CN107318719B - 锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法及雌核发育草鱼的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法及雌核发育草鱼的应用。该方法包括如下步骤：(1)将锦鲤精液用Hank’s液稀释，平铺于培养皿中放在摇床上进行离心，同时用紫外灯照射灭活；(2)与成熟的草鱼头等卵子混合，搅拌后立刻放入常温水中进行受精，将得到的受精卵放入冷水中进行冷处理；(3)转入常温的水中进行正常孵化，再转入水泥槽中进行孵化，得到的有眼脸的鱼苗放到预先培肥的水泥槽中进行饲养。本发明的方法，利用锦鲤特有的精子及方法上的创新，可以显著提高人工诱导雌核发育草鱼生产效率，大规模批量创制出存活率高、生长速度快和抗病性强的雌核发育草鱼，为大量研制抗病草鱼提供了充足的重要种质资源。
Description
技术领域
本发明属于鱼类品种改良领域，尤其涉及一种锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法及雌核发育草鱼的应用。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)因其草食性、生长快、肉质鲜美等优点，是优良的淡水鱼类，也是我国目前产量最高的经济鱼类，在我国水产养殖中占有非常重要的地位。然而，由于草鱼易患烂鳃、水霉病、出血病、苗头蚤、肠炎、肝胆综合症等疾病，造成草鱼存活率较低，严重制约了草鱼养殖业发展。
申请者实验室长期以来开展了鱼类雌核发育研究，发现用异源精子刺激鱼类卵子进行雌核发育，获得的雌核发育后代具有异源精子的染色体片段，这种“杂交”效应，使得雌核发育后代可能继承父本的一些优良性状，表现出“杂交”优势。申请者所在实验室原来用异源四倍体鲫鲤精子刺激草鱼卵子获得了雌核发育草鱼，然而，异源四倍体鲫鲤是人工制备的宝贵四倍体鱼，只有申请者实验室等少数相关单位掌握，其精子来源受到限制，而且其精液量比二倍体锦鲤精液量要少，在作为雌核发育共性技术推广方面受到限制。另外在上述雌核发育技术中，异源四倍体鲫鲤精子灭活所需时间较长(需要20～30分钟)(张虹，2011)，这使得卵子激活时间难以准确把控，存活率不高，因此如何获得广谱性精子来源并适当缩短精子灭活时间长期以来一直是本领域技术人员需要解决的技术难关。
锦鲤(Cyprinuscarpio，2n＝100)属于鲤形目，鲤科，鲤属，两性可育，色彩斑斓，体色鲜艳，有水中“活宝石之称”，是一种漂亮的观赏鱼类。其具有分布广泛、生长快、耐低氧、抗病性强、容易繁殖等优点。锦鲤对水温适应性强，最适温度范围为21～27℃，杂食性，主要以软体动物，水生植物，底栖动物以及细小藻类为主，然而截至目前还没有见用锦鲤精子进行雌核发育草鱼的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，以锦鲤精子作为刺激源，提供一种锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法及雌核发育草鱼的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法，包括如下步骤：
(1)将达到性成熟的锦鲤精液用Hank’s液进行稀释，得到的稀释精液平铺于培养皿中形成薄层，然后将培养皿放在摇床上进行离心处理，同时用紫外灯照射进行灭活处理；
(2)将所述步骤(1)照射灭活后得到的锦鲤精液与成熟的草鱼头等卵子混合，用羽毛充分搅拌后立刻放入常温水中进行受精，将得到的受精卵放入冷水中，用羽毛充分搅起让受精卵与冷水充分接触，进行冷处理；(受精是指草鱼卵子用经过紫外线处理后的灭活精子来受精，冷处理后获得二倍体受精卵)
(3)将所述步骤(2)冷处理后得到的受精卵转入常温的水中进行正常孵化，再转入水泥槽中进行孵化，将孵化后得到的有眼脸的鱼苗放到预先培肥的水泥槽中进行前期饲养，再转入土池进行正常饲养，即得到雌核发育草鱼。
在保证成效的前提下，适当缩短精子灭活时间可以减少操作时间、减少卵子等待精子处理时间、节约成本、减少紫外线对操作人员和精子照射的时间。为了探索一种适度缩短精子灭活时间又能大量获得人工雌核发育后代的方法，我们选用了体色鲜艳，来源广泛，耐低氧和抗病性强的锦鲤的精子作为刺激源，发现利用锦鲤精子作为异源精子可以很好地达到短精子灭活时间(锦鲤精子灭活时间5～10min，现有技术中其它的异源精子灭活时间都在20min以上)(张虹，2011)，达到了减少卵子质量受损、节约成本、减少紫外线对操作人员的辐射和精子照射时间的效果，又达到了最终大规模批量创制出存活率高、生长速度快和抗病强的二倍体雌核发育草鱼的目的，为后续大规模制备抗病草鱼提供了重要的、宝贵的种质资源。
本发明采用锦鲤精子作为刺激源具有明显的优势，其主要表现在如下方面：其一，锦鲤雄性个体精液充足，且容易获得，是一种很好的异源精子源，适合用于进行雌核发育操作；其二，用锦鲤精子作为激活源其照射时间缩短至5～10min，以前有关鱼类雌核发育过程中精子照射时间需要20min以上(张虹，2011)，这一时间上的缩短，对于提高存活率来说，优势非常明显；其三，锦鲤产生的精子数量多，在紫外线灭活过程中，通过显微镜容易判断被照射精子的灭活程度，一般镜检以精子尾部摆动较灭活前有所减弱60～70％精子仍具有较好的活力为准，用之激活草鱼卵子不产生杂交苗的诱导效果非常好；其四，锦鲤的抗性强，用锦鲤精子作为刺激源获得的批量的雌核发育草鱼抗性强，其机理可能是锦鲤的染色体片段进入草鱼中产生了“杂交”效应。
本实验室还进行了长期的远缘杂交试验，结果表明，以草鱼为母本，锦鲤为父本的杂交组合不能获得成活的鱼苗。杂交苗往往在发育过程中保持明显区别于草鱼胚胎的外形，如胚体卵黄囊一直保持圆球形(正常鱼苗卵黄囊随胚体发育拉长)，胚胎不同程度的畸形，发育到出苗期即被淘汰。因此，以锦鲤精子作为刺激源，诱导草鱼的雌核发育，不会产生存活的杂交苗干扰后期的实验统计和观察。另外，用紫外线照射的锦鲤精子激活卵子如果不经过染色体加倍处理的雌核发育胚胎也不能出现成活的鱼苗。所以，经过二倍化处理的试验中有存活的苗出现，则可以判断为雌核发育二倍体草鱼。
上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，Hank’s液包括以下质量份数的各组分：NaCl8～8.2份，KCl 0.4～0.45份，CaCl2 0.14～0.15份，MgSO4·7H2O 0.2～0.25份，Na2HPO4·H2O 0.06～0.065份，KH2PO4 0.06～0.065份，NaHCO3 0.35～0.36份，C6H12O6 1.0～1.5份，MgCl2·6H2O 0.1～0.15份以及水1000份，所述锦鲤精液与Hank’s液的质量比为1:3～1:4。
优选的，所述步骤(1)中，稀释是在0～10℃温度下进行稀释，稀释之后放在垫有冰板的摇床上用紫外灯照射进行灭活处理，控制摇床的转速为90～100r/min，所述灭活处理后得到的锦鲤精液遇水激活观察具有60～70％的精子保持活力。
优选的，所述步骤(1)中，所用紫外灯的功率为19～20瓦，照射进行灭活处理的时间为5～10min，紫外灯与摇床的距离为15～17cm。
优选的，所述步骤(2)中，受精时间为2～3min，冷处理的时间为12～14min，正常孵化时间为4～5min。
优选的，所述步骤(3)中，转入水泥槽中进行孵化的水温为23～27℃，水泥槽中的孵化采用流水孵化，水流大小以草鱼卵子能在水泥槽中随水流翻动为准。
优选的，所述步骤(3)中，前期饲养的时间为90～120天。
优选的，所述步骤(2)和(3)中，常温水的温度为24～25℃，冷水的温度为3.5～4℃。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种由上述方法获得的雌核发育草鱼在研究草鱼性别决定机制领域的应用。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种由上述方法获得的雌核发育草鱼在生产抗病草鱼领域的应用，以所述雌核发育草鱼作为母本与普通雄性草鱼进行交配，得到抗病草鱼后代。
利用锦鲤特有的精子(特点：数量大，来源广泛，易于灭活和抗病性强)及方法上的创新，成功研制出大量雌核发育草鱼的方法，可以显著提高人工诱导雌核发育草鱼生产效率，大规模批量创制出存活率高、生长速度快和抗病性强的雌核发育草鱼，这些优良的雌核发育草鱼的获得，将为研究草鱼性别决定机制、染色体定位、草鱼遗传图谱构建和进化等一些生物学问题提供了重要的实验材料；另一方面，该批量创制的雌核发育草鱼为大量研制抗病草鱼提供了充足的重要种质资源。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法，利用锦鲤特有的精子(特点：数量大，来源广泛，易于灭活和抗病性强)及方法上的创新，成功研制出大量雌核发育草鱼的方法，可以显著提高人工诱导雌核发育草鱼生产效率，大规模批量创制出存活率高、生长速度快和抗病性强的雌核发育草鱼。
2、本发明采用锦鲤精子作为刺激源具有明显的优势，其主要表现在如下方面：其一，锦鲤雄性个体精液充足，且容易获得，是一种很好的异源精子源，适合用于进行雌核发育操作；其二，用锦鲤精子作为激活源其照射时间缩短至5～10min，以前有关鱼类雌核发育过程中精子照射时间需要20min以上(张虹，2011)，这一时间上的缩短，对于提高存活率来说，优势非常明显；其三，锦鲤产生的精子数量多，在紫外线灭活过程中，通过显微镜容易判断被照射精子的灭活程度，一般镜检以精子尾部摆动较灭活前有所减弱60～70％精子仍具有较好的活力为准，用之激活草鱼卵子不产生杂交苗的诱导效果非常好；其四，锦鲤的抗性强，用锦鲤精子作为刺激源获得的批量的雌核发育草鱼抗性强，其机理可能是锦鲤的染色体片段进入草鱼中产生了“杂交”效应。
3、本发明雌核发育后得到的雌核发育草鱼中，具有锦鲤精子中的染色体片段，具有存活率高、生长快、抗病力强等优点，可以作为优质母本与普通雄性草鱼进行交配，大规模生产抗病草鱼，为抗病草鱼的研制提供了新的种质资源，在生产上具有重要的应用价值。
4、本发明雌核发育后得到的雌核发育草鱼，一方面可以为研究草鱼性别决定机制、染色体定位、草鱼遗传图谱构建和进化等一些生物学问题提供了重要的实验材料(雌核发育草鱼比普通草鱼纯合度更高，在染色体和基因水平上，不会有其它更多基因的干扰，对实验结果更准确更可靠)；另一方面，该批量创制的雌核发育草鱼为大量研制抗病草鱼提供了充足的重要种质资源(本发明选育的雌核发育草鱼可以作为优质母本与普通雄性草鱼进行交配，大规模生产抗病草鱼，在生产上具有重要价值)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例中雌核发育草鱼幼苗图。
图2是实施例中普通草鱼幼苗图。
图3是实施例中雌核发育草鱼外形图。
图4是实施例中雌核发育草鱼染色体图。
图5是实施例中雌核发育草鱼流式图。
图6是实施例中雌核发育草鱼血细胞图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
2017年5月，我们采用了锦鲤(2n＝100)精子作为刺激源对草鱼进行人工雌核发育研究，探索出了一种大批量制备雌核发育草鱼的方法。
本实验室还进行了长期的远缘杂交试验，结果表明，以草鱼为母本，锦鲤为父本的杂交组合不能获得成活的鱼苗。杂交苗往往在发育过程中保持明显区别于草鱼胚胎的外形，如胚体卵黄囊一直保持圆球形(正常鱼苗卵黄囊随胚体发育拉长)，胚胎不同程度的畸形，发育到出苗期即被淘汰。因此，以锦鲤精子作为刺激源，诱导草鱼的雌核发育，不会产生存活的杂交苗干扰后期的实验统计和观察。另外，用紫外线照射的锦鲤精子激活卵子如果不经过染色体加倍处理的雌核发育胚胎也不能出现成活的鱼苗。所以，经过二倍化处理的试验中有存活的苗出现，则可以判断为雌核发育二倍体草鱼(如图1)，作为比较，普通草鱼幼苗如图2所示。用锦鲤精子作为刺激源具有明显的优势，其主要表现在如下方面：其一，锦鲤雄性个体精液充足，且容易获得，是一种很好的异源精子源，适合用于进行雌核发育操作；其二，用锦鲤精子作为激活源其照射时间短，5～10min时间就可以照好，以前有关鱼类雌核发育过程中精子照射时间需要20min以上(张虹，2011)，这一时间上的缩短，对于提高存活率来说，优势非常明显(由于草鱼的产卵时间，在很大程度上与水温、天气状况和草鱼自身发育有关，连非常有经验的渔民也不能百分之百的把握草鱼产卵时间，加上经过紫外照射的精子有效时间短，只有2小时左右，如果没有在有效时间内激活，其试验和生产都是失败的)；其三，锦鲤产生的精子数量多，在紫外线灭活过程中，通过显微镜容易判断被照射精子的灭活程度，一般镜检以精子尾部摆动较灭活前有所减弱60～70％精子仍具有较好的活力为准，用之激活草鱼卵子不产生杂交苗的诱导效果非常好；其四，锦鲤的抗性强(我们通过大量试验发现体色为红色的鱼如锦鲤、红鲫都具有较强的抗性，但是红鲫的生产速度比锦鲤慢)，用锦鲤精子作为刺激源获得的批量的雌核发育草鱼抗性强，其机理可能是锦鲤的染色体片段进入草鱼中产生了“杂交”效应。
一种本发明的锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法，包括如下步骤：
(1)锦鲤精子灭活：挤出达到性成熟的锦鲤精液于一次性胶杯中(不要带血液的精液)，按照精液与Hank’s液体1:3的比例在冰上(0～10℃)混合，然后将混合后的液体以薄层的形式平铺于直径17.5cm的培养皿中，然后放在垫有冰板的摇床上(转速为90～100r/min)，并置于2支功率为20瓦的紫外灯(型号：雪莱特Cnlight ZW20S20W-Z589)下，紫外灯与摇床的距离为17cm，照射10min，灭活好的精液收集在黑色的塑料管中，并置于4℃冰箱保存。Hank’s液配方：NaCl 8g，KCl 0.4g，CaCl2 0.14g，MgSO4.7H2O 0.2g，Na2HPO4.H2O 0.06，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，C6H12O6 1.0g，MgCl2.6H2O 0.1g溶解于1000ml纯净水中(不需要灭菌)，配好放4℃冰箱(注意观察，不能产生沉淀)；
(2)卵子激活：将步骤(1)照射灭活后得到的锦鲤精液与成熟的草鱼头等卵子混合，用两根羽毛充分搅拌精液和卵子，立刻放入25℃水温(加热棒保证水温为25℃)受精2min，受精之后逐渐将受精卵捞入到4℃水温中，在4℃水温中用羽毛充分搅起，让受精卵与冷水充分接触，冷处理12～14min；
(3)孵化及其养殖：将所述步骤(2)冷处理后得到的受精卵转到25℃水温(加热棒保证水温为25℃)正常孵化5min，最后转入自制的水泥槽中孵化(注意转入前后水温差在2℃以内)，如果温差过大，采取缓慢加常温水，让其温度相互接近再倒入孵化水槽中孵化，孵化到有眼脸的鱼苗即可下到预先培肥的水泥池中进行前期饲养，3～4个月之后再转入土池饲养。
不同冷处理温度对锦鲤诱导草鱼雌核发育的影响如表1所示，不同照射距离和照射时间对锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的影响如表2所示。
表1：不同冷处理温度对锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的影响
*过原肠率＝过原肠的胚胎数/总卵数×100％
**成活率＝孵化出的正常苗数/总卵数×100％，且不包括畸形苗。
由表1可知，通过该实验参数制备出的雌核发育草鱼除去畸形苗之后的存活率达到了18％，远远高于现有技术中用鲤鱼精子对草鱼进行雌核发育只获得3％的后代(Stanley JG 1976)，进一步体现了本方法的优越性之一在于大幅度的提高了雌核发育草鱼的存活率，通过与未冷处理组比较发现，精确的处理温度是实验成功的一个重要环节。
表2：不同照射距离和照射时间对锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的影响
*成活率＝孵化出的正常苗数/总卵数×100％，且不包括畸形苗。
由表2可知，用15-17厘米的照射距离和5-10分钟的照射时间，获得了高达18％存活率。其它的参数组合获得存活率都比较低，主要与精子活力灭活不足或精子灭活过度有关，一方面精子灭活不足会产生大量的畸形杂交苗，最后死亡；另一方面精子活力灭活过度会导致精子无法启动卵子的发育，从而导致存活率不高。更重要的是，照射时间的缩短，不仅提高了处理效率，而且对于提高存活率来说，优势非常明显。
通过二个月饲养，获得大批量的雌核发育草鱼(如图3)。随即抽样、测量分析其生物学性状相关数据，并分别与普通草鱼的各项已知数据进行比较，结果如表3所示：
表3：雌核发育草鱼和普通草鱼的可数性状比较(单位：片或条)
注：上表中大写的罗马数字代表硬棘条的数目，阿拉伯数字代表鳍条的数目。
由表3可看出，雌核发育草鱼与普通草鱼在侧线鳞，测线上鳞，测线下鳞，背鳍条和腹鳍条上面都存在一定的差别，其中腹鳍条的差别最为明显，雌核发育草鱼的腹鳍条为10条，普通草鱼腹鳍条为8条。
用尾鳍细胞培养法对二月龄的雌核发育草鱼染色体数目进行检测。尾鳍细胞培养做染色体的步骤如下：
1)用75％酒精喷洒剪刀，再用络合碘在鱼的尾部擦拭，剪去部分尾鳍，放入1.5mlRNA的EP管中，接着用75％的酒精清洗两次，清洗之后转移到新的1.5ml RNA的EP管中，再用含有双抗的PBS溶液清洗两次，1200rpm离心3min，同时在培养皿铺撒0.2％的明胶，等待30min，剪碎尾鳍细胞之后用1200rpm离心3min 2次，再加入血清稍微吹打一下，待明胶固定之后，将尾鳍碎片铺洒在上面。加入培养基在28℃下进行培养，培养两小时再加入1ml尾鳍细胞培养液。培养2天后观察细胞贴壁生长情况。当细胞分裂旺盛，生长状态好且密度在70～80％时，此时在细胞培养液中按1:200加入20ug/ml秋水仙素至终浓度为0.1ug/ml；2)取出培养皿，将细胞用0.25％胰酶消化成单细胞悬液；3)将细胞悬液转移至15ml离心管，1000r/min离心10min，弃上清。获取的细胞沉淀中加入事先预热至37℃0.0375％KCL低渗液4ml，用滴管吹打成单细胞悬液，28℃水浴低渗处理15～20min；4)预先10ml固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，放于4℃冰箱预冷；5)低渗的离心管中加入1ml预冷的固定液，轻轻吹打混匀后1000r/min离心10min；6)弃上清，加4ml预冷的固定液，轻轻吹打成单细胞悬液，放于4℃冰箱固定30min以上；7)1000r/min离心5min；8)配8ml固定液，4℃冰箱预冷；9)重复6，7步；10)弃上清，加入少量固定液(0.2～0.6ml)重悬细胞；11)取一洁净载玻片，用滴管吸取细胞悬液到载玻片的垂直上方50cm以上处滴片，将玻片倾斜放置；12)配10ml Giemsa染液；13)染色15～20min；14)自来水冲洗0.5～1min，蒸馏水冲洗5s.观察拍照。
结果如图4所示(红色箭头代表微小染色体)，用灭活锦鲤精子诱导草鱼卵子，获得的雌核发育草鱼染色体数目为48条，微小染色体表示锦鲤的染色体片段进入草鱼中产生了“杂交”效应。
通过流式细胞仪鉴定雌核发育草鱼为二倍体，其步骤为：1)从雌核发育草鱼尾部静脉抽取少量血液，稀释于ACD抗凝剂中，并打开流式仪器；2)将混合后的血液样品吸取部分溶于500ml DAPI溶液中；3)将该溶液避光处理10min进行过滤；4)将过滤的液体上机进行测定，结果如图5。由图5可知，主要的细胞数目都聚集在DNA含量为62的位置，再结合生物学相关知识，从而可以判断雌核发育草鱼为二倍体。(注明：横坐标代表DNA含量的数量级，纵坐标代表测定的细胞数目，每一峰值代表一群DNA含量相同的细胞)
对雌核发育草鱼血细胞鉴定，血涂片步骤如下：1)用注射器抽取少量的血液，并滴一滴在载玻片上；2)迅速用一干净的玻片倾斜45度的方向均匀涂抹整个玻片；3)加入磷酸缓冲液，静止10min；4)用细流水从背面冲洗，晾干之后进行镜检。血细胞鉴定发现雌核发育草鱼血细胞中没有出现哑铃型细胞(如图6)，说明雌核发育草鱼为二倍体(哑铃型细胞是多倍体鱼的一个主要标志)。
雌核发育是指卵子主要依靠本身的遗传物质发育成为个体的生殖行为。在雌核发育的长期研究过程中，我们发现异源精子不仅起着激活卵子雌核发育的作用，还可能留下部分遗传物质(染色体片段)产生“杂交”效应，从而产生杂交优势，可以获得生长速度快、体型标志、体色鲜艳、抗病性强等优势性状。这种由染色体片段产生的“杂交”效应具有重要的意义。一方面，如果锦鲤的精子不用紫外线灭活，其与草鱼卵子的杂交是不能形成存活后代；另一方面，如果锦鲤的精子通过紫外线较长时间照射，精子很难启动卵子的发育，即使有小部分存活，也不会有锦鲤精子染色体片段的遗留，更不会产生这种“杂交”效应。本发明中明显缩短了紫外线的照射时间，保证了精子染色体片段的产生，是形成“杂交”效应的关键。为了解决雌核发育的存活数量低的问题，一方面，我们在紫外线处理精子的操作上摸索出了最佳实验参数(温度、照射距离和照射时间)；另一方面，我们选择了更合适的异源精子(锦鲤精子)和最佳时间段的卵子(头等卵子)。而Stanley JG用鲤鱼精子对草鱼进行雌核发育只获得3％的后代(Stanley JG,1976)。在本发明中，雌核发育草鱼获得优良性状的另外一个原因是在雌核发育处理过程中经历了严格的冷休克淘汰处理，经用照射过的锦鲤精子激活的草鱼的卵子被置于4℃冰水混合物处理12～14min，这个过程是一个严格的筛选过程，那些抗逆性弱的胚胎将逐渐死去，留下的都是经过淘汰处理后的抗逆性强的后代。另外，锦鲤精子留下来的染色体片段的“杂交”效应对克服冷休克逆境可能也有重要作用。雌核发育草鱼形成的优良性状与上述两个原因是有关的。
运用本方法可以获得存活率高(存活率达到了18％，远远高于一般的3％存活率)、大量的(高达13000尾正常雌核发育草鱼)、生长速度快、抗病强的雌核发育草鱼。这些优良的雌核发育草鱼的获得，将为研究草鱼性别决定机制、染色体定位、草鱼遗传图谱构建和进化等一些生物学问题提供了重要的实验材料(雌核发育草鱼比普通草鱼纯合度更高，在染色体和基因水平上，不会有更多其它基因的干扰，对实验结果更准确更可靠)；另一方面，该批量创制的雌核发育草鱼为大量研制抗病草鱼提供了充足的重要种质资源(本发明选育的雌核发育草鱼可以作为优质母本与普通雄性草鱼进行交配，大规模生产抗病草鱼，在生产上具有重要价值)。
本方法获得的雌核发育草鱼在研究草鱼性别决定机制领域的应用，雌核发育成活的子一代，如果全是雌性，那么它的亲本雌性应是同型配子(XX)，雄性应是异型配子(XY)。如果雌核发育成活的子一代，既有雌性个体，又有雄性个体，它的亲本雌性则应是异型配子(WZ)，雄性应是同型配子(ZZ)，因此根据雌核发育子一代性别的表现，可以推理其亲本性别决定机制。如果雌核发育子一代表明全是雌性，可以应用雌核发育和人工转性相结合的技术建立鱼类纯系。本研究室研究成功的雌核发育草鱼，等到性成熟后，如果全是雌性，把部分雌性个体转性为“生理雄性”，以此“生理雄性”产生的精子与其同胞姊妹产生的卵子受精，所得子代如果全是雌性，这种结果，不仅可以获得全雌性的草鱼纯系，而且能够证实草鱼性别决定机制，雌性是同型配子(XX)，雄性是异型配子(XY)。
以本方法获得的雌核发育草鱼在生产抗病草鱼领域的应用，以所述雌核发育草鱼作为母本与普通雄性草鱼进行交配，得到抗病草鱼后代从鱼苗到成鱼的成活率可达到70％(普通草鱼由于易患烂鳃、水霉病、出血病、苗头蚤、肠炎、肝胆综合症等疾病，存活率较低，只有20％左右)，成活率相比普通草鱼有了大幅度提升，在生产上具有重要价值。养殖抗病草鱼具有生产成本低、产量高，不用或少用药物具有绿色环保产品，因而产生巨大社会和经济效益(与申请者实验室合作的湘云生物科技有限公司年产抗病草鱼能达到2亿尾以上)，具有非常大的市场需求。
Claims (6)
1.一种锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法，包括如下步骤：
（1）将达到性成熟的锦鲤精液用Hank’s液在0～10℃温度下进行稀释，得到的稀释精液平铺于培养皿中形成薄层，然后将培养皿放在垫有冰板的摇床上进行离心处理，控制摇床的转速为90～100r/min，同时用功率为19～20瓦的紫外灯照射5～10min进行灭活处理；所述灭活处理后得到的锦鲤精液遇水激活观察具有60～70%的精子保持活力；紫外灯与摇床的距离为15～17cm；
（2）将所述步骤（1）照射灭活后得到的锦鲤精液与成熟的草鱼头等卵子混合，用羽毛充分搅拌后立刻放入常温水中进行受精2～3min，将得到的受精卵放入冷水中，用羽毛充分搅起让受精卵与冷水充分接触，进行冷处理12～14min；
（3）将所述步骤（2）冷处理后得到的受精卵转入常温的水中进行正常孵化4～5min，再转入水温为23～27℃的水泥槽中进行流水孵化，水流大小以受精卵能在水泥槽中随水流翻动为准，将孵化后得到的有眼脸的鱼苗放到预先培肥的水泥槽中进行前期饲养，再转入土池进行正常饲养，即得到雌核发育草鱼。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，Hank’s液包括以下质量份数的各组分：NaCl 8～8.2份，KCl 0.4～0.45份，CaCl2 0.14～0.15份，MgSO4·7H2O 0.2～0.25份，Na2HPO4·H2O 0.06～0.065份，KH2PO4 0.06～0.065份，NaHCO3 0.35～0.36份，C6H12O6 1.0～1.5份，MgCl2·6H2O 0.1～0.15份以及水1000份，所述锦鲤精液与Hank’s液的质量比为1:3～1:4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，前期饲养的时间为90～120天。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）和（3）中，常温水的温度为24～25℃，冷水的温度为3.5～4℃。
5.一种由权利要求1-4中任一项所述方法获得的雌核发育草鱼在研究草鱼性别决定机制领域的应用。
6.一种由权利要求1-4中任一项所述方法获得的雌核发育草鱼在生产抗病草鱼领域的应用，其特征在于，以所述雌核发育草鱼作为母本与普通雄性草鱼进行交配，得到抗病草鱼后代。
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| CN102919185A (zh) * | 2012-11-27 | 2013-02-13 | 北京市水产科学研究所 | 一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法 |
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2017
- 2017-08-16 CN CN201710702333.2A patent/CN107318719B/zh active Active
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