CN113774014B - 一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用，采用本发明的分离纯化方法，可从卵原细胞占比为10％左右的卵巢细胞悬液中，分离纯化得到占比在85.6～90.3％的卵原细胞；而且该方法对细胞的损伤小，获得的细胞活力高，操作过程，简单方便，所用仪器普遍，易于推广和应用；东星斑卵原细胞的鉴定方法，采用杂交显示技术，使用Nanos2探针标记卵原细胞，可快速识别东星斑卵原细胞；本发明的东星斑卵原细胞的分离纯化方法为东星斑生殖发育研究以及后期借助生殖细胞移植技术应用卵原干细胞来扩增东星斑雄性个体提供了技术保障。

Description

一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用
技术领域
本发明涉及海水鱼类生殖与细胞培养技术领域，特别涉及一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用。
背景技术
鱼类卵原细胞在形态上呈圆形或椭圆形，体积相对较大，细胞核不规则且核质比大，具有1～2个核仁。目前仅部分鱼类的卵原细胞被分析和鉴定，并且在石斑鱼类上有关卵原细胞的鉴定、分离及纯化少有涉及，针对石斑鱼类卵原细胞的研究也是鲜有报道，限制了石斑鱼类卵原细胞的研究与应。因此，开发应用于石斑鱼卵原细胞识别、分离及纯化的方法，对于分析、研究石斑鱼卵原细胞至关重要，也可为借助生殖细胞移植技术应用卵原干细胞来扩增石斑鱼雄性个体提供基础技术保障，缩短石斑鱼育种周期。
豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)，俗称东星斑，属于鲈形目鮨科鳃棘鲈属，广泛分布于太平洋西岸、印度洋等海域。东星斑是雌雄同体且雌性先熟的鱼类，在4～5龄才能性逆转为雄性，导致现存雄鱼亲本种群有限，存在近交严重、种质衰退等问题。另外东星斑已被列为国家二级保护动物，不能通过捕捞野生个体补充雄性亲本资源。因此，雄性亲鱼获取尤为困难，亟需借助新途径缩短雄鱼培育周期，拓宽东星斑雄鱼来源。
鱼类卵原细胞(OSCs)是一群具有自我更新和分化潜能的成体干细胞，随着鱼类生殖细胞移植技术研究的深入，发现其在移植到雄鱼精巢后可以产生成熟的精子。因此，有必要建立石斑鱼类卵原细胞鉴定、分离及纯化的有效方法，以便我们对卵原细胞的深入研究和应用。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法包括以下步骤：
1)卵巢预处理：摘取东星斑的卵巢，将卵巢放入5～8倍质量含有双抗的DMEM培养基中，在0～4℃放置10～20min后，清洗卵巢后，放入新的DMEM培养基中，备用；
2)卵巢细胞悬液的制备：取出步骤1)的卵巢，从侧面剪开卵巢，除去卵巢外膜，剪碎组织，加入3～5倍体积的DMEM培养基，进行第一次离心，吸弃上清，向沉淀中加入蛋白酶消化液，在25～30℃消化40～60min后，用70μm滤器过滤，取滤液进行第二次离心，弃上清，除去组织碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0～5.0×108个/mL，得东星斑卵巢细胞悬液；
3)卵原细胞纯化：配制不同浓度的Percoll溶液，再将各浓度的Percoll溶液配制Percoll密度梯度溶液，将步骤2)的东星斑卵巢细胞悬液1～2mL加到Percoll密度梯度溶液的最上层，水平离心后，从上到下数，取第二层细胞层，得卵原细胞。
优选的，所述东星斑为3～4月龄的东星斑，该月龄的东星斑卵巢处于II时相早期，卵巢大小适中且其中包含大量卵原细胞及少量卵母细胞。
优选的，所述含有双抗的DMEM培养基为含有青霉素和链霉素的DMEM培养基。
优选的，所述青霉素和链霉素的加入量为每1mL DMEM培养基加入300～350IU青霉素和250～300μg链霉素。
优选的，步骤2)中，所述第一次离心为在40～50×g离心5～8min，第二次离心为在0～4℃80～120×g离心10～15min。
优选的，所述蛋白酶消化液为每100mL含有0.1～0.3g胰蛋白酶、0.2～0.4g胶原酶H型、3.0～5.0mL胎牛血清和0.02～0.06gDNA酶I的DMEM培养基。
优选的，所述消化为每隔10～20min用枪轻轻吹打混匀消化液，然后在显微镜下检查消化情况，统计消化得到细胞和组织块比例，统计细胞活率，当细胞活率为95～98％时，停止消化。
优选的，所述Percoll溶液的体积浓度分别为10％～20％、25％～35％、40％～50％、55％～65％。
优选的，所述Percoll密度梯度溶液的配制方法为每个浓度的Percoll溶液取1.5～2.0mL，按照浓度从高到低的顺序沿着管壁依次加到离心管，制成Percoll密度梯度溶液。
优选的，所述的离心管为玻璃离心管，使用玻璃离心管可减少细胞在离心管壁的附着，易于分层和吸取。
优选的，步骤3)中，所述水平离心为在300～500×g水平离心25～40min。
另一方面，本发明还提供了一种东星斑卵原细胞的鉴定方法，包括以下步骤：
S1.取东星斑卵巢样品，用1×PBS(磷酸缓冲盐溶液)漂洗后，用体积浓度为4％PFA(多聚甲醛溶液)在0～4℃固定24h，用梯度甲醇脱水，于0～4℃保存，得原位杂交样品；
S2.用石蜡包埋步骤S1的原位杂交样品后切片，切片用DEPC水展片，捞片，在35～40℃烘干切片，将切片脱蜡后进行复水处理，洗涤，加入蛋白酶K进行消化，消化结束后洗涤，用4％PFA固定后，洗涤，进行预杂交处理，预杂交结束后加入0.8～1.2倍体积的含有东星斑Nanos2探针的杂交液，置于60～70℃的杂交炉中孵育过夜，得杂交样品；
S3.将步骤S2中的杂交样品经洗脱探针处理，加入抗体孵育过夜，洗涤，避光加入显色剂显色，终止显色后洗涤，再用4％PFA固定，用中性红复染，再用二甲苯透明后，在显微镜下观察染色结果，Nanos2在卵原细胞上显色。
优选的，所述探针为RNA探针，构建Nanos2探针模板的引物序列如下：
F:5’-ATGCAAAGACCAGTCCAGAGC-3’，
R:5’-CCCGGTGGCTTCACAGAT-3’。
优选的，所述消化为在25～30℃消化5～10min；所述切片和蛋白酶K的质量体积比为1g：2～3mL。
优选的，所述杂交液的浓度为450～500ng/mL。
优选的，步骤S3中，抗体的种类本发明不作特别限制，本领域技术人员根据经验添加，在本发明一个优选的实施方式中，加入的抗体为碱性磷酸酶抗体。
另一方面，本发明还提供了所述东星斑卵原细胞在扩增石斑鱼雄性个体方面的应用。
优选的，所述应用为借助生殖细胞移植技术将卵原干细胞移植在东星斑雌性个体中，促进雌性个体转化为雄性个体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种可快速高效获取高纯度东星斑卵原细胞的分离纯化方法，采用本发明的分离纯化方法，可从卵原细胞占比为10％左右的卵巢细胞悬液中，分离纯化得到占比在85.6～90.3％的卵原细胞；而且该方法对细胞的损伤小，获得的细胞活力高，操作过程，简单方便，所用仪器普遍，易于推广和应用。
本发明的东星斑卵原细胞的鉴定方法，采用杂交显示技术，使用Nanos2探针标记卵原细胞，可快速识别东星斑卵原细胞。
本发明的东星斑卵原细胞的分离纯化方法为东星斑生殖发育研究以及后期借助生殖细胞移植技术应用卵原干细胞来扩增东星斑雄性个体提供技术保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例6Nanos2探针标记的东星斑卵原细胞的观察图；
图2为本发明实施例1分离纯化后的东星斑卵原细胞的显微镜观察图，图A为解离后的卵巢细胞悬液，图B为纯化后的东星斑卵巢细胞悬液，图C为卵原的体细胞；图D为卵原细胞；图E为卵母细胞；图F为分化程度更高的卵母细胞；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例中所涉及的化学药品及工具如无特殊说明均为购买于市场商品。
实施例1
一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)配制青霉素浓度为300IU/mL、链霉素浓度为300μg/mL的双抗DMEM培养基，摘取4月龄东星斑卵巢放入其中，双抗DMEM培养基和卵巢的质量比为8：1，4℃放置10min，清洗卵巢3遍，更换新的DMEM培养基；
2)将步骤1)的卵巢从侧面剪开，并除去卵巢外膜，剪碎组织，加入3倍体积的DMEM培养基50×g离心5min，吸弃上清，加入沉淀3倍体积的蛋白酶消化液在25～30℃消化40～60min，每隔20min用枪轻轻吹打混匀，并在显微镜下检查消化情况，统计消化得到细胞和组织块比例，并统计消化得到的细胞活率，待细胞活率为95～98％时，加入1/2体积的胎牛血清终止消化，用70μm滤器过滤，取滤液在4℃100×g离心10min，弃上清并除去碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0×108个/mL，得细胞悬液，检测细胞悬液中卵原细胞的占比；所述蛋白酶消化液每100mL含有0.3g胰蛋白酶、0.4g胶原酶H型、5.0mL胎牛血清以及0.06g DNA酶I的DMEM培养基；
3)按照Percoll使用说明将1.5M NaCl和percoll按照1：9比例达到生理性渗透压，随后用生理盐溶液分别配制浓度为20％、30％、40％、65％的的Percoll溶液，然后按照从高浓度到低浓度的顺序依次取1.5mL的Percoll溶液加到10mL玻璃离心管中，再取2mL步骤2)的细胞悬液加入到顶层，使用水平离心机在4℃、400×g条件下离心25min，可明显的看到3层细胞层(图2B)，取第二层细胞层，得东星斑卵原细胞。
实施例2
一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)配制青霉素浓度为350IU/mL、链霉素浓度为250μg/mL的双抗DMEM培养基，摘取3月龄东星斑卵巢放入其中，双抗DMEM培养基和卵巢的质量比为5：1，4℃放置20min，清洗卵巢3遍，更换新的DMEM培养基；
2)将步骤1)的卵巢从侧面剪开，并除去卵巢外膜，剪碎组织，加入3倍体积的DMEM培养基40×g离心8min，吸弃上清，加入沉淀3倍体积的蛋白酶消化液在25～30℃消化40～60min，每隔10min用枪轻轻吹打混匀，并在显微镜下检查消化情况，统计消化得到细胞和组织块比例，并统计消化得到的细胞活率，待细胞活率为95～98％时，加入1/2体积的胎牛血清终止消化，用70μm滤器过滤，取滤液在4℃80×g离心15min，弃上清并除去碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在2.5×108个/mL，得细胞悬液，检测细胞悬液中卵原细胞的占比；所述蛋白酶消化液每100mL含有0.3g胰蛋白酶、0.4g胶原酶H型、5.0mL胎牛血清以及0.06g DNA酶I的DMEM培养基；
3)按照Percoll使用说明将1.5M NaCl和percoll按照1：9比例达到生理性渗透压，随后用生理盐溶液分别配制浓度为10％、25％、40％、55％的的Percoll溶液，然后按照从高浓度到低浓度的顺序依次取1.5mL的Percoll溶液加到10mL玻璃离心管中，再取2mL步骤2)的细胞悬液加入到顶层，使用水平离心机在4℃、300×g条件下离心40min，可明显的看到3层细胞层，取第二层细胞层，得东星斑卵原细胞。
实施例3
一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)配制青霉素浓度为300IU/mL、链霉素浓度为300μg/mL的双抗DMEM培养基，摘取6月龄东星斑卵巢放入其中，双抗DMEM培养基和卵巢的质量比为8：1，4℃放置10min，清洗卵巢3遍，更换新的DMEM培养基；
2)将步骤1)的卵巢从侧面剪开，并除去卵巢外膜，剪碎组织，加入3倍体积的DMEM培养基50×g离心5min，吸弃上清，加入沉淀3倍体积的蛋白酶消化液在25～30℃消化40～60min，每隔20min用枪轻轻吹打混匀，并在显微镜下检查消化情况，统计消化得到细胞和组织块比例，并统计消化得到的细胞活率，待细胞活率为95～98％时，加入1/2体积的胎牛血清终止消化，用70μm滤器过滤，取滤液在4℃100×g离心10min，弃上清并除去碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0×108个/mL，得细胞悬液，检测细胞悬液中卵原细胞的占比；所述蛋白酶消化液每100mL含有0.3g胰蛋白酶、0.4g胶原酶H型、5.0mL胎牛血清以及0.06g DNA酶I的DMEM培养基；
3)按照Percoll使用说明将1.5M NaCl和percoll按照1：9比例达到生理性渗透压，随后用生理盐溶液分别配制浓度为20％、30％、40％、65％的的Percoll溶液，然后按照从高浓度到低浓度的顺序依次取1.5mL的Percoll溶液加到10mL玻璃离心管中，再取2mL步骤2)的细胞悬液加入到顶层，使用水平离心机在4℃、400×g条件下离心25min，可明显的看到3层细胞层，取第二层细胞层，得东星斑卵原细胞。
实施例4
一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)配制青霉素浓度为100IU/mL、链霉素浓度为100μg/mL的双抗DMEM培养基，摘取4月龄东星斑卵巢放入其中，双抗DMEM培养基和卵巢的质量比为8：1，4℃放置10min，清洗卵巢3遍，更换新的DMEM培养基；
2)将步骤1)的卵巢从侧面剪开，并除去卵巢外膜，剪碎组织，加入3倍体积的DMEM培养基50×g离心5min，吸弃上清，加入沉淀3倍体积的蛋白酶消化液在25～30℃消化40～60min，每隔20min用枪轻轻吹打混匀，并在显微镜下检查消化情况，统计消化得到细胞和组织块比例，并统计消化得到的细胞活率，待细胞活率为95～98％时，加入1/2体积的胎牛血清终止消化，用70μm滤器过滤，取滤液在4℃100×g离心10min，弃上清并除去碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0×108个/mL，得细胞悬液，检测细胞悬液中卵原细胞的占比；所述蛋白酶消化液每100mL含有0.3g胰蛋白酶、0.4g胶原酶H型、5.0mL胎牛血清以及0.06g DNA酶I的DMEM培养基；
3)按照Percoll使用说明将1.5M NaCl和percoll按照1：9比例达到生理性渗透压，随后用生理盐溶液分别配制浓度为20％、30％、40％、65％的的Percoll溶液，然后按照从高浓度到低浓度的顺序依次取1.5mL的Percoll溶液加到10mL玻璃离心管中，再取2mL步骤2)的细胞悬液加入到顶层，使用水平离心机在4℃、400×g条件下离心25min，可明显的看到3层细胞层，取第二层细胞层，得东星斑卵原细胞。
实施例5
一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)配制青霉素浓度为300IU/mL、链霉素浓度为300μg/mL的双抗DMEM培养基，摘取4月龄东星斑卵巢放入其中，双抗DMEM培养基和卵巢的质量比为8：1，4℃放置10min，清洗卵巢3遍，更换新的DMEM培养基；
2)将步骤1)的卵巢从侧面剪开，并除去卵巢外膜，剪碎组织，加入3倍体积的DMEM培养基50×g离心5min，吸弃上清，加入沉淀3倍体积的蛋白酶消化液在25～30℃消化40～60min，每隔20min用枪轻轻吹打混匀，并在显微镜下检查消化情况，统计消化得到细胞和组织块比例，并统计消化得到的细胞活率，待细胞活率为95～98％时，加入1/2体积的胎牛血清终止消化，用70μm滤器过滤，取滤液在4℃100×g离心10min，弃上清并除去碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0×108个/mL，得细胞悬液，检测细胞悬液中卵原细胞的占比；所述蛋白酶消化液每100mL含有0.3g胰蛋白酶、0.4g胶原酶H型、5.0mL胎牛血清以及0.06g DNA酶I的DMEM培养基；
3)按照Percoll使用说明将1.5M NaCl和percoll按照1：9比例达到生理性渗透压，随后用生理盐溶液分别配制浓度为15％、30％、45％、60％的的Percoll溶液，然后按照从高浓度到低浓度的顺序依次取1.5mL的Percoll溶液加到10mL玻璃离心管中，再取2mL步骤2)的细胞悬液加入到顶层，使用水平离心机在4℃、400×g条件下离心25min，可明显的看到3层细胞层，取第二层细胞层，得东星斑卵原细胞。
取实施例1-5的东星斑卵原细胞检测其卵原细胞的占比及其细胞活性，检测结果见表1；
结果显示，经过本发明的分离纯化方法的分离效果好，且分离后的细胞活性高，表明本发明的方法可以从东星斑卵巢中有效分离卵原细胞，对细胞的损伤小，获得的卵原细胞占比大、活力高。与实施例1相比，实施例3采用6月龄的卵巢，分离得到的卵原细胞少；实施例4采用常规浓度的双抗培养基，其分离得到的卵原细胞活性低；实施例5采用密度梯度不同Percoll密度梯度溶液，卵原细胞的分离效果差。
实施例6
S1.取实施例2的东星斑卵原细胞，用1×PBS漂洗后，置于加有4％PFA的5mL离心管中在4℃固定24h，将固定后的样品经30％、50％、70％、90％和100％的甲醇梯度脱水，随后放置于4℃保存，作为原位杂交样品；
S2.使用石蜡包埋步骤S1的原位杂交样品后切片，在DEPC水中展片、捞片、37℃烘片，用二甲苯脱蜡，再用梯度甲醇溶液进行复水，用1×PBS洗涤，用蛋白酶K在25～30℃消化5min后，用1×PBS洗涤后，置于加有4％PFA的5mL离心管中在4℃固定24h后，用1×PBS洗涤，进行预杂交处理，预杂交结束后加入0.8倍体积的含有东星斑Nanos2探针的杂交液在60℃杂交炉中孵育过夜；所述杂交液的浓度为500ng/mL；
所述探针为RNA探针，序列如下构建Nanos2探针模板的引物序列如下：
F:5’-ATGCAAAGACCAGTCCAGAGC-3’
R:5’-CCCGGTGGCTTCACAGAT-3’；
S3.将步骤S2中的杂交样品经洗脱探针处理，加入碱性磷酸酶抗体孵育过夜，洗涤，避光加入显色剂显色，终止显色后洗涤，再用4％PFA固定，用中性红复染，再用二甲苯透明后，在显微镜下观察染色结果(图1)。
由图1中可以看出，卵原细胞在检测样品中的分布情况，表明本发明的鉴定方法可以识别卵原细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）卵巢预处理：摘取3~4月龄的东星斑的卵巢，将卵巢放入含有双抗的DMEM培养基中，在0~4℃放置10~20min后，清洗卵巢后，放入新的DMEM培养基中，备用；
所述含有双抗的DMEM培养基为含有青霉素和链霉素的DMEM培养基；所述青霉素和链霉素的加入量为每1mL DMEM培养基加入300~350IU青霉素和250~300μg链霉素；
2）卵巢细胞悬液的制备：取出步骤1）的卵巢，从侧面剪开卵巢，除去卵巢外膜，剪碎组织，加入DMEM培养基，进行第一次离心，吸弃上清，向沉淀中加入蛋白酶消化液，在25~30℃消化40~60min后，过滤，取滤液进行第二次离心，弃上清，除去组织碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0~5.0×108个/mL，得东星斑卵巢细胞悬液；
3）卵原细胞纯化：配制不同浓度的Percoll溶液，再将各浓度的Percoll溶液配制Percoll密度梯度溶液，将步骤2）的东星斑卵巢细胞悬液添加到Percoll密度梯度溶液的最上层，水平离心后，从上到下数，取第二层细胞层，得卵原细胞；
所述Percoll溶液的浓度分别为10％～20％、25％～35％、40％～50％、55％～65％；所述Percoll密度梯度溶液的配制方法为每个浓度的Percoll溶液取1.5~2.0mL，按照浓度从高到低的顺序沿着管壁依次加到离心管，制成Percoll密度梯度溶液。
2. 根据权利要求1所述的东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤2）中，所述第一次离心为在40~50×g离心5~8min，第二次离心为在0~4℃ 80~120×g离心10~15min。
3.根据权利要求1所述的东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述蛋白酶消化液为每100mL含有0.1~0.3g胰蛋白酶、0.2~0.4g胶原酶H型、3.0~5.0mL胎牛血清和0.02~0.06gDNA酶I的DMEM培养基；所述沉淀和蛋白酶消化液的质量体积比为1g：3~4mL。
4.根据权利要求1所述的东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤3）中，所述水平离心为在300~500×g水平离心25~40min。
5.根据权利要求1-4任一项所述东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述东星斑卵原细胞在扩增东星斑雄性个体方面的应用。
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