CN103828746B - 一种菲律宾蛤仔的繁育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种菲律宾蛤仔的繁育方法，按照以下步骤进行：在菲律宾蛤仔性成熟时期，选取性腺饱满的个体作为亲本，取亲本的性腺样品，将性腺样品置于新鲜海水中进行镜检，选取显微镜下卵子呈现正圆形，卵质为灰黑色、卵膜完整、卵径一致的个体为雌性亲本，其中北方群体的卵径为70.0±0.5μm，南方群体的卵径为60.0±0.5μm，选取显微镜下精子100%跳动的个体为雄性亲本，将获得的卵液在新鲜的海水中放置15-45min，进行活化，将精子放置于活化成功的卵液中受精，每个卵子周围有3-5个精子，采用搅拌的方式进行受精，并微充气孵化，此后按照菲律宾蛤仔的常规方法进行子代培养，获得大量稚贝及成体。本发明具有操作简便、易于推广等优点。

Description

一种菲律宾蛤仔的繁育方法

技术领域

本发明涉及海洋农业中贝类遗传育种技术领域，特别是一种菲律宾蛤仔的繁育方法。

背景技术

菲律宾蛤仔Ruditapesphilippinarum分布于太平洋和印度洋沿岸，具有养殖周期短、投资少、收益大的特点（张国范&闫喜武，2010）。我国是菲律宾蛤仔的养殖大国，年产菲律宾蛤仔约300万吨左右，占我国贝类产量的30%左右，海水养殖总产量的20%左右，占世界总产量的90%以上（中国渔业协会，2009）。受精生物学是发育生物学的重要组成部分，在理论和生产实践上都具有重要意义。可为繁育良种提供理论依据。

体外受精的双壳贝类中，精子入卵时机存在两种形式，第一种是初级卵母细胞处于第一次减数分裂之前，有胚泡存在，精子入卵后胚泡消失，如巨蛎属的长牡蛎、葡萄牙牡蛎、香港牡蛎、近江牡蛎、熊本牡蛎等；第二种是初级卵母细胞处于第一次减数分裂的中期，胚泡已经消失，才有受精能力，如虾夷扇贝、栉孔扇贝、紫贻贝、蛤仔等，这些贝类在配子发生时期，卵母细胞的减数分裂停滞在第一次减数分裂前期，即发生前期阻滞，故体外解剖的配子几乎是不能受精的。

菲律宾蛤仔的精子在成熟卵细胞进行第一次成熟分裂中期时进入卵内完成受精作用，属于双壳贝类中的第二种受精形式。其受精方式是体外受精，即亲本将卵子和精子都排出体外，在水中受精，精子可以在卵表面的任何部位进入，以螺旋卵裂的方式进行卵裂，从而进一步发育。

王昭萍等公开了对比文件1（王昭萍等，2009.一种能使剥离的贝类卵子体外促熟的方法.授权公告号：CN101627733B），介绍了一种能使剥离的贝类卵子体外促熟的方法，采用两种化学药品氨水及5-羟色胺的促熟扇贝剥离卵子，之后完成受精作用，获得D形幼虫。但该种方法中精卵的受精率较低，通过实验证明，何时获取贝类的精子与卵子会直接影响受精率，但在上述方法中并没有公开获得卵子与精子的时机；同时该方法使用了两种化学药品对卵子进行促熟，虽然可以实现部分促熟作用，但仍存在药物残留，对受精作用有一定的毒害影响，其受精率均较低（仅为40%左右），孵化阶段胚胎畸形率较高（30-50%）；并且，上述方法虽然可以获得一小部分D形幼虫，但幼虫存活能力较差，尚未获得变态后的稚贝。

综上所述，现在需要一种能够解决现有技术的不足的新的菲律宾蛤仔的繁育方法。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种受精率及孵化率较高，能够获得与自然排放配子获取的子代间无显著差异子代的菲律宾蛤仔的繁育方法。

本发明的技术解决方案是：一种菲律宾蛤仔的繁育方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：

a、在菲律宾蛤仔性成熟时期，选取性腺饱满的个体作为亲本，亲本需保证在阴干、流水刺激后95%以上的个体能够自然排放配子，

b、取a步骤中选取的亲本的性腺样品，将性腺样品置于新鲜海水中进行镜检，选取显微镜下卵子呈现正圆形，卵质为灰黑色、卵膜完整、卵径一致的个体为雌性亲本，其中北方群体的卵径为70.0±0.5μm，南方群体的卵径为60.0±0.5μm，选取显微镜下精子100%跳动的个体为雄性亲本，将获得的卵子用200目筛绢网过滤，320目筛绢网洗卵，直至卵液澄清为止，将获得的精子用500目筛绢网过滤，

c、将b步骤所获得的卵液在新鲜的海水中放置15-45min，直至卵子的生发泡破裂，即为活化成功的卵子，将b步骤所获得的精子在新鲜的海水中放置5-10min，仍处于跳跃状态的精子即为有受精能力的精子，

d、将经过c步骤后的精子放置于活化成功的卵液中受精，每个卵子周围有3-5个精子，采用搅拌的方式进行受精，并微充气孵化，此后按照菲律宾蛤仔的常规方法进行子代培养，获得大量稚贝及成体。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

本发明通过确认菲律宾蛤仔的精子与卵子的最佳获取时机、获取精卵，海水激活配子、受精孵化等技术环节，突破了菲律宾蛤仔卵母细胞第一次减数分裂前期阻滞，完成受精作用繁育蛤仔子代，创建了一种菲律宾蛤仔繁育的新方法。本发明颠覆了以往认为蛤仔配子只有自然排放才可以获取子代的传统观念，创建了一套蛤仔繁育新技术，为蛤仔苗种繁育、选择育种、杂交育种、多倍体育种等提供了新的思路。并且本发明未使用任何化学药品，无污染；它的受精率及孵化率较高，均在90%以上；同时它在获得正常D形幼虫的基础上，可以培养出大量稚贝及成体，从其生长及存活能力上看，本发明获取的子代与自然排放配子获取的子代间无显著差异。因此可以说这种方法具有操作简便、实用性强、易于推广等优点。

具体实施方式

下面将说明本发明的具体实施方式。

实施例1：

（a）、确定时机：2011年7月，以辽宁省大连庄河海洋贝类苗种场虾池中性腺成熟的菲律宾蛤仔为材料，打开双壳后，性腺饱满，发现每一个个体的性腺部位有很多小纹发育至足尖部位，貌似卵粒一样；随机取出200个个体通过阴干4h、流水45min刺激后，200个体（100%）排放配子。

（b）、获取精卵：取40个尚未排放配子的该群体作为样本，打开蛤仔双壳，利用牙签取少量性腺样品放置于载玻片上的一滴新鲜海水中，之后进行镜检，共计30个雌性个体，10个雄性个体。其中，卵子在显微镜下又黑又圆、卵径大小一致、卵膜完整、微微颤动，卵径为70.0±0.5μm；精子在显微镜下100%活跃跳动。其中，卵子采用200目筛绢网过滤，320目筛绢网洗卵，直至卵液澄清为止，卵液放置于2L容器中，共优选出6份雌性优选卵子；精子在卵子处理30min后获取，采用500目筛绢网过滤，共获取6份优选精液，分别放置于6个50mL玻璃烧杯中。

（c）、精卵激活：将获得的卵液在新鲜的海水中放置40min，直到卵子的生发泡破裂，即为活化促熟的卵子。解剖精子放置于新鲜海水中10min，处于跳跃状态即为有受精能力的精子。

（d）、受精孵化：在进行（b）步骤的同时，利用阴干4h、流水刺激45min该群体中的100个个体，放在100L白桶中1h后，亲本开始产卵排精。抓取出正在产卵排精的个体，利用淡水冲洗干净，之后放置于2L新鲜海水中的红桶中，共获取6份尚未受精的自然排放的卵子，6份无污染的自然排放的卵子。取自然排放的精卵各一份，（b-c）步骤中激活好的精卵各一份，建立自♀×自♂、解♀×解♂2个自交组，自♀×解♂、解♀×自♂2个自交组，共4各实验组。如表1所示，利用（b-c）步骤中6份精卵及自然排放的6份精卵共计建立6个真重复杂交实验组合（表1）。每个实验组，采用搅拌方式进行受精（受精率≥90%），微充气孵化（孵化率≥90%）。

此后，按照蛤仔常规方法进行子代培育，获得了4个实验组均可以获得存活子代，且各实验组子代在存活率均10%以上，彼此间无显著差别（P＜0.05）（表2）。表2结果表明：除了自然排放配子可以成功获得子代外，利用解剖配子完全可以获得存活子代，而且利用解剖的卵子与自然排放的精子杂交或者解剖的精子与自然的卵子杂交均可以获得正常存活子代。

表1自然排放配子及解剖配子2×2双列实验设计

类别	自然排放♂1-6	解剖配子♂1-6
			自然排放♀1-6	自♀×自♂1-6	自♀×解♂1-6
解剖配子♀1-6	解♀×自♂1-6	解♀×解♂1-6

注：1-6表示从第一个至第六个，即六个真重复。

表24个实验组受精率、孵化率及其子代累积存活率

类别	受精率（%）	孵化率（%）	幼虫9日龄存活率（%）	成体360日龄存活率（%）
					自♀×自♂	99.6 a	97.2 a	79.2 a	15.6 a
自♀×解♂	99.5 a	96.7 a	78.3 a	14.8 a
					解♀×自♂	97.6 a	95.3 a	74.6 a	13.7 a
解♀×解♂	96.3 a	94.8 a	73.6 a	12.5 a

注：解剖配子—解，自然排放配子——自。

实施例2：

（a）、确定时机：2012年7月，以辽宁省大连庄河海洋贝类苗种场虾池中性腺成熟的菲律宾蛤仔为材料，打开双壳后，性腺饱满，发现每一个个体的性腺部位有很多小纹发育至足尖部位，貌似卵粒一样；随机取出100个个体通过阴干3h、流水30min刺激后，100个体（100%）排放配子。

（b）、获取精卵：取60个尚未排放配子的该群体作为样本，打开蛤仔双壳，利用牙签取少量性腺样品放置于载玻片上的一滴新鲜海水中，之后进行镜检，共计42个雌性个体，18个雄性个体。其中，卵子在显微镜下又黑又圆、卵径大小一致、卵膜完整、微微颤动，卵径为70.0±0.5μm；精子在显微镜下100%活跃跳动。其中，卵子采用200目筛绢网过滤，320目筛绢网洗卵，直至卵液澄清为止，卵液放置于2L容器中，共优选出30份雌性个体卵子；精子在卵子处理30min后获取，采用500目筛绢网过滤，共获取10份优选精液，分别放置于10个50mL玻璃烧杯中。

（c）、精卵激活：将卵液在新鲜的海水中放置36min，直到卵子的生发泡破裂，即为活化促熟的卵子。精子放置于新鲜海水中6min，处于跳跃状态即为有受精能力的精子。

（d）、受精孵化：将1份精液与3份卵液受精，每个卵子周围有3-5个精子即可，采用搅拌方式进行受精（受精率≥90%），微充气孵化（孵化率≥90%）。获得了10个父系半同胞家系、30个母系全同胞家系（表3）。此后，按照蛤仔常规方法进行子代培育，获得了27个母系全同胞家系子代。

表3.解剖配子的家系建立设计

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实施例3

（a）、确定时机：2013年6月，以广东省湛江硇洲岛海域性腺成熟的菲律宾蛤仔为材料，打开双壳后，性腺饱满，发现每一个个体的性腺部位有很多小纹发育至足尖部位，貌似卵粒一样；随机取出200个个体通过阴干2h、流水45min刺激后，196个体（98%）排放配子。

（b）、获取精卵：取同一批次30个尚未排放配子的该群体作为样本，打开蛤仔双壳，利用牙签取少量性腺样品放置于载玻片上的一滴新鲜海水中，之后进行镜检，共计23个雌性个体，7个雄性个体。其中，卵子在显微镜下又黑又圆、卵径大小一致、卵膜完整、微微颤动，卵径为60.0±0.5μm；精子在显微镜下100%活跃跳动。其中，卵子采用200目筛绢网过滤，320目筛绢网洗卵，直至卵液澄清为止，卵液放置于2L容器中，共优选出18份雌性个体卵子；精子在卵子处理25min后获取，采用500目筛绢网过滤，共获取6份优选精液，分别放置于6个50mL玻璃烧杯中。

（c）、精卵激活：将卵液在新鲜的海水中放置30min，直到卵子的生发泡破裂，即为活化促熟的卵子。精子放置于新鲜海水中5min，处于跳跃状态即为有受精能力的精子。

（d）、受精孵化：将1份精液与3份卵液受精，每个卵子周围有3-5个精子即可，采用搅拌方式进行受精（受精率≥90%），微充气孵化（孵化率≥90%）。获得了6个父系半同胞家系、18个母系全同胞家系。此后，按照蛤仔常规方法进行子代培育，获得了15个母系全同胞家系子代。

表4.解剖配子的家系建立设计

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Claims (1)

1.一种菲律宾蛤仔的繁育方法，在菲律宾蛤仔性成熟时期，选取性腺饱满的个体作为亲本，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：

a、亲本需保证在阴干、流水刺激后95%以上的个体能够自然排放配子，

b、取a步骤中选取的亲本的性腺样品，将性腺样品置于新鲜海水中进行镜检，选取显微镜下卵子呈现正圆形，卵质为灰黑色、卵膜完整、卵径一致的个体为雌性亲本，其中北方群体的卵径为70.0±0.5μm，南方群体的卵径为60.0±0.5μm，选取显微镜下精子100%跳动的个体为雄性亲本，将获得的卵子用200目筛绢网过滤，320目筛绢网洗卵，直至卵液澄清为止，将获得的精子用500目筛绢网过滤，

c、将b步骤所获得的卵液在新鲜的海水中放置15-45min，直至卵子的生发泡破裂，即为活化成功的卵子，将b步骤所获得的精子在新鲜的海水中放置5-10min，仍处于跳跃状态的精子即为有受精能力的精子，

d、将经过c步骤后的精子放置于活化成功的卵液中受精，每个卵子周围有3-5个精子，采用搅拌的方式进行受精，并微充气孵化，此后按照菲律宾蛤仔的常规方法进行子代培养，获得大量稚贝及成体。