CN109030131A - 一种雅龙鱼染色体制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种雅龙鱼染色体制备方法，它涉及一种鱼类染色体制备方法。本发明是为了解决血细胞培养法过小的鱼不容易采血、细胞培养过程长、培养条件高、培养难度大的技术问题。本方法：一、注射PHA、秋水仙素，制备细胞悬浮液，离心，加低渗液离心，弃上清液，得到细胞沉淀；二、固定；三、离心后的细胞沉淀加入卡诺氏固定液1‑1.2ml，混合均匀制成细胞悬液，将细胞悬液吸入胶头滴管内，在胶头滴管距离冷冻玻片25‑30cm、胶头滴管与冷冻玻片夹角为35‑50度的条件下滴加2‑3滴细胞悬液，然后将冷冻玻片在酒精灯火焰上方过3‑5次，均匀烘烤，室温下自然干燥，即得雅龙鱼染色体。本发明方法细胞培养时间短，培养容易，采用本发明方法获得的雅龙鱼染色体分裂相比较多，效果很好。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类染色体制备方法。
背景技术
雅罗鱼Leuciscus sp.是达里湖瓦氏雅罗鱼Leuciscus waleckii Dybowski×高体雅罗鱼Leuciscus idus Linnaeus的种间杂交所生产的杂交鱼(Hybrid dace)，商品名为雅龙鱼；达里湖瓦氏雅罗鱼和高体雅罗鱼隶属鲤形目Cypriniformes，鲤科Cyprinidae，雅罗鱼亚科Leuciscinae的雅罗鱼属Leuciscus。中国水产科学研究院黑龙江水产研究所在黑龙江省科技攻关项目(项目编号：GCI2B307)的资助下，完成了前期雅龙鱼种质创制、生长性状测定、池塘培育和生产选育。实践证明，瓦氏雅罗鱼和高体雅罗鱼杂交品种-雅龙鱼，比亲本更具有生长优势，深受广大养殖渔户的喜爱(项目通过专家组鉴定和验收)。在盐碱水池塘养殖养殖中占有较大的比例。雅龙鱼在北方盐碱池塘养殖过程，病害的发生较少。对雅龙鱼肌肉营养成分分析的结果表明，通过杂交育种得到的雅龙鱼较亲本具有较好的多不饱和脂肪酸，肌肉属于低脂高蛋白食物，可满足人们日常蛋白营养摄取的需要(常玉梅等2017.低盐碱池塘养殖雅罗鱼及其杂交种肌肉营养成分分析，中国水产科学，24:332-340)。推广该雅龙鱼，旨在增加内陆盐碱水域鱼类养殖品种，促进盐碱水域的开发和利用，改善盐碱水体生态环境。
染色体是遗传物质的主要载体，承载着生物生命形式的所有信息。研究染色体数目和染色体核型是细胞遗传学研究的主要内容之一，为鱼类遗传育种提供细胞遗传学依据。通过对杂交种染色体鉴定，可为比较杂交种与亲本染色体异同提供细胞学依据，同时，它对后期发掘和培育筛选雅罗鱼新品种具有重要的意义。雅龙鱼核型分析的前提和基础就是染色体标本的制备。目前，鱼类染色体制备方法主要有头肾-PHA注射法，血细胞培养法，小鱼游泳法；此外，文献中还报道有组织浸泡法，肾细胞培养法，鳞片培养法、胚胎干细胞培养法及头肾-PHA注射-淋巴细胞富集法等(黎玉元等，鱼类染色体制备方法概述，2013，4:28-30)。根据养殖鱼类种质检验标准(GB/T 18654)，染色体制备方法包括体细胞体内培养法，体细胞体外培养法，体细胞直接法和胚胎细胞直接法。血细胞培养法过程比较繁琐，一般用在不能杀死的、且样本比较少的稀有鱼类上，采血在细胞培养条件下培养淋巴细胞；缺点就是过小的鱼不容易采血，操作繁琐，细胞培养过程相对时间较长(7-10天)，培养条件高，培养难度大，不容易掌握。小鱼游泳法只能用于体长2cm以下的规格的小鱼及幼鱼染色体的制备。虽然染色体标本制作分类不同，但是制作的基本原理都是使用化学试剂破坏纺锤体，阻抑细胞在有丝分裂中期，获得鱼类细胞染色体中期分裂相。
不同鱼类，由于质量体重，生理状态，组织结构，处理温度和方法等的差异，得到的细胞分裂种群相对数量和质量也不尽相同。因此，每种鱼类成功制备染色体的条件，以至获得清晰的染色体图像需要不断的摸索和反复试验才能建立。目前，涉及雅罗鱼染色体的制备方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决血细胞培养法过小的鱼不容易采血、细胞培养过程长、培养条件高、培养难度大的技术问题，提供了一种雅龙鱼染色体制备方法。
一种雅龙鱼染色体制备方法按照以下步骤进行：
一、将体长10.20-15.17cm、重量13.20-37.56g、10月龄的雅龙鱼于水温为15℃±1℃的充气水族箱中饲养1周；
二、按照PHA与鱼体重10μg:1g的比例给雅龙鱼注射PHA(植物血球凝集素)，16-18h后，按秋水仙素溶液与鱼体重1-2μg:g的比例再注射秋水仙素溶液，2-4h后剪鳃断尾在水中放血，解剖鱼体，取出头肾，置于装有质量浓度为0.75％的生理盐水的平皿中清洗，清除血块后置于盛有生理盐水的培养皿中，用镊子将头肾组织磨碎，吸入10mL离心管中并用吸管反复吹打，加入生理盐水至5ml，混合均匀，以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
三、向步骤二的产物中加入4mL低渗液，吹打均匀，室温静置、低渗处理40min，加入新配制的0.5-1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再以1000r/min的速度离心6min，弃上清液，得到细胞沉淀；
四、在细胞沉淀中加入0.5-1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再加入2-3mL卡诺氏固定液，室温静置固定15min后，再以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
五、重复步骤四2次，弃掉上清液；
六、将步骤五离心后的细胞沉淀加入卡诺氏固定液1-1.2ml，混合均匀制成细胞悬液，将细胞悬液吸入胶头滴管内，在胶头滴管距离冷冻玻片25-30cm、胶头滴管与冷冻玻片夹角为35-50度的条件下滴加2-3滴细胞悬液，然后将冷冻玻片在酒精灯火焰上方过3-5次，均匀烘烤，室温下自然干燥，即得雅龙鱼染色体。
本发明方法解决了小的鱼不容易采血、细胞培养过程长、培养条件高、培养难度大的技术问题，细胞培养时间短，培养容易，采用本发明方法获得的雅龙鱼染色体分裂相比较多，效果很好。
附图说明
图1是实验一中雅龙鱼染色体中期分裂相；
图2是实验一中雅龙鱼染色体核型图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种雅龙鱼染色体制备方法按照以下步骤进行：
一、将体长10.20-15.17cm、重量13.20-37.56g、10月龄的雅龙鱼于水温为15℃±1℃的充气水族箱中饲养1周；
二、按照PHA与鱼体重10μg:1g的比例给雅龙鱼注射PHA，16-18h后，按秋水仙素溶液与鱼体重1-2μg:g的比例再注射秋水仙素溶液，2-4h后剪鳃断尾在水中放血，解剖鱼体，取出头肾，置于装有质量浓度为0.75％的生理盐水的平皿中清洗，清除血块后置于盛有生理盐水的培养皿中，用镊子将头肾组织磨碎(使其中的细胞游离出来)，吸入10mL离心管中并用吸管反复吹打，加入生理盐水至5ml，混合均匀，以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
三、向步骤二的产物中加入4mL低渗液，吹打均匀，室温静置、低渗处理40min，加入新配制的0.5-1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再以1000r/min的速度离心6min，弃上清液，得到细胞沉淀；
四、在细胞沉淀中加入0.5-1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再加入2-3mL卡诺氏固定液，室温静置固定15min后，再以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
五、重复步骤四2次，弃掉上清液；
六、将步骤五离心后的细胞沉淀加入卡诺氏固定液1-1.2ml，混合均匀制成细胞悬液，将细胞悬液吸入胶头滴管内，在胶头滴管距离冷冻玻片25-30cm、胶头滴管与冷冻玻片夹角为35-50度的条件下滴加2-3滴细胞悬液，然后将冷冻玻片在酒精灯火焰上方过3-5次，均匀烘烤，室温下自然干燥，即得雅龙鱼染色体。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中按照PHA与鱼体重10μg:1g的比例给雅龙鱼注射PHA，17h后，按秋水仙素溶液与鱼体重1μg:g的比例再注射秋水仙素溶液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二中3h后剪鳃断尾在水中放血，解剖鱼体，取出头肾，置于装有质量浓度为0.75％的生理盐水的平皿中清洗，清除血块后置于盛有生理盐水的培养皿中，用镊子将头肾组织磨碎，得到细胞悬浮液。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本具体实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤三中加入0.8mL卡诺氏固定液。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本具体实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三中所述的低渗液为质量浓度为0.5％的氯化钾溶液。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本具体实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中所述的卡诺氏固定液由甲醇与冰醋酸按照3：1的体积比制成。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本具体实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤六中所述的卡诺氏固定液由甲醇与冰醋酸按照3：1的体积比制成。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本具体实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤六中所述的冷冻玻片预先用70％酒精浸泡后擦干净，再冷冻。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本具体实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤六中胶头滴管与冷冻玻片夹角为45度。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本具体实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤六中然后将冷冻玻片在酒精灯火焰上方过3-5次，均匀烘烤，室温下自然干燥。其它与具体实施方式一至九之一相同。
采用下述实验验证本发明效果：
实验一：
一种雅龙鱼染色体制备方法按照以下步骤进行：
一、将体长10.20-15.17cm、重量13.20-37.56g、10月龄的雅龙鱼于水温为15℃的充气水族箱中饲养1周；
二、按照PHA与鱼体重10μg:1g的比例给雅龙鱼注射PHA，16h后，按秋水仙素溶液与鱼体重2μg:g的比例再注射秋水仙素溶液，4h后剪鳃断尾在水中放血，解剖鱼体，取出头肾，置于装有质量浓度为0.75％的生理盐水的平皿中清洗，清除血块后置于盛有生理盐水的培养皿中，用镊子将头肾组织磨碎，吸入10mL离心管中并用吸管反复吹打，加入生理盐水至5ml，混合均匀，以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
三、向步骤二的产物中加入4mL低渗液，吹打均匀，室温静置、低渗处理40min，加入新配制的1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再以1000r/min的速度离心6min，弃上清液，得到细胞沉淀；
四、在细胞沉淀中加入0.5-1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再加入2-3mL卡诺氏固定液，室温静置固定15min后，再以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
五、重复步骤四2次，弃掉上清液；
六、将步骤五离心后的细胞沉淀加入卡诺氏固定液1.2ml，混合均匀制成细胞悬液，将细胞悬液吸入胶头滴管内，在胶头滴管距离冷冻玻片30cm、胶头滴管与冷冻玻片夹角为45度的条件下滴加2-3滴细胞悬液，然后将冷冻玻片在酒精灯火焰上方过3-5次，均匀烘烤(使染色体分散和展开)，室温下自然干燥，即得雅龙鱼染色体。
染色和镜检：
采用质量浓度为4％Giemsa溶液(参照养殖鱼类种质检验标准(GB/T 18654)配制Giemsa溶液)室温下对雅龙鱼染色体染色20min，吸去染液，冲洗，自然干燥，显微镜下观察、拍照；
染色体的分类和测量：
在显微镜下选择分散度好、形态清晰、数目完整的中期分裂相，统计每个分裂相的染色体数目，确定染色体数目，选择10个数目完整、分散良好和形态清晰的分裂相拍照，放大，参照Levan等的标准测量染色体的长臂、短臂、染色体长度等参数(参考文献：Levan A,Fredga K,Sandberd A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J].Hereditas,1964,52(2):201-220；养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析，GB/T18654.12-2008)，做出染色体核型图，染色体臂数的统计标准按照中部和亚中部着丝粒染色体的臂数记为2，亚端部和端部着丝粒染色体的臂数记为1。
通过图1和图2，可以看到中部着丝粒染色体m组有9对，亚中部着丝粒染色体sm组有10对，亚端部着丝粒染色体st组有2对，端部着丝粒染色体t组有4对。体细胞染色体数(2N)：50。核型公式：2N＝50，18m+20sm+4st+8t。染色体臂数(NF)：88。
Claims (10)
1.一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于一种雅龙鱼染色体制备方法按照以下步骤进行：
一、将体长10.20-15.17cm、重量13.20-37.56g、10月龄的雅龙鱼于水温为15℃±1℃的充气水族箱中饲养1周；
二、按照PHA与鱼体重10μg:1g的比例给雅龙鱼注射PHA，16-18h后，按秋水仙素溶液与鱼体重1-2μg:g的比例再注射秋水仙素溶液，2-4h后剪鳃断尾在水中放血，解剖鱼体，取出头肾，置于装有质量浓度为0.75％的生理盐水的平皿中清洗，清除血块后置于盛有生理盐水的培养皿中，用镊子将头肾组织磨碎，吸入10mL离心管中并用吸管反复吹打，加入生理盐水至5ml，混合均匀，以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
三、向步骤二的产物中加入4mL低渗液，吹打均匀，室温静置、低渗处理40min，加入新配制的0.5-1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再以1000r/min的速度离心6min，弃上清液，得到细胞沉淀；
四、在细胞沉淀中加入0.5-1.0mL卡诺氏固定液，吹打均匀，再加入2-3mL卡诺氏固定液，室温静置固定15min后，再以1000r/min的速度离心6min，弃掉上清液；
五、重复步骤四2次，弃掉上清液；
六、将步骤五离心后的细胞沉淀加入卡诺氏固定液1-1.2ml，混合均匀制成细胞悬液，将细胞悬液吸入胶头滴管内，在胶头滴管距离冷冻玻片25-30cm、胶头滴管与冷冻玻片夹角为35-50度的条件下滴加2-3滴细胞悬液，然后将冷冻玻片在酒精灯火焰上方过3-5次，均匀烘烤，室温下自然干燥，即得雅龙鱼染色体。
2.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤二中按照PHA与鱼体重10μg:1g的比例给雅龙鱼注射PHA，17h后，按秋水仙素溶液与鱼体重1μg:g的比例再注射秋水仙素溶液。
3.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤二中3h后剪鳃断尾在水中放血，解剖鱼体，取出头肾，置于装有质量浓度为0.75％的生理盐水的平皿中清洗，清除血块后置于盛有生理盐水的培养皿中，用镊子将头肾组织磨碎，得到细胞悬浮液。
4.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤三中加入0.8mL卡诺氏固定液。
5.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤三中所述的低渗液为质量浓度为0.5％的氯化钾溶液。
6.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤三中所述的卡诺氏固定液由甲醇与冰醋酸按照3：1的体积比制成。
7.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤六中所述的卡诺氏固定液由甲醇与冰醋酸按照3：1的体积比制成。
8.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤六中所述的冷冻玻片预先用70％酒精浸泡后擦干净，再冷冻。
9.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤六中胶头滴管与冷冻玻片夹角为45度。
10.根据权利要求1所述一种雅龙鱼染色体制备方法，其特征在于步骤六中然后将冷冻玻片在酒精灯火焰上方过3-5次，均匀烘烤，室温下自然干燥。
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