育青鱼鱼苗孵出后，待鱼苗出现腰点、开始平游后将鱼苗从孵化槽中转入预先培肥的池塘中饲养，每天泼洒豆浆，2～3次/天，沿池泼洒，直至鱼苗长成。

6、检测：当雌核发育青鱼长至4～5月龄时，对其外形进行检测(雌核发育青鱼的外形如图1所示)，并采用DNA含量检测方法和染色体数量检测方法进行倍性检测，筛选出二倍体雌核发育青鱼。

随机选取15尾4～5月龄的雌核发育青鱼，对它们的外部形态特征进行检测，包括背鳍条、臀鳍条、侧线鳞、侧线上鳞和侧线下鳞，并与文献中已有的青鱼外形数据进行比对，结果如下表2所示。

表2：雌核发育青鱼与普通青鱼可数性状比较

结果显示，雌核发育青鱼后代在侧线鳞、侧线上鳞、侧线下鳞和臀鳍条这些可数性状上变异幅度更小，表明其遗传稳定，纯合度较高，性状优良。

同时，以普通青鱼为为参照，利用流式细胞仪对雌核发育青鱼后代红细胞中的DNA含量进行了测定。流式细胞DNA含量测定法的大体步骤为：用经肝素钠润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.1mL，取10ul注入装有0.49mL0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入0.5mLDNA染色液(DAPI，德国PartecGmbH提供)静置于暗处染色样品约5～10min；样品经过20μm尼龙滤器(德国PartecGmbH提供)过滤后上机检测。测定结果分别如图2、图3所示。据图中数据分析显示，普通青鱼DNA平均发光值为6465.69，对照雌核发育青鱼DNA平均发光值为6417.92，两者DNA平均发光值比值为1:1.01，表明两者DNA含量无显著差别，从而可初步判断雌核发育青鱼与普通青鱼一样为二倍体鱼。

最后，通过鱼类外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对二倍体雌核发育青鱼的染色体数目进行鉴定。外周血细胞培养的染色体倍性检测方法操作步骤为：1)在超净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成分：84mlRPMI-1640、15ml小牛血清、2支PHA、1ml0.1％肝素钠、以7.5％NaHCO₃(无菌)或1NHCl调pH至7.2～7.4；2)用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，用于碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；3)按每10ml培养液中加入约0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养68h～72h，培养期间定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；4)终止培养前3h，在培养液中加入10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05μg/ml～0.07μg/ml，以上步骤均需无菌操作；5)将培养物全部转入洁净的10ml离心管中，以1500rpm离心5min，弃上清液；6)向离心管中加入10ml低渗液，混匀，低渗25min～30min；7)加入1ml固定液，轻轻混匀后1500rpm离心5min，弃上清液；8)加入5ml固定液，轻轻混匀，静置30min后1500rpm离心5min，弃上清液；9)重复步骤8一次；10)视最后细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1ml～2ml)后，吸取细胞悬液自20cm～30cm高处滴片，轻吹散，空气中自然干燥；11)Giemsa染液染色50min～60min，细水流冲洗载玻片背面去除染液，气干后镜检、拍照。用上述实验方法得到的结果如图4所示，雌核发育青鱼的染色体数目为48，证明其是二倍体(2n＝48)。

综上，DNA含量检测与外周血细胞培养染色体倍性检测方法均显示本发明培育得到的后代为二倍体雌核发育青鱼。

Claims (4)

1.一种雌核发育青鱼的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：首先挑选性成熟雄性锦鲤和雌性青鱼进行人工催产，然后将经过紫外灭活的锦鲤精子和青鱼的成熟卵子混合，激活卵子，将被激活的卵子置于0~4℃温度条件下冷休克处理12~15min，然后依次置于8~10℃、16~18℃水中各处理1~2min，再将其置于水温为25~28℃的孵化槽中孵化，经鉴定筛选后即得到二倍体雌核发育青鱼；

所述雌性青鱼的人工催产具体包括如下步骤：采用二次注射法对雌性青鱼进行人工催产，第一次注射每尾按照5µg/kg的剂量注射黄体素释放激素类似物，10~12h后进行第二次注射，每尾再注射10~12µg/kg黄体素释放激素类似物和5~10mg地欧酮；所述雌性青鱼进行第二次注射时，采用一次注射法对雄性青鱼进行人工催产，每尾按照5-6µg/kg的剂量注射黄体素释放激素类似物；两次注射完毕后按1∶1的数量比将雌、雄青鱼放入同一产卵池中，直至催产完成；对于青鱼，在催产前10~15天，每尾按照0.1~0.2µg/kg的剂量注射黄体素释放激素类似物进行催熟；

所述雄性锦鲤的人工催产具体包括如下步骤：采用一次注射法对所述雄性锦鲤进行人工催产，每尾注射400-500IU/Kg绒毛膜促性腺激素和10-15µg/kg黄体素释放激素类似物；

所述紫外灭活的锦鲤精子由以下方法得到：轻压雄性锦鲤腹部将精子从泄殖腔中挤出，用干燥洁净的容器接取后迅速用4℃预冷的Hank’s液按1:4~6的体积比稀释，然后以薄层形式平铺在4℃预冷的培养皿中，将培养皿置于垫有冰板的摇床上，并用紫外灯照射，直至得到紫外灭活的锦鲤精子；所述紫外灯照射的具体操作包括如下步骤：用2支15W的紫外灯在距离10~12cm处进行照射处理，在照射15min后，每隔1~2min沾取精液涂于载玻片上，用水激活，于显微镜下镜检判断其活性，当90%数量的精子游动能力明显减弱时停止照射，得到紫外灭活的锦鲤精子。

2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，进行人工催产时维持池塘水温在22~28℃。

3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述卵子的激活时间为2~3min。

4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述孵化槽中孵化出的鱼苗转入池塘中进行养殖，然后采用流式细胞DNA含量检测法和外周血细胞染色体检测法进行鉴定筛选。

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