CN108124801B - 一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法，首先选择长牡蛎“海大2号”新品种为亲贝，经人工促熟培育亲贝发育成熟后，挑选其中性腺发育良好的雌、雄个体作为亲贝，解剖取卵并过滤，然后将卵子置于过滤海水中熟化，将熟化后的卵子与精子在过滤海水中受精，受精后，用细胞松弛素B处理受精卵，抑制其第一极体排放，处理完成后，再收集受精卵，将其转移到乙醇溶液中浸泡，最后将受精卵转移到培育容器中进行孵化及幼虫培育。本发明通过细胞松弛素B抑制二倍体“海大2号”新品种的受精卵第一极体排放，直接诱导出存活的长牡蛎“海大2号”新品种四倍体，成活率极大提高，为长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的扩大养殖提供了育苗基础。
Description
技术领域
本发明属于贝类育种技术领域，涉及一种长牡蛎多倍体诱导方法，具体是关于一种具有重要经济性状—金黄壳色和快速生长优势长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法。
背景技术
牡蛎是世界上养殖范围最广、产量最高的经济贝类，其肉味鲜美，营养丰富，素有“海中牛奶”的美誉。牡蛎作为我国四大养殖贝类之一，2016年我国牡蛎养殖产量达483.5万吨，居世界首位。但是，在长期的牡蛎养殖过程中也面临很多问题，集中体现在缺乏良种和近亲繁育导致的牡蛎养殖群体遗传多样性降低、种质退化，以及经常出现大规模死亡、个体小型化及壳形不规则等经济性状衰退现象，最终导致了我国牡蛎养殖规模和产量虽居世界首位，但牡蛎养殖业的产值和效益却始终在低水平上徘徊。
海洋经济贝类普遍具有壳色多态性，美观一致的贝壳颜色会给消费者带来视觉享受，进而提高商品价值。优质、高产的壳色新品种选育已经成为海产经济贝类遗传育种的一个研究热点。长牡蛎“海大2号”新品种是以2010年从山东沿海长牡蛎野生群体中筛选左壳色为金黄色个体构建基础群体，以金黄壳色和生长速度作为选育目标性状，经连续多代选育而成。在相同养殖条件下，与未经选育的长牡蛎相比，长牡蛎“海大2号”新品种不仅具有显著的生长优势，而且左右壳和外套膜均为色泽亮丽的金黄色，长牡蛎“海大2号”新品种很大程度上满足了我国牡蛎养殖业对牡蛎良种的需求，对于提高我国养殖牡蛎的品质与档次以及产值与效益具有重要意义。
与野生个体一样，长牡蛎“海大2号”新品种是正常二倍体。每年进入夏季，牡蛎开始进入繁殖盛期，为了满足繁殖的能量需求，体内糖原含量大量消耗，从而导致牡蛎的口感变差，并随着产卵，软体部急剧缩小，无法供应市场，限制了牡蛎的全年供应，大大压缩了经济效益空间。而牡蛎三倍体虽然可育性较差，但是可以全年供应市场，解决了牡蛎二倍体夏季因口感差、软体部消瘦难以供应市场的难题，而且三倍体还具有生长速度快和品质好等优点，受到广大消费者的喜爱和牡蛎养殖业的推崇，已经形成了产业化，具有非常广阔的发展前景。与普通牡蛎三倍体相比，“海大2号”三倍体左右壳和外套膜均为金黄色，具有更高的商品价值，更能满足消费者对高品质、高档次的消费需求，是推动我国牡蛎高端市场向前发展的一大动力。当前长牡蛎“海大2号”三倍体主要有两种获得途径，一是直接诱导其三倍体，但是这种方法存在三个问题：三倍体诱导率难以达到100%；由于诱导剂的毒性作用，诱导的胁迫导致幼虫的存活率较低；由于三倍体个体的不育性，使其不能自我延续种群。二是诱导长牡蛎“海大2号”四倍体，并通过四倍体和二倍体杂交获得三倍体后代。长牡蛎“海大2号”四倍体的价值不仅体现在可以和二倍体杂交获得100%三倍体后代，而且四倍体可以自我延续种群，扩大种群规模，保持良种种质。因此，培育长牡蛎“海大2号”新品种四倍体势在必行。
目前，诱导牡蛎四倍体主要有两种方法，最常用的是用雄性长牡蛎二倍体的精子和雌性三倍体的卵子受精，并通过诱导剂抑制受精卵第一极体排放来诱导产生四倍体，曾获国际专利，研究表明这种方法获得的四倍体用于三倍体的生产时，一方面三倍体的性腺会有一定程度的发育，另一方面四倍体群体随着1-2代的自身繁殖后，后代存在染色体丢失，不能保证100%的四倍体，用其与二倍体杂交三倍体率也不是100%的问题，需要定期更换而重新诱导以产生诱导。另一种方法是利用二倍体牡蛎的精子和卵子直接诱导产生牡蛎四倍体，很多研究发现直接诱导产生的四倍体会存在存活率极低和操作过程繁琐的问题，但是牡蛎二倍体直接诱导牡蛎四倍体也有其不可替代的优势，由于诱导过程没有使用三倍体亲贝，使用直接诱导获得的四倍体和二倍体杂交产生的三倍体后代不育性更高，理论上具有更高的三倍体优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的直接诱导方法，以获得长牡蛎“海大2号”新品种四倍体，用以弥补现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法，包括：首先选择长牡蛎“海大2号”新品种为亲贝，经人工促熟培育亲贝发育成熟后，解剖镜检后挑选其中性腺发育良好的雌、雄个体作为亲贝，解剖取卵并过滤，然后将卵子置于过滤海水中熟化，将熟化后的卵子与精子在过滤海水中受精，精、卵混合后开始计时，受精后，用细胞松弛素B处理受精卵，抑制其第一极体排放，处理完成后，再收集受精卵，将其转移到乙醇溶液中浸泡，最后将受精卵转移到培育容器中进行孵化及幼虫培育。
进一步的，所述长牡蛎“海大2号”新品种亲贝，其左右壳和外套膜均为金黄色，体长8-12cm。
进一步的，解剖取卵并用500目的筛绢过滤。
进一步的，所述卵子在加入浓度为0.01%-0.015%复合维生素液的过滤海水中熟化。
进一步的，在精、卵混合后开始计时，受精5~15分钟后，用0.3~0.9mg/L的细胞松弛素B处理受精卵10~25分钟，抑制其第一极体排放；细胞松弛素B开始处理时间为受精后5~15分钟细胞松弛素B处理持续时间为10~25分钟。
进一步的，所述收集受精卵是利用500目筛绢，过滤后并立即用过滤海水充分冲洗。
进一步的，所述乙醇溶液浓度为0.2%，浸泡时间40-60分钟。
进一步的，所述幼虫培育过程中，控制幼虫培育密度不高于0.1-0.2个/ mL。
进一步的，所述整个受精和诱导过程中严格控制水温在24℃。
进一步的，使用流式细胞仪测量诱导四倍体群的倍性，要求幼贝壳高3.0-6.0cm；使用流式细胞仪测量诱导四倍体群的倍性，并分离出存活的长牡蛎“海大2号”新品种四倍体。
本发明的优点和技术效果：
本发明通过细胞松弛素B抑制二倍体“海大2号”新品种的受精卵第一极体排放，直接诱导出存活的长牡蛎“海大2号”新品种四倍体，且与现有的四倍体诱导方法相比，本发明诱导得到的四倍体成活率极大提高，为长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的扩大养殖提供了育苗基础。
附图说明
图1 为长牡蛎“海大2号”二倍体（2N=20）的镜检图。
图2 为长牡蛎“海大2号”四倍体（4N=40）的镜检图。
图3为长牡蛎“海大2号” 新品种二倍体的流式细胞仪检测图。
图4长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的流式细胞仪检测图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进一步解释和说明。
实施例：
一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法，包括以下步骤：
（1）挑选大小8-12cm 的、左右壳和外套膜均为金黄色，且2龄长牡蛎“海大2号”新品种二倍体为亲贝，提前3个月从养殖海区转移到育苗车间进行性腺促熟。
（2）在长牡蛎“海大2号”新品种二倍体中，解剖镜检后挑选其中性腺发育良好的雌、雄个体作为亲贝，解剖取卵并用500目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液等成分，然后将卵子加入复合维生素液的砂滤海水中进行熟化。
（3）镜检卵子熟化程度及其是否存在精子污染，然后将熟化完全的卵子与活力旺盛的精子在砂滤海水中授精。
（4）精卵混合后开始计时，授精5~15分钟后，用0.3~0.9mg/L的细胞松弛素B处理10~25分钟，抑制受精卵第一极体排放。
（5）处理完成后，用500目筛绢收集受精卵并立即用过滤海水充分冲洗，然后将其转移到0.2%乙醇溶液中浸泡40-60分钟，最后过滤除去残留的细胞松弛素B。整个授精和诱导过程中严格控制水温在24℃。幼虫在育苗车间的水泥池中进行培育，控制其培育密度0.1-0.2个/mL。
检测幼虫时期的诱导率和存活率以及幼贝时期的诱导率。
1、早期胚胎染色体标本制备：取受精10小时后的若干胚胎，置于0.1%的秋水仙素溶液中处理2小时；离心倒掉上清液，0.075mol/L氯化钾低渗处理30分钟，重复两次；然后再用卡诺固定液固定三次，-20℃保存。热滴片，显微镜下观察拍照，进行染色体计数，结果如图1和图2所示，图1为长牡蛎“海大2号”二倍体早期胚胎的染色体照片，染色体计数结果显示为20条。图2为长牡蛎“海大2号”四倍体早期胚胎的染色体照片，染色体计数结果显示为40条。
2、取受精24小时后的幼虫于离心管中，离心倒掉上清液后加入1mL PBS（1×），用1.5mL注射器吸打后，300目筛绢过滤，75%乙醇固定，4℃保存过夜。离心（300g）后倒掉上清液，加入1mL PBS（1×），再加入20ng/mL RNA酶A 反应30分钟后，最后再加入35mL的PI（1mg/mL）染色30分钟，经300目筛绢过滤后，流式细胞仪进行检测。
检测结果显示：幼虫期的长牡蛎“海大2号”新品种四倍体率最高为29.0%；幼虫存活率最高为62.4%，极大的提高了当前四倍体的诱导率和成活率。图3和图4是养成期的长牡蛎“海大2号”二倍体个体和长牡蛎“海大2号”四倍体个体的流式细胞仪检测结果。其中，横坐标代表细胞数目，纵坐标代表荧光强度，其中荧光强度和细胞中的DNA含量成正比，可以反映备测细胞群体的相对DNA含量。从图3和图4中可以看出，长牡蛎“海大2号” 新品种二倍体样品检测的荧光强度的峰值在220-280之间，长牡蛎“海大2号”新品种四倍体样品检测的荧光强度峰值在440-520之间。即，长牡蛎“海大2号”新品种四倍体DNA的相对含量约为长牡蛎“海大2号”新品种二倍体的2倍。
3、幼贝生长至180天时，使用流式细胞仪对幼贝进行非致死的倍性检测。检测出的长牡蛎“海大2号”新品种四倍体单独进行养成。
经流式细胞仪和染色体计数法双重检测，结果表明：本发明的诱导方法成功获得了具有金黄壳色且存活的长牡蛎“海大2号”新品种四倍体，且大大提高了成活率。
Claims (5)
1.一种长牡蛎“海大2号”新品种四倍体的诱导方法，其特征在于，该诱导方法包括：首先选择长牡蛎“海大2号”新品种为亲贝，经人工促熟培育亲贝发育成熟后，解剖镜检后挑选其中性腺发育良好的雌、雄个体作为亲贝，解剖取卵并过滤，然后将卵子置于过滤海水中熟化，将熟化后的卵子与精子在过滤海水中受精，在精、卵混合后开始计时，受精5~15分钟后，用0.3~0.9mg/L的细胞松弛素B处理受精卵10~25分钟，抑制其第一极体排放；细胞松弛素B开始处理时间为受精后5~15分钟，细胞松弛素B处理持续时间为10~25分钟，处理完成后，再收集受精卵，将其转移到乙醇溶液中浸泡，所述乙醇溶液浓度为0.2%，浸泡时间40-60分钟，最后将受精卵转移到培育容器中进行孵化及幼虫培育；所述整个受精和诱导过程中严格控制水温在24℃；所述长牡蛎“海大2号”新品种亲贝，其左右壳和外套膜均为金黄色，体长8-12cm。
2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，解剖取卵并用500目的筛绢过滤。
3.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述卵子在加入浓度为0.01%-0.015%复合维生素液的过滤海水中熟化。
4.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述收集受精卵是利用500目筛绢，过滤后并立即用过滤海水充分冲洗。
5.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述幼虫培育过程中，控制幼虫培育密度不高于0.1-0.2个/ mL。
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| 贝类四倍体育种研究进展;王昭平等;《中国海洋大学学报》;20040331;第34卷(第2期);第195-200页 * |
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