CN105475202B - 一代育成全雌黄颡鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一代育成全雌黄颡鱼的方法，包括以下步骤：(1)以超雄黄颡鱼作为父本，以普通黄颡鱼雌鱼作为母本获得的受精卵进行冷处理诱导获得全雄三倍体黄颡鱼；从性成熟的普通黄颡鱼雌鱼卵巢中分离卵原细胞；(2)将卵原细胞显微注射到全雄三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔；(3)步骤(2)的仔鱼性成熟后，生产出供体X染色体的精子，与普通雌性黄颡鱼产生的卵子授精后即可获得全雌黄颡鱼。本方法通过生殖细胞移植，直接产生X染色体的精子，因此只需一代培育便能快速建立全雌黄颡鱼繁育系，产生全雌后代，与传统的全雌黄颡鱼培育方法相比，可以缩短1年时间，由于是将黄颡鱼生殖细胞移植到黄颡鱼，属于同属同种移植，能获得更高的成功率。
Description
技术领域
本发明涉及黄颡鱼培育技术领域，具体涉及一种一代育成全雌黄颡鱼的方法。
背景技术
生殖细胞移植技术作为细胞工程育种的一个分支，在哺乳动物中已经被广泛应用，但是鱼类生殖细胞移植技术在2000年以后才被逐步建立并应用。2003年，Takeuchi等报道了鱼类的第一个原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)移植体系，但是由于每个供体鱼胚胎内PGCs数量较少，分离过程中又会丢失一部分，因而成功率较低而无法应用于生产中。2006年，Okutsu等建立了一个新颖的鱼类精原细胞移植体系。2008年Okutsu等从雄鳟鱼中分离出精原细胞，将其注射到不育的刚孵化出膜的三倍体大马哈鱼腹腔内。移植两年后，三倍体马苏大马哈鱼只产生了供体鳟鱼的精子和卵子。这项技术除了在鲑科鱼中取得成功以外，在其他海水鱼中也取得了成功。生殖细胞移植要克服的第一个障碍就是受体鱼对外源性生殖细胞(来源于供体)的免疫排斥反应。新孵化的幼鱼由于免疫细胞尚未成熟，没有适应的免疫功能，因此没有能力排斥外源细胞。生殖细胞具有较高的性别可塑性，其通过趋化作用迁移至生殖嵴，进行自我更新并产生子代细胞，最终分化成配子。
传统的全雌鱼培育方法需要经过两代培育，首先人工繁殖的仔鱼通过激素性逆转，获得XX♂伪雄鱼(F1)，XX♂伪雄鱼培育至性成熟后进行测交筛选，经过筛选的XX♂伪雄鱼与XX♀普通雌鱼交配产生全雌性后代(F2)。
发明内容
为了解决现有技术关于全雌黄颡鱼生产方法仍然需要两代培育，时间周期较长的问题，本发明提供了一种缩短生产周期的一代育成全雌黄颡鱼的方法。
本发明提供的一代育成全雌黄颡鱼的方法，包括以下步骤：
(1)以超雄黄颡鱼作为父本，以普通黄颡鱼雌鱼作为母本获得的受精卵进行冷处理诱导获得全雄三倍体黄颡鱼；从性成熟的普通黄颡鱼雌鱼卵巢中分离卵原细胞；
(2)将卵原细胞显微注射到全雄三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔；
(3)步骤(2)的仔鱼性成熟后，生产出供体X染色体的精子，与普通雌性黄颡鱼产生的卵子授精后即可获得全雌黄颡鱼。
本发明所述的普通黄颡鱼雌鱼、普通雌性黄颡鱼均是指野生型的雌性黄颡鱼，其性染色体组成为XX型。
本发明方法的原理为：三倍体鱼类不育的原因是生殖干细胞的三套同源染色体在减数分裂过程中配对紊乱不能形成整倍体配子，但其生殖腺内的微环境是正常的，并且这一微环境的内分泌体系适合配子的发生。因此移植一段时间后，来源于供体的卵原细胞会融合到受体性腺中，并且在雄性受体中开始增殖并继续配子发生。卵原干细胞具有较高的性可塑性，融合到受体性腺中的供体卵原细胞可以像精原干细胞一样分化出精子(染色体为供体X)。这种精子与普通雌性黄颡鱼产生的卵子授精后就能获得全雌黄颡鱼，一代育成，大大缩短了培育周期。
优选地，上述一代育成全雌黄颡鱼的方法中，所述冷处理诱导的方法为：受精卵在4℃条件下冷处理15min，然后放入23～26℃温度环境下继续培育，鱼苗孵出后，去除畸形鱼苗。如果在精子入卵而第二极体尚未外排之时，对受精卵进行高温、低温、高压或化学药物等处理，阻止第二次减数分裂的进行，第二极体就不能排出卵外，形成具有3组染色体的个体，称之为人工诱导三倍体。在众多诱导方法中，上述冷处理方法最简便易行，并且处理效果显著，适合作为规模化生产的最优方案。
优选地，上述一代育成全雌黄颡鱼的方法中，所述分离卵原细胞的方法为：分离出卵巢，剪碎，用L-15培养基在10℃下培养7～9小时，剔除细胞块，剩下的即为卵原细胞，将其置于L-15培养基中重新悬浮备用；所述L-15培养基包含2mg/mL的胶原酶H和500国际单位的蛋白质水解酶。
优选地，上述一代育成全雌黄颡鱼的方法中，步骤(1)中受精卵为人工授精获得，首先用催产素对雄鱼和雌鱼分别进行人工催产，然后从雌鱼中挤出成熟的卵子，对雄鱼进行剖腹取精。
优选地，上述一代育成全雌黄颡鱼的方法中，所述催产素包括鱼用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮。经过多年试验比较，采取三种混合催产药物比单个使用的产卵率要高，而且产卵的时间比较好控制。
优选地，上述一代育成全雌黄颡鱼的方法中，催产雌鱼的方法为：待催产的雌鱼第一次注射鱼用促黄体素释放激素类似物2号，剂量为20μg/kg；经过16～18小时后，第二次注射鱼用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮的混合物，剂量为每千克雌鱼：鱼用绒毛膜促性腺激素2500～2900IU，鱼用促黄体素释放激素类似物2号30～34μg，多巴胺拮抗物地欧酮6～10mg；第二次注射后经18～22小时的效应时间，从雌鱼中挤出成熟的卵子。由于黄颡鱼卵巢发育不同步，通过第一针来促进卵巢发育基本一致，具体机制还有待进一步探讨，我们发现分两次注射能够获得大量同步成熟的卵子。
优选地，上述一代育成全雌黄颡鱼的方法中，催产雄鱼的方法为：待催产的雄鱼注射鱼用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮的混合物，剂量为每千克雌鱼：鱼用绒毛膜促性腺激素2500～2900IU，鱼用促黄体素释放激素类似物2号30～34μg，多巴胺拮抗物地欧酮6～10mg；注射后经18～22小时的效应时间，对雄鱼进行剖腹取精。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本方法通过生殖细胞移植，直接产生X染色体的精子，因此只需一代培育便能快速建立全雌黄颡鱼繁育系，产生全雌后代，大大缩短了培育周期。与传统的全雌黄颡鱼培育方法相比，可以缩短1代，即1年时间。
2、由于是将黄颡鱼生殖细胞移植到黄颡鱼，属于同属同种移植，能获得更高的成功率。
附图说明
图1是实施例1列举的一种一代育成全雌黄颡鱼的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、冷处理诱导全雄三倍体黄颡鱼
在繁殖季节(一般为5～6月份)，挑选两龄及以上，活力强，无病，无伤，性腺发育良好的超雄黄颡鱼(染色体YY♂)作为父本，挑选身体健壮、体形正常、腹部膨大、性腺发育至IV期的普通雌性黄颡鱼(染色体XX♀)作为母本。
使用鱼用绒毛膜促性腺激素(HCG)、鱼用促黄体素释放激素类似物2号(LRH-A2)和多巴胺拮抗物地欧酮(DOM)作为催产剂进行人工催产。催产药物剂量按鱼的体重计算，为每千克鱼：HCG 2500～2900IU+LHRH-A230～34μg+DOM 6～10mg。
雌鱼采用2次注射法，第一针仅注射LHRH-A220μg/kg，第一次注射后16～18h进行第二次注射，第二次注射全部三种药物，剂量如上所述。雄鱼与雌鱼第二次注射的剂量相同。
注射部位为每条鱼胸鳍基部。效应时间20小时左右后从雌鱼中挤出成熟的卵子，对雄鱼进行剖腹取精，然后进行人工授精。
受精后2min，用4℃水持续处理15min，经处理的受精卵放入23～26℃水中继续培育，按时观察其胚胎发育情况，等鱼苗孵出后，去除畸形鱼苗。
2、从性成熟的普通黄颡鱼雌鱼卵巢中分离卵原细胞
使用0.0075％的3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐溶液(A5040sigma)将性成熟的普通黄颡鱼雌鱼(染色体XX♀)麻醉，解剖取出卵巢。分离的卵巢先用解剖剪剪碎，然后用1mLL-15培养基(包含2mg/mL的胶原酶H和500国际单位的蛋白质水解酶，均购于武汉丁香园实验器材经营部)在10℃下培养7～9小时，之后过20μm的尼龙筛绢剔除细胞块。过滤后的卵原细胞悬液在200μLL-15培养基(市售商品)中重新悬浮，放于冰上备用。
3、将卵原细胞显微注射到全雄三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔
微注射针是一端用细镊子人工拉制成针头的玻璃毛细管，该针头为直径10μm的尖端开口。使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入卵原细胞悬液，然后将微注射针连接在显微注射器上，通过调节注射装置上的旋钮来设置注射的时间、压力等，以精确每次注射的体积。
以孵化后25天的全雄三倍体黄颡鱼为受体，显微注射前10min使用0.0075％的3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐溶液(A5040 sigma)对其进行麻醉，并将受体鱼转移至培养皿上。然后把载有受体鱼的培养皿放在显微镜载物台上，在显微镜下进行显微注射，调节显微注射角度，以倾斜45°方向插入受体鱼腹腔(气鳔之下，接近生殖腺之处)。轻轻旋转加样旋钮，将细胞悬液加入受体鱼腹腔中，每尾注射大约20～30nL细胞悬浮液(包含15000个细胞)。注射完后将受体鱼放回水中，使其恢复知觉。
4、用流式细胞仪检测受体鱼倍性
等移植卵原细胞的受体鱼苗长至一定大小(约3cm)，利用流式细胞仪测定血细胞相对DNA含量。其方法如下：用抗凝剂浸润注射器，然后从鱼体背部脊柱下静脉采血，只需收集少量血液即可。采集到的血液加入NDA荧光染料避光染色，用过滤管过滤，染色后的血液置于细胞仪标准试管内，用流式细胞仪进行检测，选正常二倍体血细胞为对照样品。用流式细胞仪进行DNA倍性检测分析后，筛选出三倍体全雄黄颡鱼。
5、培育筛选能产精子的三倍体黄颡鱼
三倍体鱼类不育的原因是生殖干细胞的三套同源染色体在减数分裂过程中配对紊乱不能形成整倍体配子，但其生殖腺内的微环境是正常的，并且这一微环境的内分泌体系适合配子的发生。因此移植20天后，来源于供体的卵原细胞会融合到受体性腺中，并且在雄性受体中开始增殖并继续配子发生。卵原干细胞具有较高的性可塑性，融合到受体性腺中的供体卵原细胞可以像精原干细胞一样分化出精子。
通过步骤4，筛选出三倍体黄颡鱼后，继续培育，等性成熟后，按常规催产方法与普通雌性黄颡鱼(染色体XX♀)交配，孵化鱼苗，8～10天后用分子遗传标记分析其鱼苗遗传背景，确定获得的黄颡鱼全部是XX雌鱼。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.一代育成全雌黄颡鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以超雄黄颡鱼作为父本，以普通黄颡鱼雌鱼作为母本获得的受精卵进行冷处理诱导获得全雄三倍体黄颡鱼；从性成熟的普通黄颡鱼雌鱼卵巢中分离卵原细胞；
(2)将卵原细胞显微注射到全雄三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔；
(3)步骤(2)的仔鱼性成熟后，生产出供体X染色体的精子，与普通雌性黄颡鱼产生的卵子授精后即可获得全雌黄颡鱼。
2.根据权利要求1所述的一代育成全雌黄颡鱼的方法，其特征在于，所述冷处理诱导的方法为：受精卵在4℃条件下冷处理15min，然后放入23～26℃温度环境下继续培育，鱼苗孵出后，去除畸形鱼苗。
3.根据权利要求1所述的一代育成全雌黄颡鱼的方法，其特征在于，所述分离卵原细胞的方法为：分离出卵巢，剪碎，用L-15培养基在10℃下培养7～9小时，剔除细胞块，剩下的即为卵原细胞，将其置于L-15培养基中重新悬浮备用；所述L-15培养基包含2mg/mL的胶原酶H和500国际单位的蛋白质水解酶。
4.根据权利要求1所述的一代育成全雌黄颡鱼的方法，其特征在于，步骤(1)中受精卵为人工授精获得，首先用催产素对雄鱼和雌鱼分别进行人工催产，然后从雌鱼中挤出成熟的卵子，对雄鱼进行剖腹取精。
5.根据权利要求4所述的一代育成全雌黄颡鱼的方法，其特征在于，所述催产素包括鱼用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮。
6.根据权利要求5所述的一代育成全雌黄颡鱼的方法，其特征在于，催产雌鱼的方法为：待催产的雌鱼第一次注射鱼用促黄体素释放激素类似物2号，剂量为15～20μg/kg；经过16～18小时后，第二次注射鱼用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮的混合物，剂量为每千克雌鱼：鱼用绒毛膜促性腺激素2500～2900IU，鱼用促黄体素释放激素类似物2号30～34μg，多巴胺拮抗物地欧酮6～10mg；第二次注射后经18～22小时的效应时间，从雌鱼中挤出成熟的卵子。
7.根据权利要求5所述的一代育成全雌黄颡鱼的方法，其特征在于，催产雄鱼的方法为：待催产的雄鱼注射鱼用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮的混合物，剂量为每千克雌鱼：鱼用绒毛膜促性腺激素2500～2900IU，鱼用促黄体素释放激素类似物2号30～34μg，多巴胺拮抗物地欧酮6～10mg；注射后经18～22小时的效应时间，对雄鱼进行剖腹取精。
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