CN113749059B - 一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法 - Google Patents

一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法。该方法包括：通过抑制二倍体长牡蛎“海大1号”受精卵第一极体排放来获得的高杂合度的三倍体长牡蛎“海大1号”并把其雌性为母本，以二倍体“海大1号”雄性作为父本，通过抑制受精卵第一极体排放来获得生长性状改善的四倍体长牡蛎“海大1号”；再用四倍体长牡蛎“海大1号”雄性和二倍体长牡蛎“海大1号”杂交获得具有快速生长的三倍体长牡蛎“海大1号”。本发明采用提高亲本基因杂合度的方法来提高其生长性能，使用这种方法获得的四倍体长牡蛎“海大1号”与原本就具有生长快速特点的二倍体长牡蛎“海大1号”杂交获得了具有快速生长性能的三倍体长牡蛎“海大1号”。

Description

一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法
技术领域
本发明属于贝类育种技术领域，涉及一种长牡蛎三倍体培育方法，具体是关于一种具有快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法。
背景技术
长牡蛎又称太平洋牡蛎，是我国北方主要的牡蛎养殖品种，同时由于其环境适应性强、生长速度快、营养丰富等特点，使其成为世界上养殖范围最广的经济贝类。我国牡蛎养殖主要以二倍体为主，但是随着多倍体技术的应用和发展，近年来三倍体牡蛎养殖开始在我国兴起，这主要得益于三倍体牡蛎性腺发育阻滞，解决了二倍体牡蛎夏季因产卵后软体部消瘦难以供应市场的难题，为牡蛎消费市场全年供给提供了保障。同时三倍体牡蛎性腺在夏季发育程度较低，可以有更多的能量用于生长，提高其生长速度，这些都决定了三倍体牡蛎在我国牡蛎产业中将发挥越来越重要的作用。
三倍体的获得方式主要有两种：一是二倍体诱导；二是四倍体和二倍体杂交，主要是四倍体牡蛎雄性与二倍体雌性杂交。因为第一种方式存在三倍体率不稳定且难以达到100%、死亡率高等缺点，在三倍体商业化生产中无法应用。而第二种方式由于其可以实现规模化生产和100%三倍体率，是目前三倍体生产中最常用的方法。虽然我国的三倍体牡蛎逐渐实现了商业化养殖，但是仍处于起步阶段。因为一开始诱导三倍体或者四倍体的二倍体牡蛎群体往往是未经选育的牡蛎群体，导致获得的四倍体往往生产性能较差，而通过这些四倍体牡蛎获得的三倍体，就像未经选育的二倍体牡蛎群体一样，是一种比较原始的三倍体，其生产性能还有很大提升的空间。出现这种现象的原因一方面是研究者缺少具有优良性状的二倍体，二是局限于三倍体规模化的获得，而没有开展获得三倍体后其性状改良的问题。目前研究者也逐渐意识到这个问题，但是考虑到时间成本，难以重新开始，只能寄希望于改良现有的四倍体来达到改良三倍体的目的，或是寻找具有优良性状的二倍体牡蛎作为三倍体生产的母本，以期后代三倍体可以继承二倍体母本的优良性状来实现改良三倍体生产性能的目的。这两种方式是都是折中的方法，并不是最理想和有效获得具有优良性状三倍体的途径。
因此，虽然我国三倍体牡蛎产业逐渐兴起，但是三倍体牡蛎的生产现状却不尽如人意，尤其是具有优良生产性能的三倍体更是鲜有报道，因此如何获取性能优异的三倍体牡蛎是亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法，用以弥补现有技术的不足。
本申请培育具有优良生产性能的三倍体，须从根源上重视所选用的二倍体牡蛎群体所具有的生产性能，并注重从具有优良性状的二倍体获得其三倍体，再从三倍体制备四倍体，这样才能最大限度获得具有优良性状的四倍体。同时使用具有优良性状的二倍体和在此基础上得到的四倍体，是有效获得具有优良生产性能的三倍体牡蛎的理想途径。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法，该培育方法包括以下步骤：
（1）获得高杂合度三倍体：以二倍体长牡蛎“海大1号”为基础群体，通过抑制二倍体长牡蛎“海大1号”受精卵第一极体排放获得三倍体长牡蛎“海大1号”；
（2）以步骤（1）得到的三倍体长牡蛎“海大1号”雌性为母本，以二倍体长牡蛎“海大1号”雄性作为父本，利用细胞松弛素B处理受精卵，抑制其受精卵第一极体排放获得四倍体长牡蛎“海大1号”；
（3）以步骤（2）得到的四倍体长牡蛎“海大1号”雄性和二倍体长牡蛎“海大1号”雌性杂交来获得三倍体长牡蛎“海大1号”，获得受精卵；
（4）当步骤（3）得到的受精卵出现第一极体后，将该受精卵转移到培育容器中进行孵化及幼虫培育。
进一步的，所述步骤（1）中，所述二倍体长牡蛎“海大1号”为继代选育新品种，其生长速度快、壳形规则；解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液等成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化；精卵混合后开始计时，授精5分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理，处理15min或开始出现第一极体时处理结束。
进一步的，所述步骤（2）中，母本的选择进一步限制为解剖镜检后挑选其中卵子数量多且呈卵形的二倍体长牡蛎“海大1号”雌性作为母本；所用三倍体母本卵子数量至少100万粒且授精前卵子呈圆形或接近圆形；所述母本和父本均为二龄长牡蛎。
进一步的，所述步骤（2）中，先使用流式细胞仪对步骤（1）中所得二龄三倍体长牡蛎“海大1号”进行非致死的倍性检测，解剖镜检后挑选卵量大（至少100万粒）、卵形较好的个体作为母本，解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液等成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化；精卵混合后开始计时，授精8~10分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理15分钟，抑制受精卵第一极体排放。
进一步的，所述步骤（3）中，所述四倍体长牡蛎“海大1号”作为父本主要是基于相对于卵子，四倍体精子数量大，可以满足三倍体规模化生产的需要；每个卵子周围5-10个精子即可保证受精率达到90%以上，保证了受精率的同时，也达到了充分利用了四倍体的精子目的，从而获得了足够多的三倍体。
进一步的，所述步骤（2）中，获得的四倍体长牡蛎“海大1号”进行自繁之后，镜检后挑选四倍体长牡蛎“海大1号”自繁群体中的雄性与二倍体长牡蛎“海大1号”雌性杂交来获得三倍体长牡蛎“海大1号”。
进一步的，所述步骤（4）中，将70-80%受精卵出现第一极体时作为受精卵转移到培育容器进行孵化的时机，此时转移受精卵可以保证90%以上的卵裂率，尽早转移到培育容器中孵化可以为受精卵的孵化创造尽可能有利的条件。
上述方法还包括检测步骤：使用流式细胞仪采用非致死的倍性检测方法分别挑选出步骤（2）和（3）的三倍体和四倍体长牡蛎“海大1号”亲贝，并检测四倍体长牡蛎“海大1号”和二倍体长牡蛎“海大1号”杂交获得的三倍体长牡蛎“海大1号”的三倍体率。
本发明的优点和技术效果：
本发明以二倍体长牡蛎“海大1号”新品种为基础群体，先通过抑制受精卵第一极体释放来获得三倍体长牡蛎“海大1号”，再利用抑制三倍体长牡蛎“海大1号”卵子与二倍体长牡蛎“海大1号”的精子形成受精卵的第一极体释放获得四倍体长牡蛎“海大1号”，最后以四倍体长牡蛎“海大1号”为父本和二倍体长牡蛎“海大1号”为母本杂交获得具有生长快速的三倍体长牡蛎“海大1号”。
本发明首先通过抑制二倍体受精卵第一极体获得的三倍体长牡蛎“海大1号”，提高了长牡蛎“海大1号”三倍体基因杂合度，改善了三倍体长牡蛎“海大1号”生长性状，再利用生产性状得到改良的三倍体长牡蛎“海大1号”诱导获得的四倍体长牡蛎“海大1号”，解决了此前报道的四倍体存在的生长缓慢的问题，具有更高的生长优势；最后使用具有生长优势的二倍体长牡蛎“海大1号”和生长性状得到改良的四倍体长牡蛎“海大1号”杂交获得了三倍体率100%且具有快速生长优良性状的三倍体长牡蛎“海大1号”。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进一步解释和说明。
实施例1：
一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法，包括以下步骤：
（1）选取2龄、壳高10~12cm二倍体长牡蛎“海大1号”分别作为雄、雌亲贝，解剖镜检后挑选其中性腺发育良好的雌、雄个体作为亲贝，解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液等成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化。精卵混合后开始计时，授精5分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理，处理15min或开始出现第一极体时处理结束。
（2）使用流式细胞仪对（1）中所得二龄三倍体长牡蛎“海大1号”进行非致死的倍性检测，解剖镜检后挑选卵量大（至少100万粒）、卵形较好的个体作为母本，解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液等成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化。精卵混合后开始计时，授精8~10分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理15分钟，抑制受精卵第一极体排放。
（3）使用流式细胞仪对（2）中所得一龄四倍体长牡蛎“海大1号”进行非致死的倍性检测。镜检后挑选四倍体长牡蛎“海大1号”雄性与长牡蛎“海大1号”雌性杂交来获得三倍体长牡蛎“海大1号”，将70-80%受精卵出现第一极体时作为受精卵转移到培育容器进行孵化的时机，此时转移受精卵可以保证90%以上的卵裂率，尽早转移到培育容器中孵化可以为受精卵的孵化创造尽可能有利的条件，培育幼虫。
检测幼虫时期的三倍体率和生长率以及360天时的三倍体率和生长率。
1、使用流式细胞仪进行倍性检测。检测结果显示，受精24h时，长牡蛎“海大1号”三倍体率为100%；附着变态前，与同时期普通的杂交三倍体长牡蛎相比，长牡蛎“海大1号”三倍体率生长速率提高约10%。
2、360天时，使用流式细胞仪再次对长牡蛎“海大1号”三倍体率进行倍性检测。结果表明，长牡蛎“海大1号”三倍体率仍为100%，与同时期普通的三倍体长牡蛎相比，长牡蛎“海大1号”三倍体生长速率提高10-20%。
实施例2
一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法，包括以下步骤：
（1）选取2龄、壳高10~12cm 二倍体长牡蛎“海大1号”分别作为雄、雌亲贝，解剖镜检后挑选其中性腺发育良好的雌、雄个体作为亲贝，解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液等成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化。精卵混合后开始计时，授精5分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理，处理15分钟或开始出现第一极体时处理结束。
（2）使用流式细胞仪对（1）中所得二龄三倍体长牡蛎“海大1号”进行非致死的倍性检测，解剖镜检后挑选卵量大（至少100万粒）、卵形较好的个体作为母本，解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液等成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化。精卵混合后开始计时，授精8~10分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理15分钟，抑制受精卵第一极体排放。
（3）使用流式细胞仪对（2）中所得一龄四倍体长牡蛎“海大1号”进行非致死的倍性检测。然后将四倍体长牡蛎“海大1号”雄性的精子和雌性的卵子混合，建立四倍体长牡蛎“海大1号”自繁群体。
（4）镜检后挑选四倍体长牡蛎“海大1号”自繁群体中的雄性与二倍体长牡蛎“海大1号”雌性杂交来获得三倍体长牡蛎“海大1号”，将70-80%受精卵出现第一极体时作为受精卵转移到培育容器进行孵化的时机，此时转移受精卵可以保证90%以上的卵裂率，尽早转移到培育容器中孵化可以为受精卵的孵化创造尽可能有利的条件，培育幼虫。
检测幼虫时期的三倍体率和生长率以及360天时的三倍体率和生长率。
1、使用流式细胞仪进行倍性检测。检测结果显示，受精24h时，长牡蛎“海大1号”三倍体率为100%；附着变态前，与同时期普通的杂交三倍体长牡蛎相比，长牡蛎“海大1号”三倍体率生长速率提高约10%。
2、360天时，使用流式细胞仪再次对长牡蛎“海大1号”新品种三倍体率进行倍性检测。结果表明，长牡蛎“海大1号”三倍体率仍为100%，与同时期普通的三倍体长牡蛎相比，长牡蛎“海大1号”三倍体率生长速率提高15-25%。
长牡蛎“海大1号”是我国培育的第一个牡蛎新品种，具有生长速度快、壳型规则等特点，填补了我国牡蛎良种培育的空白，在山东、辽宁等地获得了大规模应用。本发明以二倍体长牡蛎“海大1号”为基础群体，开发了一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法，对培育具有优良性状的三倍体牡蛎具有重要的参考价值，同时为我国三倍体牡蛎产业提供了可供选择的优质苗种，有利于推动三倍体牡蛎产业的可持续发展。

Claims (7)

1.一种快速生长三倍体长牡蛎“海大1号”的培育方法，其特征在于，该培育方法包括以下步骤：
（1）获得高杂合度三倍体：以二倍体长牡蛎“海大1号”为基础群体，通过抑制二倍体长牡蛎“海大1号”受精卵第一极体排放获得三倍体长牡蛎“海大1号”；
（2）以步骤（1）得到的三倍体长牡蛎“海大1号”雌性为母本，以二倍体长牡蛎“海大1号”雄性作为父本，利用细胞松弛素B处理受精卵，抑制其受精卵第一极体排放获得四倍体长牡蛎“海大1号”；获得的四倍体长牡蛎“海大1号”进行自繁之后，镜检后挑选四倍体长牡蛎“海大1号”自繁群体中的雄性与二倍体长牡蛎“海大1号”雌性杂交来获得三倍体长牡蛎“海大1号”；
（3）以步骤（2）得到的四倍体长牡蛎“海大1号”雄性和二倍体长牡蛎“海大1号”雌性杂交来获得三倍体长牡蛎“海大1号”，获得受精卵；
（4）当步骤（3）得到的受精卵出现第一极体后，将该受精卵转移到培育容器中进行孵化及幼虫培育。
2.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（1）中，解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化；精卵混合后开始计时，授精5分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理，处理15min或开始出现第一极体时处理结束。
3.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述步骤（2）中，解剖镜检后挑选其中卵子数量多且呈卵形的二倍体长牡蛎“海大1号”雌性作为母本；所用三倍体母本卵子数量至少100万粒且授精前卵子呈圆形或接近圆形；所述母本和父本均为二龄长牡蛎。
4.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（2）中，使用流式细胞仪对步骤（1）中所得二龄三倍体长牡蛎“海大1号”进行非致死的倍性检测，解剖镜检后挑选卵量大，至少100万粒、卵形较好的个体作为母本，解剖取卵并用800目筛绢过滤，除去组织碎块和组织液成分，然后将卵子加入24~25℃的砂滤海水中进行熟化；精卵混合后开始计时，授精8~10分钟后，用0.5mg/L的细胞松弛素B处理15分钟，抑制受精卵第一极体排放。
5.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（3）中，每个卵子周围5-10个精子即可保证受精率达到90%以上。
6.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤（4）中，将70-80%受精卵出现第一极体时作为受精卵转移到培育容器进行孵化的时机，此时转移受精卵能够保证90%以上的卵裂率。
7.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，上述方法还包括检测步骤：使用流式细胞仪采用非致死的倍性检测方法分别挑选出步骤（2）和（3）的三倍体和四倍体长牡蛎“海大1号”亲贝，并检测四倍体长牡蛎“海大1号”和二倍体长牡蛎“海大1号”杂交获得的三倍体长牡蛎“海大1号”的三倍体率。
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