CN105961251B

CN105961251B - 一种耐低氧团头鲂的构建方法

Info

Publication number: CN105961251B
Application number: CN201610353413.7A
Authority: CN
Inventors: 邹曙明; 李福贵; 郑国栋; 吴成宾; 陈杰; 蒋霞云
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University
Priority date: 2016-05-25
Filing date: 2016-05-25
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2036-05-25
Also published as: CN105961251A

Abstract

本发明涉及一种耐低氧团头鲂的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤：(1)构建耐低氧F1群体：团头鲂低氧胁迫选育出耐低氧F1群体；(2)构建耐低氧F2群体：以耐低氧F1群体团头鲂为亲本构建F2家系，F2家系1龄阶段进行低氧胁迫养殖，2龄阶段常氧养殖；(3)构建耐低氧F3群体：以耐低氧F2群体团头鲂为亲本构建自交F3群体，或以耐低氧F2雌性团头鲂为母本，用紫外灭活的鲤鱼精子诱导构建团头鲂减数、有丝分裂雌核发育F3群体。其优点表现在：本发明培育出了团头鲂耐低氧的新品种，耐低氧能力显著提高，具备生长优势，且生长优势性状稳定遗传与累积。

Description

一种耐低氧团头鲂的构建方法

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体地说，是一种耐低氧团头鲂的构建方法及分析。

背景技术

团头鲂(Megalobrama amblycephala)，属硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲂属(Megalobrama)，是中国特有的淡水养殖品种，也是我国重要的草食性经济鱼类之一。因其食性广、生长快、易捕捞等特点而深受人们喜爱。近几年来，随着团头鲂养殖推广面积在我国不断扩大，据FAO最新统计数据，团头鲂产量从1980年的4.5万吨增至2014年70余万吨。但与草鱼、鲤鱼、鲫鱼等典型的鲤科鱼类相比，团头鲂是不耐低氧的种类，在养殖过程中极易缺氧泛塘，严重影响了其养殖产量的提高。培育出耐低氧的新品种具有巨大的生产意义。

家系选育是鱼类新品系选育的常用方法之一，并有广泛的运用。雌核发育是一种能快速建立遗传纯系、固定遗传性状的鱼类育种方法。目前学者们开展了多种鱼类人工雌核发育研究，如斑马鱼(Danio rerio)、鲤(Cyprnus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、黄姑鱼(Nibea albiflora)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)等的人工雌核发育，为快速建立纯系、鱼类性别控制、新品种的选育等方面提供了理论和实践指导。

在团头鲂“浦江1号”良种的基础上，培育出耐低氧的新品种具有巨大的生产意义。本研究参照团头鲂繁殖选育和水产养殖溶解氧研究的相关报道，在“浦江1号”良种的基础上，通过两代低氧胁迫构建了耐低氧F2群体。F2群体性成熟后建立自交F3和雌核发育F3群体，此外针对雌核发育F3群体进行了胚胎发育观察，DNA含量、染色体核型分析。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种耐低氧团头鲂的构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种耐低氧团头鲂的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤：

(1)构建耐低氧F1群体：团头鲂低氧胁迫选育出耐低氧F1群体；

(2)构建耐低氧F2群体：以耐低氧F1群体团头鲂为亲本构建F2家系，F2家系1龄阶段进行低氧胁迫养殖，2龄阶段常氧养殖；

(3)构建耐低氧F3群体：以耐低氧F2群体团头鲂为亲本构建自交F3群体，或以耐低氧F2雌性团头鲂为母本，用紫外灭活的鲤鱼精子诱导构建团头鲂减数、有丝分裂雌核发育F3群体。

优选地，步骤(1)为团头鲂“浦江1号”F9代低氧胁迫选育出耐低氧团头鲂F1群体。

优选地，步骤(2)中低氧胁迫养殖方法为：养殖车间顶棚为倒V结构，由彩钢板与透明塑料板材料构成，室内与外界空气流通不畅，室内温度较高，池内水体溶解氧持续偏低，形成对团头鲂幼鱼的低氧胁迫。

优选地，步骤(2)中F2家系1龄阶段进行为期1年的低氧胁迫养殖，低氧胁迫养殖时溶解氧浓度为2～4.5mg/L。

优选地，步骤(3)为：繁殖期前3个月，从耐低氧F2群体中挑选体征正常、色泽鲜明、体质健壮、性成熟特征明显的团头鲂进行专池精养，合理投喂饲料，促进性腺发育；到了繁殖季节，水温稳定在24～25℃以后，开始人工催产建立耐低氧F3自交群体。

优选地，鲤鱼精子的紫外灭活方法为：用紫外照射鲤鱼精液过程中实时检测精子活性，精子活性在20～30％时停止照射，完成灭活处理。

优选地，鲤鱼精子的处理方法为：擦干雄鲤鱼腹部和泄殖孔周围的水分，采用腹部挤压法和吸管吸取采集新鲜精液；以3:1的比例加入Hank’s溶液稀释精液，薄层铺在大玻璃培养中，并置于垫有冰袋的摇床上，距离15cm用两支6w的紫外灯照射处理6～8min，照射过程中实时检测精子活性，精子活性在20～30％时停止照射，完成灭活处理。

优选地，步骤(3)为：用紫外灭活后的鲤鱼精液对团头鲂卵子授精，授精2～3分钟后开始4℃冷休克20～25分钟，冷休克处理后的胚胎流水孵化，获得耐低氧减数分裂雌核发育F3群体鱼苗。

优选地，步骤(3)为：用紫外灭活后的鲤鱼精液对团头鲂卵子授精，授精25～30分钟后开始4℃冷休克20～25分钟，冷休克处理后的胚胎流水孵化，获得耐低氧有丝分裂雌核发育F3群体鱼苗。

优选地，繁殖时采用HCG与LHRH-A2混合注射进行人工催产，团头鲂雄鱼注射剂量照团头鲂雌鱼减半，雄鲤鱼注射剂量为团头鲂雌鱼的四分之一。

本发明优点在于：

1、本发明培育出了团头鲂耐低氧新品种，与团头鲂“浦江1号”相比，耐低氧团头鲂自交F3、减数和有丝分裂雌核发育F3群体的耐低氧能力显著提高。

2、本发明培育的耐低氧F3群体相对于普通鱼体现了生长优势，且生长优势性状稳定遗传与累积。

3、本发明培养的自交F3群体保持了较高的遗传杂合度，表现为较高的多态性；减数和有丝分裂雌核发育F3群体能显著加快团头鲂基因的纯合速度，使控制优良性状的基因快速纯合化。

附图说明

附图1：生长快团头鲂耐低氧F2家系群体VIE荧光标记。

附图2：不同低浓度溶氧环境下月总增重。

附图3：不同低浓度溶氧环境下日平均增重。

附图4：不同低浓度溶氧下平均体高的变化。

附图5：不同低浓度溶氧下平均体长的变化。

附图6：体长与体重的关系。

附图7：雌核发育团头鲂早期胚胎发育图。A-V正常发育，a-c畸形发育，U为V的头部放大。A二细胞期，B四细胞期，C十六细胞期，D三十二细胞期，E六十四细胞期，F囊胚早期，G椭形期，H球形期，I-J穹顶期，K囊胚晚期(30％外包)，L原肠早期(50％外包)，M-N原肠中期(70％-80％外包)，O原肠晚期(90％外包)，P-S体节期，T-U咽囊期，V孵化后期。

附图8：减数分裂雌核发育(左)、有丝分裂雌核发育(右)团头鲂DNA含量。

附图9：减数分裂雌核发育团头鲂(左)、有丝分裂雌核发育(右)团头鲂染色体图(2n＝48)。

附图10：团头鲂低氧胁迫装置示意图。

附图11：不同团头鲂群体部分个体在的Me.Am.-1位点电泳图谱。1-6：团头鲂“浦江1号”(TPJ1)；7-12：耐低氧团头鲂自交F3(TN)；13-18：耐低氧团头鲂减数分裂雌核发育F3(TNM)；19-24：耐低氧团头鲂有丝分裂雌核发育F3(TNDH)。

附图12：不同团头鲂群体的UPGMA聚类图。

附图13：团头鲂LOE比较柱状图。

附图14：耐低氧F3群体团头鲂鳃组织电镜扫描观察。图A-D为常氧对照组，图E-H为低氧胁迫4天实验组，图I-L为低氧胁迫7天实验组；扫描放大倍数为750。

附图15：耐低氧F3群体团头鲂鳃组织石蜡切片图。图片均为HE染色。图A-D为常氧对照组，放大20倍；图E-H为低氧胁迫4天实验组，放大40倍。图I-J为低氧胁迫7天实验组，放大40倍。

附图16：耐低氧F3群体团头鲂肝脏组织石蜡切片图。图片均为HE染色。图A-D为常氧对照组，放大20倍；图E-H为低氧胁迫4天实验组，放大40倍。图I-L为低氧胁迫7天实验组，放大40倍。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1耐低氧团头鲂F3新品系研制

1实验材料、试剂和仪器

1.1实验材料

本实验所有实验鱼的养殖及其繁殖、选育等均在上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心完成。2012年5月至2013年5月，团头鲂“浦江1号”F9代养殖在4号大塘(4.5亩)，由于池塘渗水导致平均水位低至0.8米，2012年7月26日，天气闷热，温度由27℃骤升至36℃，9月5日天气阴转暴雨，温度由28℃骤降至22℃，导致池塘平均溶解氧低至0.8mgO₂L^-1，历经这两次天然低氧胁迫，选育出耐低氧F1群体(表2)。2013年6月，选择形态良好、色泽鲜明且性腺发育成熟的耐低氧F1群体团头鲂为亲本构建100个F2家系。F2家系1龄阶段在室内水泥池进行为期1年的低氧胁迫养殖，选留形态标准、生长快速的个体，2龄阶段放室外土塘(面积4-5亩)养殖。2015年6月繁殖期间，选择选择形态良好、色泽鲜明且性腺发育成熟的耐低氧F2群体团头鲂为亲本构建自交F3群体。同时选择形态良好、色泽鲜明且性腺发育成熟的耐低氧F2雌性团头鲂为母本，用经紫外灭活的鲤鱼精子诱导构建团头鲂减数、有丝分裂雌核发育F3群体。繁殖实验均采用HCG与LHRH-A2混合注射进行人工催产，雄鱼注射剂量照雌鱼减半。鱼鳍样品均置无水酒精中于-20℃保存备用。

1.2实验试剂

(1)繁殖实验：LRH-A2、HCG(催产用激素)，Hank’s液，0.75％的生理盐水，超纯水，无水乙醇。

(2)核型分析：植物凝血激素PHA(美国Sigma)、肝素钠、秋水仙素、NaCl、KCl、NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、Giemsa染液、甘油、CH₃OH、无水乙醇、冰乙酸(上海生工生物工程有限公司)。试剂配制方法如下：

a)0.75％生理盐水：7.5g NaCl固体溶于l000ml超纯水，121℃高压灭菌30min；

b)4mg/ml PHA：4mg PHA粉末溶于1ml灭菌超纯水；

c)1mg/ml秋水仙素：1mg秋水仙素固体溶于1ml 0.75％无菌生理盐水；

d)0.5％KCl低渗溶液：0.05g KCl固体溶于10mL超纯水，灭菌；

e)磷酸缓冲液(PBS)：[36mlA液+14mlB液]，PH＝7.2；

f)A液：取35.82g Na₂HPO₄·12H₂O溶解于500ml的超纯水中；

g)B液：取6.242g NaH₂PO₄·2H₂O溶解于200ml的超纯水中；

h)Giemsa工作液：将Giemsa母液用磷酸缓冲液(PBS)稀释10倍即可；

i)卡诺氏固定液：将甲醇、冰醋酸以3：1的比例配制，现配现用。

(3)DNA含量测定：细胞核提取液DAPI、鞘液、清洗液、去蛋白液(德国Partec)。

1.3主要仪器

4℃药品保存箱(青岛海尔特种电器)、-20℃冰箱(青岛海尔特种电器)、低温恒温液浴循环槽(杭州三浦精密仪器)、气浴恒温振荡器(上海梅香仪器)、超纯水系统(上海和泰仪器)、SMZ-1500显微镜(日本Nikon公司)、电子天平(瑞士Mettler Toledo)、pH计(上海圣科学仪器)、高温高压灭菌锅(上海三申医疗器械)、倍性分析仪(德国Partec)、溶氧仪(美国YSI)。

2方法

2.1耐低氧F1群体构建

2011年5月繁殖出团头鲂“浦江1号”F9代，同年12月用活水运鱼车转运至上海海洋大学团头鲂遗传育种中心。4-6号塘(各4-5亩)保种、养殖。2012年，夏季温度骤升和秋季温度骤降造成4号亲本保种塘两次缺氧泛塘，一些耐低氧能力强的个体得到保留，构成耐低氧新品种选育的F1代奠基群体，共402尾(表2)。

2.2耐低氧F2群体家系建立

(1)家系建立

如表1所示，结合实际情况，在A1-A12、A17-A28等24个室内水泥池子分别放入耐低氧团头鲂F1亲本2雌×2雄(22组)、3雌×2雄(2组)，共建立100个家系。

2013年5月30-6月1日，清理室内24个水泥池(长、宽、高分别5米、3米、1.2米)，加入静置净化后的水至水深约1米。每个池子各放一根PVC管，各系6-8挂干净网片。6月2日下午，亲鱼塘拉网后挑取形态正常、色泽鲜明、性腺发育成熟的耐低氧F1团头鲂，用黑布夹运至室内养殖车间，注射激素后放入准备好的水泥池中，开微量流水冲击刺激。6月3日凌晨2:00左右，各池内雌雄团头鲂开始追逐，雌鱼陆续排卵并受精(截止下午4:00，8个池子雌鱼仍没产卵，检查具体情况后，对雌鱼进行了人工授精或注射第二针激素)。截止6月4日上午8:00，所有池子网片上均见粘有受精卵。

表1团头鲂耐低氧家系选育计划表

(2)鱼苗孵化、亲鱼鱼鳍样品采集与亲本产后保护

6月4日雌鱼全部产卵完以后，排去池内部分水，捞出亲本，注射庆大霉素，剪取胸鳍于无水乙醇保存，注射电子标记，记录雌鱼排卵情况，放黑布夹子运至室外B3水泥池暂养。亲鱼捞出后，加微量流水，至6月7日各F2家系均陆续出苗，观察孵化情况并详细记录。

(3)F2团头鲂家系幼鱼培育

团头鲂各家系孵化出苗之后，按照不同生长阶段先后饲喂豆浆、枝角类、桡足类，活体卤虫，小麦粉、豆粕分，细碎沉性饲料，适口膨化饲料等。每个池子放同年繁殖的锦鲤、鲢、鳙各5尾进行水质调控。

(4)F2团头鲂家系筛选

2013年6月6日出苗至8月26日期间，先后用鱼苗专用网，0.5cm、0.8cm、1cm鱼苗筛子筛选生长快的鱼留在原池培育。期间每晚20:00至次日6:00用高压空气压缩机通过纳米增氧盘进行底部增氧。

(5)耐低氧F2团头鲂家系群体VIE标记、分池饲养

低氧胁迫养殖1年后，选择每个家系池内生长快的个体，称重，在头部、背鳍等透明外表皮内注射VIE荧光标记，标记完后放大塘(面积4.5亩)饲养。

2.3耐低氧团头鲂F2群体低氧胁迫选育

由于养殖车间顶棚为倒V结构，彩钢板与透明塑料板材料构成，室内与外界空气流通不畅。室内温度较高，池内水体溶解氧持续偏低，自然形成对团头鲂幼鱼为期一年(2013年8月26日至2014年8月26日)低氧胁迫。2013年8-9月期间，选择A5、A7、A9、A10作为实验点，每天在8-9h、13-14h与18-19h三个时间段对水泥池内水温(℃)和中下层溶解氧DO(mg O₂L^-1)进行测定和记录。

2.4耐低氧团头鲂F2群体生长对比及性状测量

家系低氧胁迫培育期间，尽量保持每个家系群体的水温、饵料等条件一致。对照组置室外水泥池正常养殖。仔鱼出膜养殖4.5个月、6.5个月、10.5个月后，从各个池内随机挑取30-60尾团头鲂，测定体长、体高、体重等生长指标，记录并统计分析显著性差异。

一般采用相对增重率(养殖期间增加的重量/实际养殖时间)评价不同家系的生长性能，其计算公式为:AGRw(g/d)＝(W2-W1)/(T2-T1)式中W1、W2分别为T1和T2时的个体质量。在本次实验中，由于测量的时间间隔较短团头鲂的体征日增长量不是很明显，所以我们把月平均增长量来作为相对增重率、相对增长率与相对增高率，即相对增重率为g/m、相对增长率为cm/m、相对增高率为cm/m。为了更加全面评价生长指标，结合本实验的具体情况，对各家系群体生长评价，分类标准如下:

(1)月增重率包括AGRw-1、AGRw-2和AGRw-3。依据AGRw-1快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增重分别为大于2.50、2.00～2.50与小于2.00；依据AGRw-2快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增重分别为大于1.25、0.80～1.25与小于0.80；依据AGRw-3快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增重分别为大于1.00、0.50～1.00与小于0.50。

(2)月增长率包括AGR_L-1、AGR_L-2和AGR_L-3。依据AGR_L-1快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增长分别为大于1.80、1.60～1.80与小于1.60；依据AGR_L-2快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增长分别为大于0.16、0.10～0.16与小于0.10；依据AGR_L-3快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增长分别为大于0.30、0.20～0.30与小于0.20。

(3)月增高率包括AGR_H-1、AGR_H-2和AGR_H-3。依据AGR_H-1快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增高分别为大于0.75、0.68～0.75与小于0.68；依据AGR_H-2快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增高分别为大于0.10、0.05～0.10与小于0.05；依据AGR_H-3快速生长、较快生长、一般生长家系群体月增高分别为大于0.18、0.06～0.18与小于0.06。

最后，根据各家系群体在上述9个生长指标分类中的累积和叠加情况分别筛选出综合评价为生长快速、生长较快和生长一般家系群体。

2.5耐低氧团头鲂F3自交群体构建

在2015年繁殖期前3个月，从耐低氧F2群体中挑选体征正常、色泽鲜明、体质健壮、性成熟特征明显的团头鲂进行专池精养，合理投喂饲料，促进性腺发育。到了繁殖季节，水温稳定在24～25℃以后，开始人工催产建立耐低氧F3自交群体。

消毒、清洗室外水泥池(5米宽×5米长×1.2米高)，加静置净化后的天然河水至水深0.8米。挑选32尾团头鲂雌鱼，入池前注射第一针A₂，剂量为4～5ug/kg，4h后注射第二针HCG和A₂混合液，剂量为HCG 800～1000IU/kg与A₂ 4～5ug/kg，同时注射团头鲂雄鱼24尾，剂量照雌鱼减半。注射激素后，保持少量流水冲击刺激。约注射激素10h以后，雌雄亲本开始互相追逐，捞出亲本，用干毛巾吸干体表及腹部的水分，采用腹部挤压法收集4尾团头鲂卵子至干净干燥的白搪瓷盆中，同样方法采集3尾团头鲂精子，用干净干燥羽毛轻轻搅匀，加入适量净化后的清水进行人工受精。受精以后将受精卵导入滑石粉悬浮液中脱粘。将脱粘以后的团头鲂受精卵转移至孵化桶中进行流水孵化，获得耐低氧团头鲂自交F3群体鱼苗。采集完亲本精、卵子后，剪取亲本胸鳍样品于无水乙醇中-20℃保存，注射电子芯片与庆大霉素注射液后放回培育池养护。

为了统计受精率、孵化率以及成活率，在直径10cm的玻璃培养皿中进行孵化和观察实验。记录卵子总数、被激活卵子数、出苗数及孵化出苗1周后健康鱼苗数。受精率＝(被激活卵子数目/卵子总数)×100％，孵化率＝(出苗数/卵子总数)×100％，成活率＝(健康苗/卵子总数)×100％。

2.6耐低氧团头鲂F3雌核发育体群体构建

在2015年繁殖期前3个月，挑选体征正常、色泽鲜明、体质健壮、性成熟特征明显的耐低氧F2团头鲂雌鱼及雄性鲤鱼进行专池精养，合理投喂饲料，促进性腺发育。到了繁殖季节，水温稳定在24～25℃以后，开始进行人工催产。

70尾团头鲂雌鱼入产卵圆池之前先注射第一针A₂，剂量为4～5ug/kg，4h后注射第二针HCG和A₂混合液，剂量为HCG 800～1000IU/kg与A₂ 4～5ug/kg，同时注射雄鲤鱼，剂量为团头鲂雌鱼的四分之一。注射激素后，保持少量流水冲击刺激。约注射激素10h以后，轻微挤压团头鲂腹部有成熟卵子顺畅排出时，将团头鲂亲本捞出用干毛巾擦干腹部和泄殖孔周围的水分，采用腹部挤压法收集卵子于洁净干燥的白瓷盆中。同时将鲤鱼雄鱼捞出，用干毛巾擦干雄鲤鱼腹部和泄殖孔周围的水分，采用腹部挤压法和吸管吸取采集新鲜精液。以3:1的比例加入Hank’s溶液稀释精液，薄层铺在大玻璃培养中，并置于垫有冰袋的摇床上，距离15cm用两支6w的紫外灯照射处理6～8min，照射过程中实时检测上述精子活性，精子活性在20～30％时停止照射，完成灭活处理。

将适量经紫外灭活后的鲤鱼精液加入盆中，用干净干燥的羽毛轻轻搅拌均匀，30秒后加适量清水继续搅拌激活受精，后倒入滑石粉悬浮液并搅拌脱粘。“授精”2～3min或25～30min后置于4℃水浴20～25min，冷休克处理后的胚胎置孵化桶中流水孵化，分别获得耐低氧减数分裂和有丝分裂雌核发育F3群体鱼苗。亲本经剪取胸鳍样品、注射电子芯片和庆大霉素注射液后放回培育池养护。

2.7耐低氧团头鲂雌核发育F3群体胚胎发育观察

取三个玻璃培养皿，分别放入150-200个胚胎，每隔2h，更换曝气充分的自来水，水温维持在26±1℃。合子期至囊胚期，观察频率5min；原肠期和体节期，观察频率10min；咽囊期、孵化期及早幼期，观察频率为1h。使用Nikon SMZSOO体视镜对胚胎进行拍摄记录。

2.8耐低氧团头鲂雌核发育F3群体倍性检测与染色体核型分析

(1)倍性检测

用肝素钠浸润注射器及针头抗凝，从减数和有丝分裂雌核发育团头鲂脊柱尾静脉采血，将3～5μL血样加入1ml DAPI染液中，避光染色30s，染色后通过500目纱布过滤到上样管中。用Partec倍性分析仪进行了DNA含量检测，检测到约5000个细胞即停止检测。以“浦江1号”团头鲂自交二倍体为参照，检测样本数均大于10，最后取平均值。

(2)染色体制备与核型分析

染色体制备方法具体步骤如下：

①实验鱼室温暂养3天，不投喂。

②注射PHA：下午4点注射，每管PHA用2ml鱼用生理盐水稀释(灭菌0.75％NaCl)，根据鱼体重按照0.5ml/50g鱼的用量进行注射。

③注射秋水仙素(母液浓度1mg/ml)：第2天上午8点注射，剂量为1-2ug/g鱼体重，注射体积控制在0.2ml内。

④解剖：注射秋水仙素3h后，剪断鱼两侧鳃耙及鱼尾，放水中游动放血10min；解剖，取头肾，置鱼用生理盐水中漂洗，去除表面血液。

⑤低渗：头肾置含4ml鱼用生理盐水的培养皿中，用2把箭头镊子反复撕扯，直至淋巴细胞充分释放；将细胞悬浮液用300目筛网过滤转移至离心管中，1200转离心5分钟，弃上清；加入6ml现配的0.5％KCl低渗液(37℃预热)，吹打混匀，于37℃静置低渗60min；低渗结束后，1200转离心5分钟，弃上清。

⑥固定：加入6ml现配冰冻的(-20℃)固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)，用吸管小心混匀，室温静置固定20min，1200转离心5分钟，弃上清。重复固定、离心两次；最后，加入适量的冰冻固定液(1-2ml)，混匀后滴片。

⑦滴片：新玻片浸泡于无水乙醇中1天以上，使用前用干净纱布按同一个方向擦干，然后放于无菌水中，在-20℃冰箱中放置30min，待水面表层冻结后，玻面朝上取出玻片(尽量在玻面上保留冰水，有利于染色体展开)。用吸管在玻片滴三滴，滴管距玻片60公分以上(需操作练习)。

⑧干燥：玻片倾斜放置于搪瓷盘沿上，室温自然干燥或37℃烘箱放置1h烘干。

⑨染色：玻片正面朝上，平行架于两根长玻璃棒上(防止染色液渗于玻片反面)，滴上约2ml 4％Giemsa染色液(用PH＝7.2的PBS稀释，现配现用)，平铺，室温条件下染色15分钟，然后用超纯水轻轻冲洗。玻片倾斜放于搪瓷盘上，37℃烘箱放置1小时烘干后即可镜检。

⑩镜检：先用低倍物镜观察，找出清晰、分散良好的分裂相，再用油镜观察，调整亮度和位置，拍照并保存。

3结果

3.1耐低氧团头鲂F1群体构建

如表2所示，团头鲂“浦江1号”F9代历经夏季温度骤升和秋季温度骤两次天然低氧胁迫，剩余402尾耐低氧能力强的个体，构成耐低氧新品种选育的F1代奠基群体。

表2耐低氧F1选育情况统计

3.2耐低氧团头鲂F2群体建立

3.2.1耐低氧F2家系建立

挑选个体较大、体形标准的团头鲂雄鱼49尾，雌鱼49尾，其中第一次催产后40尾全产、6尾半产、3尾不产(表3)。通过腹部挤压将半产的雌鱼体内剩余成熟卵子及同组合雄鱼精子挤出人工授精。对不产的母本进行二次催产，同样方法人工授精。自然产与人工授精共建立100个耐低氧F2家系。繁殖后只有1尾父本(2.0％)死亡，而母本有27尾(55.1％)死亡(表3)。表明人工催产对母本损害较大，今后繁殖过程中需尽量挑取性腺发育成熟的雌鱼做母本，产后需加强养护。

表3团头鲂耐低氧家系建立第一次催产母本产卵及亲本存活情况表

3.2.2耐低氧F2家系群体筛选

2013年6月6日至8月26日，经过几次筛选后，每个池子内留下生长较快的团头鲂，具体数量统计见表4。从表中数目可见，24个家系群体的孵化率、存活率、生长速率以及耐低氧能力存在很大的差异。经鱼苗网拉网筛去大部分鱼苗，保证饲养密度相对一致，在同样的温度和饲喂条件下，按同样的规格鱼筛筛选后，符合规格的鱼的数目显示出，耐低氧能力强且生长较快的家系群体存活下来越多，该家系群体性状更优良。

表4耐低氧F2家系群体筛选统计

3.2.3耐低氧F2家系群体生长性状筛序及VIE标记

在筛选留下来的各家系群体中挑取生长最快的个体进行群体标记。A1-A4、A17-A21八个池子鱼规格普遍偏小，故未标记。其余16家系群体用1cm筛子筛选出符合规格的个体进行标记，平均净重11.01～30.83g(表5)，结合不同色荧光和标记位置每一个群体家系按一种位置与颜色组合进行VIE标记(图1)，共标记903尾。

VIE标记之后，二龄阶段放大塘养殖，最后挑选出生长快、体型良好、色泽鲜明、性腺发育成熟度好720尾构成耐低氧F2代群体。

表5室内耐低氧家系群体VIE标记与生长测定情况

3.3耐低氧F2家系生长性状差异分析

团头鲂各家系群体在三个不同生长阶段的体重、体长和体高平均值统计见表6。大部分测量尾数为50-60尾，少部分测量尾数较少但均大于30尾。由表可见，三次测量结果都显示出对照组的体长、体重和体高平均值分别是24个家系群体平均值的三倍左右。

表6团头鲂各家系群体不同生长阶段的平均生长量

团头鲂不同家系群体的生长性状统计见表7。依据AGRw-1评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为5个，分别为15号、16号、3号、2号和14号，较快生长家系群体8个，分别为13号、6号、4号、22号、23号、5号、21号和24号其余11个均为一般生长家系群体；依据AGRw-2评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为7个，分别为14号、13号、4号、2号、3号、16号和21号，较快生长家系群体6个，分别为12号、20号、15号、18号、23号和10号，其余11个均为一般生长家系群体；依据AGRw-3评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为3个，分别为5号、19号和6号，较快生长家系群体8个，分别为20号、7号、8号、24号、17号、15号、11号和23号，其余13个均为一般生长家系群体。

依据AGRL-1评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为3个，分别为15号、3号和16号，较快生长家系群体9个，分别为2号、14号、13号、6号、22号、4号、21号、24号和7号，其余12个均为一般生长家系群体；依据AGRL-2评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为14号、20号、21号和23号，较快生长家系群体8个，分别为16号、15号、2号、18号、13号、4号、24号和12号，其余12个均为一般生长家系群体；依据AGRL-3评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为5号、6号、8号和7号，较快生长家系群体6个，分别为20号、24号、11号、19号、23号和17号，其余14个均为一般生长家系群体。

依据AGRH-1评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为15号、3号、2号和16号，较快生长家系群体9个，分别为14号、13号、4号、6号、22号、12号、21号、23号和5号，其余11个均为一般生长家系群体；依据AGRH-2评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为7号、12号、2号和14号，较快生长家系群体5个，分别为4号、13号、21号、16号和3号，其余15个均为一般生长家系群体；依据AGRH-3评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为5号、17号、20号和19号，较快生长家系群体6个，分别为24号、6号、23号、8号、11号和23号，其余14个均为一般生长家系群体。

根据各家系群体在上述9个指标分类中的累积和叠加情况，可以得知2、3、14、15、和16号等5个家系群体生长快速，4、6、13、21、23、24号等6个家系群体生长较快，其余家系群体生长一般(2-8)。

表7团头鲂各家系群体平均月增重量(g/M)、平均月增长量(cm/M)与平均月增高量(cm/M)

注：阴影标注为各指标下快速增长。

3.4低氧胁迫对F2家系生长性状的影响

(1)水泥池溶解氧浓度监测结果

在温度相同的情况之下，顶棚高度和透明度不同导致室内水泥池光照强度不同，水体内含浮游动植物不同，进而导致各水泥池溶解氧浓度不同。从8～9月期间溶解氧溶度的测定结果显示，室内水泥池内团头鲂长期处于低氧胁迫(2～4.5mg/L)环境下生长。从表8可以看出：(1)室内水泥水中溶解氧在中午13～14h时最高，平均在1～7mg/L之间；在8～9时最低，平均在0.8～5mg/L之间；(2)A9、A10水中溶解氧变化幅度较大，在13～14时和18～19时温度较高，分别在2～7mg/L之间和2～6.5mg/L之间；A5、A7、A9、A10四个池子的平均溶氧浓度分别为4.38mg/L、1.97mg/L、3.98mg/L、2.63mg/L。

表8室内养殖车间水泥池溶解氧溶度情况

(2)室内耐低氧团头鲂F2家系群体的体长、体重与体高测定

以A5、A7、A9、A10为溶氧监测试验点，相应分析该四个家系群体的体长、体重与体高三个生长指标的平均水平(表9)。

表9室内团头鲂耐低氧家系在低氧胁迫环境中生长指标平均值

(3)不同低溶氧浓度环境下增重变化

由图2、图3可见，在低氧胁迫环境下，随着溶解氧浓度的升高，团头鲂家系群体8～9月间月总增重(1.33、1.65、1.68、1.79g/尾)和日平均增重量(0.0443、0.055、0.056、0.0597)均有上升趋势，但增加幅度不是很明显。

(4)不同低溶氧浓度条件下体高、体长的变化

由图4、图5可见，在低氧胁迫环境下，随着溶解氧浓度的升高，团头鲂家系群体8～9月间只有A10家系群体平均体高上升，其余三个家系群体的平均体高下降；而4个家系群体平均体长均增加(0.01～0.13cm)，A10家系群体幅度最大，为0.13cm。

(5)体长与体重的关系

对A7的体长与体重测量数据分析，如图6可见，体重与体长可用乘幂关系来表示y＝0.033x^2.850，R²＝0.946。

3.5耐低氧团头鲂F3群体构建

3.5.1人工催产

2015年5月繁殖季节，从耐低氧亲本培育池中挑选体征正常、色泽鲜明、体质健壮、性成熟特征明显的团头鲂雌鱼92尾、雄鱼56尾及鲤鱼雄58尾，注射激素人工催产。约注射激素10h以后，轻轻挤压雌鱼腹部，有成熟卵子排出时开始进行人工授精。迅速收集团头鲂卵子及精子后用干净干燥羽毛搅拌混匀，卵子平均分成三份，分别用于自交、减数和有丝分裂雌核发育。

3.5.2耐低氧团头鲂自交

采集团头鲂成熟卵子与精子进行法人工授精。将受精卵倒入滑石粉悬浮液中搅拌脱粘。将脱粘以后的团头鲂受精卵转移至孵化桶中进行流水孵化，获得耐低氧团头鲂自交F3群体鱼苗。受精率、孵化率、存活率见表10。

表10团头鲂♀×♂受精率、孵化率、成活率统计

3.5.3耐低氧团头鲂雌核发育

2015年5月繁殖季节，从耐低氧F2亲本池中挑选体征正常、色泽鲜明、体质健壮、性成熟特征明显的团头鲂雌鱼92尾，以及雄鲤鱼34尾，注射激素进行人工催产。约注射激素10h以后，轻轻挤压雌鱼腹部，有成熟卵子排出时可以开始采集卵子。同时收集鲤鱼精子并加入3倍体积的Hank’s液，平薄铺满洁净干燥的玻璃培养皿，置冰上在30w紫外灯下紫外灭活6分钟(灭活过程中间歇性摇晃培养皿几次以便精子灭活充分)。将灭活后的鲤鱼精子加入团头鲂卵子中进行人工受精。“授精”2～5min或25～30min后置于低温恒温液浴循环槽中4℃水浴20～25min，冷休克处理后的胚胎置孵化桶中流水孵化，分别获得耐低氧减数分裂和有丝分裂雌核发育F3群体鱼苗。出苗后转移至提前加水、泼洒豆浆、已含枝角类和桡足类的水泥池发塘。出膜3个月后统计存活数量，减数、有丝分裂雌核发育F3群体数量分别为225尾和775尾。

为了探究雌核发育最佳冷休克诱导起始时间及处理时间，设置了不同的实验组，并统计授精率、孵化率、存活率，结果见表11与表12。

表11团头鲂♀×鲤鱼♂减数分裂雌核发育受精率、孵化率、成活率统计

表12团头鲂♀×鲤鱼♂有丝分裂雌核发育受精率、孵化率、成活率统计

从上面两个表的统计结果分析，发现有丝分裂雌核发育的授精率、出苗率和存活率均比减数分裂雌核发育的大且均为2～3倍，这与我们实验所得群体数量大小比值接近。雌核发育成功的关键在与把握诱导的起始时间和处理持续时间。根据我们实验的结果可知，在受精2～2min或25～30min开始持续冷休克22～25min，是团头鲂减数、有丝分裂雌核发育的最佳条件，最高受精率、出苗率和存活率达到53.9±6.8％、8.9±0.4％、2.8±0.7％和76.1±3.1％、45.1±4.4％、7.9±2.4％。

3.5.4耐低氧团头鲂F3鱼苗培育

出苗后转移至提前加水、泼洒豆浆、已含枝角类和桡足类的水泥池发塘。2周以后晒除大部分鱼苗以控制养殖密度，投喂活体卤虫。

3.6耐低氧团头鲂F3雌核发育群体胚胎发育观察

参照正常斑马鱼和团头鲂的早期胚胎发育进程，雌核发育团头鲂胚胎发育进程见图7。用紫外灭活的鲤鱼异源精子激活正常团头鲂卵子受精，冷休克条件下通过抑制第二极体排出或第一次有丝分裂使染色体加倍。在冷休克条件处理下，受精率相对较低，授精成功的胚胎大部分能够正常发育(见图7)，“授精”后胚胎发育时期同样分为卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期、尾芽期、心跳期和孵化期等。

团头鲂受精卵黏性性卵，激活后，迅速吸水膨胀，卵膜半透明。受精后约30min，胚胎进入卵裂期，卵裂球由一个纵裂均匀分为两个(图7A)，然后依次纵裂分为4个、8个、16个(图7B-D)，水平分裂形成32、64个分裂球(图7E-F)。囊胚早期(4.5hpf)，细胞持续分裂，分裂球间无明显界线(图7F)，随后胚盘变平，呈椭球型(5.45hpf，图7G)。到囊胚中期，胚胎整个呈球形(6.15hpf)，此时胚盘与卵黄之间为水平界线(图7H)。受精大约4.83h，外包逐渐开始，当外包至50％时(5.45hpf)，进入原肠期。此阶段细胞代谢旺盛，耗氧量大，在动物极可见胚环、胚盾(图7K-L)，发育至原肠胚晚期时，基本外包完全(12.75hpf，图7O)，进入神经胚期后胚孔闭合(13.3-14.5)，并由体节期进入尾芽期(图7P-T)(16.74-21.75hpf)，此阶段共形成46对体节，Kuperffer囊、脑神经元发育完成，前、中、后脑由神经管前端分化完成。受精后约23.5h，胚胎进入咽囊期，各器官继续发育(图7U)，在孵化期(48hpf)时，胸鳍、腮弓等产生(图7V)，此阶段鱼体基本处于静息状态。待受精后3天，鱼苗出膜后渐渐开始平游，并出现摄食行为。另外冷休克处理导致胚胎畸形发育的比率也比较高，发育形态主要表现为躯干弯曲(图7A-C)相比于团头鲂正常繁殖，经冷休克处理体诱导的雌核发育胚胎的早期发育速度整体慢1.5个小时左右，这与以及条斑星鲽雌核发育比正常二倍体发育较缓慢的结果相一致。

3.7耐低氧团头鲂雌核发育群体DNA含量测定与染色体核型分析

用Partec流式细胞仪测定了减数、有丝分裂雌核发育团头鲂DNA含量。表13结果显示：减数、有丝分裂雌核发育团头鲂DNA平均相对含量为分别为50.44、50.38，与对照标准二倍体团头鲂的一致，应为二倍体(图8)。

表13减数、有丝分裂雌核发育团头鲂DNA含量

实验共获得减数、有丝分裂雌核发育团头鲂的染色体中期分裂相139、176个，其中染色体数为48的分裂相占总分裂相的87.1％、89.6％，染色体数目均与团头鲂亲本的染色体数目相同，雌核发育团头鲂均为二倍体(图9)。对中期分裂相的染色体进行核型分析，发现它们的染色体都是以中部着丝点染色体(m)、亚中部着丝点染色体(sm)和亚端部着丝点染色体(st)为主，在sm染色体中发现最大染色体。

4讨论

4.1耐低氧F2群体在低氧胁迫条件下的生长差异分析

(1)低氧胁迫下团头鲂生长快速家系群体的筛选与评价

低氧胁迫组实验组和常氧对照组的前后三次体长、体重及体高等三项生长指标的测量与统计显示，团头鲂各家系群体平均生长指标均有增长。对照组的生长指标平均值都是实验组的三倍左右，且根据9个生长指标的分类标准叠加和累积筛选出的快速生长家系群体(2、3、14、15和16号)的仍与对照组的差距非常大，说明低氧胁迫对团头鲂生长具有非常大的负面影响，这与高温、盐碱等逆境对鱼类生长的负面作用相似。根据团头鲂“浦江1号”良种体长/体高比2.1～2.2的标准，实验组和对照的体型都继承了父母本的优良遗传特征，低氧胁迫对团头鲂的体型特征没有不良影响。

对照组与实验组的生长指标的相对增长在三个生长阶段具有相同的规律，孵化出来至养殖4.5月阶段生长增长最快，第二阶段的2个月增长最慢，第三阶段的4个月增长居中。这与三个时间段的温度与摄食量有密切关系。实验过程中第一阶段摄食量/体重的比例最高，第二阶段的比例最低，第三阶段的比例居中，温度变化趋势也与此相同。通过比较生长指标均值和相对增长率，共筛选出5个快速生长家系群体(2、3、14、15和16号)，共20个家系，以及6个生长较快的家系群体(4、6、13、21、23、24号)，共28个家系，两者共占48％比例。

(2)低氧胁迫对团头鲂幼鱼存活率的影响

水体溶解氧DO值与温度密切相关。团头鲂正常生长需求溶解氧范围为5.5mg/L。根据现有研究报告，团头鲂的实验性致死溶解氧DO值为1.0±0.5mg/L(水温20～25℃)。本实验溶解氧为1.97～2.38mg O₂ L^-1(平均26.7℃)，3.98～4.38mg O₂ L^-1(平均11.7℃)为强烈低氧胁迫水平。

正常溶解氧培育的对照组存活率高达70.23％，接近室外池塘养殖存活率水平，但实验组存活率平均水平为4％(粗略统计)，与对照组的差距非常大。这与高温、盐碱等逆境对其他鱼类存活率的负面作用一致。

(3)耐低氧F2群体的构建

低氧胁迫下生长性状受到限制，但是存在分化。我们根据单环境因素控制原则，选择低氧胁迫条件下快速生长的个体注射VIE标记。标记后放大塘进行二龄阶段精养培育。根据生长性状再次筛选生长优势个体构成F2群体。这些选出的个体首先能够耐受低氧胁迫的单方面逆境处理，又能在不同溶氧条件下发挥出生长优势。

4.2雌核发育最佳条件探究

探究团头鲂雌核发育的最佳条件对团头鲂良种选育起到至关重要作用。目前，人工雌核发育面临量两大问题：(1)成活率偏低；(2)雌核发育后代鉴定困难。雌核发育后代可通过形态、生化分子技术、DNA含量测定、核型分析、SSR亲子鉴定等方法法鉴定。用异源远灭活精子激活雌核发育，不仅后代鉴定工作相对更为简单，而且后代成活率得到明显提高。

温度休克开始时间节点、休克处理持续时间长短是人工雌核发育成功的两个关键点，对此，在现有研究基础上我们探索了团头鲂高成活率的诱导条件。休克开始时间节点的把握在于观察绝大部分“受精卵”第一极体排出和第一次卵裂的时间节点，这与母本年龄、性程度度等均有关系。持续时间的长短的把握在于观察绝大部分的“受精卵”第一极体排出和第一次卵裂跨越时间，因为温度的变化会对胚胎发育有减缓或加速影响。

本次试验结果表明，减数、有丝分裂雌核发育最佳条件为：灭活受精6min激活卵子，受精2～3或25～30min后开始4℃冷休克20min。在此条件下团头鲂减数、有丝分裂雌核发育授精率分别为53.9±6.8％和76.1±3.1％，与团头鲂自交相比偏低，但是仍保持了较高的水平。出苗率分别为8.9±0.4％、45.1±4.4％与团头鲂自交相比相差很大，大批量胚胎发育过程中死亡原因是冷休克处理后胚胎发育至尾芽期时卵裂不均，细胞分化异常，从而导致夭折，或胚胎发育不足、卵膜溃烂等因素不能出膜而死亡。根据经验，温度越低，出苗率越低，所以耐低氧团头鲂雌核发育中我们采用4℃恒温处理。存活率分别为2.8±0.7％和7.9±2.4％，保持了较高水平，与自交相比分常低的原因是孵化期胚胎发育不足而畸形，出现脊索弯曲、心腔过大、心脑发育不健全等症状，这些胚胎无生存能力，一般出膜后二十四小时内也会死亡。

实施例2耐低氧团头鲂F3群体遗传多样性、生长及耐低氧性能分析

1实验材料、仪器和试剂

1.1实验材料

团头鲂“浦江1号”与耐低氧团头鲂F3群体均养殖在上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心。鱼鳍放无水乙醇，-20℃冰箱保存备用。遗传多样性分析采样情况见表14。

表14样品信息表

1.2主要试剂

(1)微卫星实验：海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、氢氧化钠、甲醛、过硫酸铵、40％聚丙烯酰胺、硝酸银、EDTA、Tris、TEMED、引物(上海生工生物工程有限公司)，10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶、氯化镁、dNTPs、蛋白酶K、DNAMarker(北京天根生化科技有限公司)，琼脂糖(上海玉柏生物科技有限公司)。试剂配制方法如下：

a)40％聚丙烯酰胺：丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺＝19：1；

b)10％过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于10ml超纯水中；

c)显影液：氢氧化钠12g溶于1000mL超纯水，加甲醛4mL；

d)银染溶液：0.5g硝酸银溶于500ml超纯水，加甲醛1mL；

e)0.6％的琼脂糖：0.24g琼脂糖于40ml超纯水中，加热溶解(现配先用)；

f)10×TBE电泳缓冲液：54g Tris base、27.5g硼酸、3.72g EDTA，加超纯水定容至500ml。

g)非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备：超纯水27.7ml、40％聚丙烯酰胺8.0ml、10×TBE4.0ml、10％AP280ul、TEMED40μl，混匀，灌胶后凝固2-4h。

(2)LOE测定：工业氧气，普通氮气(上海利旦工业气体)。

(3)电镜扫描：0.75％生理盐水、PBS缓冲液、无水乙醇(上海生工生物工程有限公司)，戊二醛、锇酸、醋酸异戊酯、叔丁醇(上海玉柏生物科技公司)。

(4)石蜡组织切片：无水乙醇、二甲苯、石蜡、苏木精、蒸馏水、氨水、伊红、4％多聚甲醛(上海生工生物工程有限公司)。

1.3主要仪器

-20℃冰箱(海信(北京)电器有限公司)、-80℃超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)、YC-1型层析4℃实验冷柜(北京博医康实验仪器有限公司)、电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、高温高压灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)、TS-1型脱色摇床(江苏省海门市麒麟医用仪器厂)、SA-1000red凝胶成像一体机(Alpha Innotech)、DYCZ-24A型双垂直电泳仪(槽)(北京六一仪器厂)、组织破碎研磨仪(上海净信实业有限公司)、PCR扩增仪(Eppendorf)、微量移液器(Eppendorf)、SmartSpecTM Plus分光光度计(Bio-Rad公司)、台式高速冷冻离心机(Thermo，Eppendorf)、水平电泳仪(北京市六一仪器厂)、Milli-Q Sythesis超纯水系统(上海瑞枫生物科技有限公司)、照相机(日本Nikon)、GPD-I-III型观片灯箱(江苏苏宏医疗器械有限公司)、SA-1000Red凝胶成像一体机(USA Alphainnotech)、SMZ-1500显微镜(日本Nikon公司)、Ⅲ型X射线胶片观片灯(江苏苏宏医疗器械)、pH计(上海圣科学仪器)、S-3400N日立扫描电子显微镜(日本Hitachi)、SC7620日立离子溅射仪(日本Hitachi)、石蜡组织切片机(德国Leica)、石蜡组织摊片机(德国Leica)、溶氧仪(美国YSI)。

2实验方法

2.1基因组DNA的提取与检测

参照天根生物科技有限公司海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取样品基因组DNA。用1.2％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测基因组DNA质量和浓度，保存于-20℃备用。

2.2微卫星引物

本研究从60对微卫星引物中筛选出20对扩增稳定且条带清晰的引物，SSR位点及引物信息(表15)。

表15微卫星引物特征

2.3微卫星引物PCR反应体系与扩增程序

反应体系10μL，包含5μL含染料的2×Taq PCR MasterMix(Taq DNA Polymerase：0.1U/μL；MgCl2：4mM；dNTPs each：0.4mM)，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，0.5μL模板DNA(30-50ng)，3.5μL ddH2O。PCR反应在Eppendorf Mastercycler ep gradients型PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，52-62℃，30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸10min。

2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳与数据分析

PCR产物在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，胶片大小为195mm(长)×120mm(宽)×1mm(厚)。产物上样量均为1μL，DNA Marker(pBR322DNA/MspI)上样量为0.5μL。电泳条件：电泳缓冲液为1×TBE，电压200V，电泳1.5-2h(具体时间根据PCR产物分子量大小而定)。电泳完成后，进行硝酸银染色，染色方法参照张倩倩等的方法进行。最后将胶片平铺于观片灯箱上，拍照并保存。

用Quantity One凝胶图像分析软件分析微卫星条带大小，根据每个个体产生的条带位置确定基因型。用Popgene(Version 1.32)软件进行分析，计算每个微卫星座位分别在4个群体中的等位基因数(Number of alleles，Na)和期望杂合度(Expectedheterozygosity，He)，并计算群体间的Nei’s遗传相似性(Genetic identity)和遗传距离(Genetic distance)，并基于该遗传距离利用MEGA 5.1软件对4个团头鲂群体进行基于非加权组平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)的树状聚类图的绘制。根据Botstein公式计算Hardy-Weinberg遗传偏离指数(d)，最后用Cervus3.0软件计算多态信息含量(PIC)。

2.5耐低氧团头鲂F3群体生长对比及性状测量

2015年8月11日，准备3个室外水泥池(5米宽×5米长×1.2米高)，每个池子从耐低氧自交F3群体、减数分裂雌核发育F3群体、有丝分裂雌核发育F3群体、团头鲂“浦江1号”群体中各挑取50尾团头鲂同池饲养。期间每晚20:00至次日6：00用高压空气压缩机通过纳米增氧盘进行底部增氧。所有鱼放入前称量始重，以后每隔一个月(9月11日、10月11日、11月11日)进行体重测量，记录并统计分析显著性差异。

2.6耐低氧团头鲂F3群体LOE测定

(1)团头鲂低氧胁迫：用图10的装置进行实验，温度与溶解氧值通过溶氧仪显示读取。团头鲂在缸中17.5～19.6℃常氧暂养1周后开始低氧胁迫。通过控制空气泵和氮气的进气大小调节使水体溶解氧浓度在4小时内减半，继续降低溶氧4小时内再减半，之后每半小时降低0.5。记录团头鲂失去平衡的时间。

(2)实验设计：以“浦江1号”做对照，每组实验处理12尾鱼(每群体3尾)(表16)。

(3)计算公式：PO_2i：倒数第二梯度溶氧溶度；

t_i：实验鱼失去平衡所用时间；t_ii：时间间隔30min；PO_2ii：溶氧下降梯度。公式参照文献。

表16 LOE实验设计

**p<0.05,***p<0.05.

2.7耐低氧团头鲂F3群体低氧胁迫下鳃电镜扫描观察

(1)取样：参照2.6，团头鲂禁食暂养3天后，取3尾鱼的鳃作为对照组样品，同时降低并维持溶氧为1.5±0.5mgO₂ L^-1，对剩下的鱼进行低氧胁迫4天。

(2)样品制备与电镜扫描：参照文献，取下鳃之后做好观察面标记，用1×PBS中漂洗数次后置2.5％戊二醛中4℃固定3h；用1×PBS漂洗3次，每次15min；用1％锇酸4℃固定2h；用1×PBS漂洗15min；用50％、70％、80％乙醇依次脱水，各15min；用80％乙醇脱水过夜；第二天，用90％、95％乙醇脱水，各15min；换醋酸异戊酯15min或叔丁醇15min；自然干燥、冷冻干燥或二氧化碳真空干燥；镀膜，电镜扫描。

2.8耐低氧F3群体低氧胁迫下鳃、肝脏组织石蜡切片观察

实验设计与取样与2.6一致，操作步骤如下：

(1)制作组织切片：将固定的团头鲂鳃、肝脏组织经过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片染色。

将组织置于75％乙醇中，脱水1h；

将组织取出，表面残余液体吸去，放在80％乙醇中，脱水处理2h；

将组织从80％乙醇中取出，吸去液体，放在95％乙醇中，脱水处理1h；

取出组织，置于100％乙醇中，脱水处理40min，洗2次；

将组织从乙醇中取出，吸去残液，置于50％乙醇+50％二甲苯混合液中，30min；

组织取出，置于二甲苯中，15min；

50％二甲苯和50％石蜡混合液，60℃烘箱，组织置于其中30min；

组织置于石蜡中，60℃烘箱，透蜡处理1.5h，2次；

包埋、修模、切片，切片厚度为4～5μm。保存于37℃恒温箱中。

(2)苏木精-伊红(HE)染色

1)将切片置于二甲苯中，脱蜡20min，2次；

2)取出后，置于50％二甲苯和50％乙醇中，浸泡10min；

3)将切片依次经过100％乙醇、100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇和灭菌超纯水中，各3min；

4)苏木素染色30min，流动的自来水缓慢冲洗20min；

5)1％盐酸水溶液中分化数秒褪色，置于灭菌超纯水中1min，然后用0.5％氨水中1min返蓝复染，然后再用灭菌超纯水洗1min；

6)将切片分别置于70％乙醇、80％乙醇和95％乙醇中，脱水处理2min；

7)置于伊红染液中，30s；

8)切片置于95％乙醇中，洗去余色，再用100％乙醇，洗2次，每次2min；

9)50％二甲苯和50％乙醇中，3min；

10)切片置于二甲苯中，2次，每次3min；

11)用中性树胶进行封片。

3结果

3.1耐低氧团头鲂F3群体遗传多样性分析

3.1.1微卫星位点电泳检测结果

本研究选用的20对微卫星引物在检测群体中均能扩增出稳定的PCR产物，位点Me.Am.-1在四个团头鲂群体部分样本中的检测结果见图11。

3.1.2SSR扩增结果

本研究共计筛选出了20对清晰且重复性好的的EST-SSR引物，利用这20对微卫星引物对团头鲂TN、TNM、TNDH及团头鲂“浦江1号”(TPJ1)共120尾样品进行扩增分析，团头鲂TN、TNM、TNDH及团头鲂“浦江1号”(TPJ1)4个群体分别扩增到78、71、69、85个等位基因，平均等位基因数(Na)分别为3.90、3.55、3.45、4.25，平均观测杂合度(Ho)分别为0.7853、0.3934、0.2768、0.8075，平均期望杂合度(He)分别为0.6491、0.5563、0.4870、0.6855，平均多态信息含量(PIC)分别为0.5695、0.4796、0.4181、0.6105，能够在分子水平上准确反映群体内的遗传关系，具体结果见表17。从这些遗传参数中可得出，这4个群体的遗传多样性由高到低依次为TPJ1＞TN＞TNM＞TNDH，即TPJ1对照群体的遗传多样性最高，TNDH群体遗传多样性最低。

表17四个团头鲂群群体在20个微卫星位点的多样性指数

注：TPJ1：团头鲂“浦江1号”，TN：团头鲂耐低氧群体，TNM：团头鲂耐低氧减数分裂雌核发育群体，TNDH：团头鲂耐低氧有丝分裂雌核发育群体。

3.1.3Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数

各位点的Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数(D)在-0.8412～0.9051间，各位点D平均为0.0127～0.6305之间。从群体来看，TPJ1群体和TN群体平均Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数为0.2150、0.2359，多数位点在这两个群体中表现为杂合子过剩。TNM群体和TNDH群体平均Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数为0.2595、0.4200，大多数位点在这两个群体中表现为杂合子缺失，纯合子过量，具体结果见表18。

表18四个团头鲂群体遗传偏离指数(D)

注：TPJ1：团头鲂“浦江1号”，TN：团头鲂耐低氧群体，TNM：团头鲂耐低氧减数分裂雌核发育群体，TNDH：团头鲂耐低氧有丝分裂雌核发育群体

3.1.4 Nei’s遗传距离和UPGMA聚类分析

用Popgene(Version 1.32)软件计算团头鲂4个群体间的Nei’s相似性和遗传距离，结果如表19所示。4个团头鲂群体间的Nei’s相似系数为0.8240-0.9281，遗传距离为0.0746-0.2236。其中，TNM群体与TNDH群体间遗传距离最小(0.0746)，遗传相似性最高(0.9281)；TPJ1群体与TNDH群体间遗传距离最大(0.2236)，遗传相似系数最小(0.7796)。基于不同群体间Nei’s遗传距离，利用MEGA5.1软件构建了4个团头鲂群体间的UPGMA聚类关系(图12)。结果显示，4个群体聚类成明显的两支，TPJ1和TN群体共同聚类成一个分支，而2个雌核发育群体(TNM和TNDH)共同聚类成另一个分支，表明TN群体和雌核发育群体(TNM和TNDH)间产生了一定程度的遗传分化。

表19团头鲂不同群体的Nei’s遗传相似性(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)

3.2耐低氧团头鲂F3群体生长性状对比分析

将出膜三个月的团头鲂耐低氧自交F3群体、减数分裂雌核发育F3群体、有丝分裂雌核发育F3群体、“浦江1号”群体中各挑取50尾团头鲂同池饲养，设计三个平行实验组。于9月11日、10月11日、11月11日进行体重测量，数据统计结果见表20。从表可知有丝分裂雌核发育F3群体生长最快，其次是减数分裂雌核发育F3群体，第三是自交F3群体，它们均比对照组团头鲂“浦江1号”生长要快。说明雌核发育F3及自交F3群体均保持了“浦江1号”良种的生长快优势性状。3个月生长对比试验期间，与团头鲂“浦江1号”的三个月平均增重相比，三个F3群体平均体重增长比率提升25％以上。

表20团头鲂耐低氧F3群体生长性状测量

**p<0.01

3.3耐低氧团头鲂F3群体LOE测定与分析

对耐低氧团头鲂F3群体及团头鲂“浦江1号”的LOE进行测定，统计结果见表21与图13。

表21团头鲂LOE测定结果(Mean±s.d.)

**p<0.01

3.4耐低氧团头鲂F3群体低氧胁迫下鳃电镜扫描观察与分析

耐低氧F3群体鳃组织电镜扫描结果见图14。从图可知，相对于常氧对照组(图中A-D)，低氧胁迫实验组鳃小片片间基质减少，鳃小片长度变大、宽度及其厚度变小，暴露在外的表面积明显增大。这个适应性生理变化有助于其在低氧环境下进行空气交换，摄入跟多的氧气，维持体内氧平衡和其他生理活动。

3.5耐低氧团头鲂F3群体低氧胁迫下鳃组织石蜡切片观察与分析

耐低氧F3群体鳃组织石蜡切片结果见图15。此结果与电镜扫描结果相吻合，相对于常氧对照组(图中A-D)，低氧胁迫实验组鳃小片片间基质减少，鳃小片长度变大、宽度变小，暴露在外的表面积也明显增大。

3.6耐低氧团头鲂F3群体低氧胁迫下肝脏组织石蜡切片观察与分析

肝脏组织石蜡切片结果见图16。对照组(图中A-D)未见明显肝脏损害，肝细胞密集且分布均匀，胞膜完整，胞浆丰富，胞核形态正常。低氧胁迫实验组(图中E-L)可见局部肝细胞胞膜破坏，胞浆略稀疏，细胞水肿，核固缩。

4讨论

4.1耐低氧F3群体遗传多样性分析

等位基因的数目(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态性信息含量(PIC)等遗传参数可从多个角度反映群体的遗传多样性和遗传潜力。并且，通常认为当PIC>0.5为高度多态位点，0.25<PIC<0.5为中度多态性位点，PIC<0.25为低度多态位点。本研究中TPJ1群体与TN群体的等位基因的数目(Na)为4.25、3.90，观测杂合度(Ho)为0.8075、0.7853，期望杂合度(He)为0.6855、0.6491，多态性信息含量(PIC)为0.6105、0.5695，说明TN群体较TPJ1群体的遗传多样性有所降低但不存在显著(p>0.01)差异，仍保持了较高的遗传杂合度，表现为较高的多态性(PIC>0.5)。TNM、TNDH群体的等位基因的数目(Na)为3.55、3.45、观测杂合度(Ho)为0.3934、0.2768，期望杂合度(He)为0.5563、0.4870，多态性信息含量(PIC)为0.4796、0.4181，TNDH群体的遗传多样性显著(p<0.01)低于TNM群体，表明诱导有丝分裂雌核发育群体相对于减数分裂可以得到更纯合的后代。而且2个雌核发育群体(TNM和TNDH)的遗传多样性显著(p<0.01)低于TPJ1和TN群体。这与刘海金诱导牙鲆有丝分裂雌核发育比减数分裂雌核发育能更有效获得纯合后代，并且两种雌核发育二倍体均比普通二倍体纯合度高的结论相符。从群体遗传学的角度考虑，雌核发育群体可视为经历了最极端的遗传瓶颈，雌核发育群体实际上为1尾或多尾雌鱼的后代，因此遗传多样性水平应明显降低。理论上雌核发育可以获得后代为纯合的个体，但实际操作中并不全是，刘海金等通过静水压抑制卵裂获得牙鲆的有丝分裂雌核发育后代，其平均杂合子比例为0.2338。刘海金等对同一条牙鲆的有丝分裂雌核发育后代进行遗传分析，表明有丝分裂雌核发育后代纯合度高，并且在10个微卫星位点实现了等位基因的完全纯合，无杂合个体出现。本实验的20个微卫星位点检测的团头鲂雌核发育后代既有纯合，也有杂合的，因为用于雌核发育的母本为92尾团头鲂，导致有丝分裂雌核发育后代纯合度不高，但雌核发育的遗传物质均来自于母本，群体遗传的多态性明显降低，雌核发育团头鲂的群体遗传纯合度已获得了明显提高。

Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数(D)，反映了Ho和He两者间的平衡关系，D越接近0，基因型的分布越接近于平衡状态，D为正时反映杂合子过剩，D为负时则处于杂合子缺失状态。本研究中的D值变化范围从0.2150到0.4200，团头鲂“浦江1号”(TPJ1)和团头鲂TN在20个位点的D值多数为正，表现为杂合子过剩严重。杂合子过剩一般出现在研究对象为相对小的群体或者封闭群体,如养殖群体中的子代群体往往由于亲本数量所限，奠基者效应(Founder effect)会导致连锁不平衡现象，继而造成杂合子过剩。分析本实验所出现的杂合子过剩现象，笔者认为可能的原因是：第一，采集样本数都在封闭群体中；第二，与采集样本数密切相关；第三，正常群体等位基因均来自父母，多态性较高。2个雌核发育群体(TNM和TNDH)在20个位点的D值基本为正，表现为杂合子缺失，实际纯合子过量，反映了雌核发育更利于基因的纯合。分析本实验所出现的杂合子缺失现象，笔者认为可能的原因是：第一，减数分裂雌核发育群体的母本为92尾团头鲂，母本产生的后代多表现为在着丝粒较近的位点，等位基因之间不易发生重组多表现为纯合。第二：有丝分裂雌核发育是经抑制第一次卵裂而形成，其染色体组中一条是以另一条为模板复制而成，遗传组成为纯合。

遗传距离是衡量群体间遗传变异程度的可靠参数。群体间亲缘关系越近，则遗传变异性越低，相似系数值越大，遗传距离越小。本研究中TNM群体和TNDH群体间的遗传距离最小为0.0746，遗传相似系数最大为0.9281，说明雌核发育能显著加快团头鲂基因的纯合速度，使控制优良性状的基因快速纯合化；并且所培育的雌核发育群体(TNM和TNDH)已经是一个遗传一致性较高的品系。并且根据聚类分析结果，TPJ1群体和TN群体单独聚为一支，2个雌核发育群体(TNM和TNDH)单独聚成另一支，说明人工诱导雌核发育群体(TNM和TNDH)与TN群体之间发生了明显的遗传分化，这也说明雌核发育是快速建立具有特定遗传特征品系的有效途径。本研究中人工诱导雌核发育群体(TNM和TNDH)的各项遗传多样性指数值均低于正常养殖群体，充分说明了人工干预选择降低了群体遗传多样性。研究表明，遗传多样性的丧失或过低将降低其适应各种不同环境的能力，在人工选择育种中维持一定的群体遗传多样性才能使其更好的适应环境变化，有利于养殖业的健康发展。因此，团头鲂育种过程中人工选育和维持群体遗传多样性二者之间能否达到一种平衡变得越来越重要，今后应继续对两者的遗传结构进行检测，进一步发掘其选育潜力。本实验对团头鲂耐低氧群体(TN)和耐低氧雌核发育群体(TNM和TNDH)的遗传结构研究将为以后团头鲂耐低氧新品系的人工选育工作提供理论依据。

4.2耐低氧F3群体的生长性状分析

在耐低氧F2群体基础上，通过自交、减数分裂和有丝分裂雌核发育分别获得了3个F3群体。一龄阶段3个群体生长对比实验结果显示，它们的平均增重大小分别是：有丝分裂雌核发育群体>减数分裂雌核发育群体>自交群体>团头鲂“浦江1号”，体现出了生长优势性状的稳定遗传与累积。团头鲂“浦江1号”良种比野生群体生长速度体高29％，本研究构建的3个新品系生长速度的后期增重需要进一步测量和统计。

自交群体生长速度比“浦江1号”快，证明我们采取扩大亲本群体大小有助于减少近亲衰退导致优势性状丢失的风险。另外，通过雌核发育能够快速建立纯系和固定纯化优势性状，而且雌核发育鱼相对普通鱼表现出更进一步的生长优势，这证明雌核发育对选育具有生长优势的良种具有非常大的帮助，我们通过雌核发育获得较普通团头鲂具有生长优势的雌核发育团头鲂新品系是非常有生产意义的。

4.3耐低氧F3群体的耐低氧性状分析

与团头鲂“浦江1号”相比，耐低氧团头鲂自交F3、减数和有丝分裂雌核发育F3群体的体型失衡LOE(loss of equilibrium)的DO值在10℃由0.72下降到0.54、0.58、0.59，耐低氧能力分别提高25.0％、19.4％、18.1％；DO值在25℃由0.92下降到0.62、0.68、0.71，耐低氧能力分别提高32％、26％、22.8％；DO值在30℃由1.40下降到1.23、1.26、1.28，提高12％，耐低氧能力分别提高12.1％、10.0％、8.5％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种耐低氧团头鲂的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括以下步骤：

（1）构建耐低氧F1群体：团头鲂低氧胁迫选育出耐低氧F1群体；

（2）构建耐低氧F2群体：以耐低氧F1群体团头鲂为亲本构建F2家系，F2家系1龄阶段进行低氧胁迫养殖， 2龄阶段常氧养殖；

（3）构建耐低氧F3群体：以耐低氧F2群体团头鲂为亲本构建自交F3群体，或以耐低氧F2雌性团头鲂为母本，用紫外灭活的鲤鱼精子诱导构建团头鲂减数、有丝分裂雌核发育F3群体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）为团头鲂“浦江1号”F9代低氧胁迫选育出耐低氧团头鲂F1群体。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中低氧胁迫养殖方法为：养殖车间顶棚为倒V结构，由彩钢板与透明塑料板材料构成，室内与外界空气流通不畅，室内温度较高，池内水体溶解氧持续偏低，形成对团头鲂幼鱼的低氧胁迫。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中F2家系1龄阶段进行为期1年的低氧胁迫养殖，低氧胁迫养殖时溶解氧浓度为2～4.5mg/L。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）为：繁殖期前3个月，从耐低氧F2群体中挑选体征正常、色泽鲜明、体质健壮、性成熟特征明显的团头鲂进行专池精养，合理投喂饲料，促进性腺发育；到了繁殖季节，水温稳定在24～25°C以后，开始人工催产建立耐低氧F3自交群体。

6. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，鲤鱼精子的紫外灭活方法为：用紫外照射鲤鱼精液过程中实时检测精子活性，精子活性在20～30% 时停止照射，完成灭活处理。

7. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，鲤鱼精子的处理方法为：擦干雄鲤鱼腹部和泄殖孔周围的水分，采用腹部挤压法和吸管吸取采集新鲜精液；以Hank’s溶液体积：精液体积=3:1的比例加入Hank’s溶液稀释精液，薄层铺在大玻璃培养皿中，并置于垫有冰袋的摇床上，距离15cm用两支6w的紫外灯照射处理6～8 min，照射过程中实时检测精子活性，精子活性在20～30% 时停止照射，完成灭活处理。

8. 根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）为：用紫外灭活后的鲤鱼精液对团头鲂卵子授精，授精2～3 分钟后开始4°C冷休克20～25分钟，冷休克处理后的胚胎流水孵化，获得耐低氧减数分裂雌核发育F3群体鱼苗。

9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）为：用紫外灭活后的鲤鱼精液对团头鲂卵子授精，授精25～30分钟后开始4°C冷休克20～25分钟，冷休克处理后的胚胎流水孵化，获得耐低氧有丝分裂雌核发育F3群体鱼苗。

10.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，繁殖时采用HCG与LHRH-A2混合注射进行人工催产，团头鲂雄鱼注射剂量照团头鲂雌鱼减半，雄鲤鱼注射剂量为团头鲂雌鱼的四分之一。