CN1875699A - 一种鱼类的雄核发育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鱼类的雄核发育技术。本发明以四倍体鲫鲤产生的二倍体精子为材料，用紫外线照射失活金鱼卵子的核DNA的遗传活性，然后用二倍体精子与遗传失活的卵子混合，不经染色体加倍处理，受精卵孵化出的鱼苗经饲养，发育成雌雄两性可育的雄核发育鱼，雄核发育鱼自交形成了存活的四倍体后代，为改良鱼类性状提供重要的二倍体配子资源。

Description

一种鱼类的雄核发育方法

技术领域

本发明涉及鱼类的培育，具体涉及鱼类的雄核发育技术。

背景技术

国内外关于鱼类雌核发育研究已有不少的报道，如鲤鱼、泥鳅、鲢鱼、虹鳟、罗非鱼等鱼的雌核发育均有研究报道，申请号为200510031690.8的发明专利申请公开了一种鱼类的雌核发育方法，理论上讲，如果雌核发育的母本性别决定类型是同配型(如二倍体XX型或四倍体XXXX型)，则雌核发育后代中只有雌性个体存在，这样雌核发育后代的选育具有一定局限性。然而如果雄核发育的父本性别决定类型是异配型(如二倍体XY型或四倍体XXYY型)，则雄核发育后代中会存在雌、雄两种个体。因此研究雄核发育技术不但可以大大提高雄核发育后代的存活率，而且在雄核发育的后代中有可能存在雌、雄两性可育的个体。通过对雄核发育后代的选育并使优良的雌雄个体自交来培育新型的改良鱼类，这在生物进化和鱼类育种应用方面都具有重要的意义。但是目前极少有雌雄两性可育雄核发育鱼及他们自交形成存活后代的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种鱼类的雄核发育技术，不仅提高后代存活力，改良鱼类性状，而且还能提供二倍体配子资源，以解决鱼类雌核发育技术在后代选育中存在的局限性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种鱼类雄核发育方法，以四倍体鲫鲤产生的二倍体精子为材料，用经紫外线灭活的金鱼的卵子与其混合，混合1～2分钟后，“受精卵”置于20～21℃水温条件下孵化，孵化出的鱼苗经养殖，获得雌雄两性可育的雄核发育二倍体个体，将达到性成熟的雌、雄核发育鱼产生的精液和卵子混合，以获得大量的存活后代。

下面结合附图进一步详述本发明：

附图说明

图1雄核发育二倍体鲫鲤染色体(2n＝100)

图2雄核发育二倍体鲫鲤的外形

图3雄核发育自交后代的染色体(4n＝200)

一般雄核发育鱼的培育是采用鱼类单倍体精子与遗传物质灭活的单倍体卵子混合，再经过染色体的加倍处理，形成主要依靠精子的遗传物质来发育的二倍体后代。这种使卵子遗传失活，是破坏卵核的染色体，而对卵细胞质成分(mRNA、mtDNA及蛋白质)的损伤尽可能的减少，这样用正常的精子与遗传灭活的卵子受精得到的后代是核质杂交的个体，这种“核质杂交”对雄核发育后代可能产生好的作用，通过对核质杂交个体进行选育，可以在雄核发育后代中获得遗传性状改良的个体。在鱼类雄核发育过程中，用到的精子一般都是单倍体精子，单倍体精子在雄核发育过程中必需有一个染色体加倍处理的过程，而该处理过程对“受精卵”发育有不利影响，会大大降低后代的存活率。

本发明研究一种不经染色体加倍处理过程的雄核发育方法，可以提高后代的存活力。

四倍体鲫鲤(4n＝200)的原始母本为红鲫(Carassius auratus red var.)，原始父本为湘江野鲤(Cyprinus carpio)。四倍体鲫鲤的体色为青灰色，其外形上有些特征介入鲤鱼与红鲫之间，如有两对很短的须(湘江野鲤有2对明显的须，而红鲫无须)，雌、雄四倍体鲫鲤能分别产生二倍体卵子和二倍体精子，但是四体倍鲫鲤在抗逆性、生长速度及生殖力等方面有待改良。

本发明以四倍体鲫鲤产生的二倍体精子为原始材料，与遗传灭活的金鱼的卵子混合，从而启动雄核发育的进行。具体方法为：挤出达到性成熟的雌性金鱼(Carassius auratus)的卵子置于盛有卵巢液的培养皿中，卵巢液刚刚盖过卵子。把盛有卵子的培养皿放在垫有冰袋的摇床上(旋转速度为30～40转/分)，并置于2支功率分别为15瓦的紫外灯下照射处理，紫外灯与卵巢液的距离为10～12厘米，照射时间为3分钟。卵巢液配方如下：4.11g BSA/升，3.8mmol Na₂HPO₄，118.0mmol NaCl，12.7mmol KCl，0.7mmol MgCl₂·6H₂O，2.7mmol CaCl₂，5.5mmol酪氨酸和5.5mmol甘氨酸，pH值调至8.14。

照射过的卵子与四倍体鲫鲤产生的二倍体精子混合，并用干净的鸡毛充分搅拌精子和卵子，1～2分钟后把受精卵平铺到盛有清水的培养皿中，无需染色体加倍处理，胚胎在20～21℃水温下孵化。孵化出的鱼苗在池塘中养殖。通过此方法，获得大量存活的雄核发育实验鱼。观察实验鱼的胚胎发育情况，并记录胚胎发育至原肠胚的百分比和孵化率的情况。用肾细胞直接制片法对二倍体鲫鲤体细胞染色体数目进行了检测。肾细胞直接制片法的方法为：在18～22℃水温下培育实验鱼1～3天后，对实验鱼注射PHA 1～3次，每次剂量为2～8μg/克体重，间隔时间为12～24小时，在解剖取材前2～6小时，注射秋水仙素，剂量为2～4μg/克体重。取出肾组织，在生理盐水下剪碎肾组织，0.075mol/LKCL低渗处理，在20℃温度下低渗40～60分钟；用冰醋酸∶甲醇(1∶3)固定肾细胞1～3次；在冰冻载玻片上滴片；Giemsa染液染色。

实验证明，雄核发育二倍体鲫鲤的孵化率达到了4.1％，雄核发育二倍体鲫鲤的成活率到达了69.5～75.0％。肾细胞直接制片法的检测结果证明雄核发育二倍体鲫鲤的体细胞染色体数目为2n＝100(图1)，这种雄核发育二倍体鲫鲤的性成熟年龄一般为2年，比其原始父本-雄性四倍体鲫鲤的性成熟年龄(1年)推迟，但在生长速度和抗逆性方面明显比四倍体鲫鲤要强，雄核发育二倍体鲫鲤最显著的繁殖特点在于他们能产生二倍体配子(精子和卵子)，其自交获得四倍体后代(图3)，这些二倍体配子可以用来制备新型的四倍体鱼和三倍体鱼。利用雄核发育二倍体鲫鲤自交得到的新型四倍体鲫鲤的生长速度比普通四倍体鲫鲤的生长速度要快50％，而且他们的抗病、抗逆能力都明显比普通四倍体鲫鲤要强。

通过细胞和分子生物学实验证明，二倍体鲫鲤杂交鱼产生二倍体配子的特性可能与早期生殖细胞的核内复制有关。

本发明方法培育的雄核发育二倍体鲫鲤生长速度快，抗病力强，繁殖力高，且能产生大量的二倍体配子。雄核发育二倍体鲫鲤体系的形成创建了一种能够产生大量二倍体配子的新型二倍体鲫鲤杂交鱼品系，为制备新型三倍体鱼和四倍体鱼提供了重要的二倍体配子资源。由两性可育的雄核发育鱼自交产生的大量存活的后代在新品种的选育方面具有重要的意义。

Claims (1)

1、一种鱼类的雄核发育方法，其特征在于以四倍体鲫鲤产生的二倍体精子为材料，用紫外线照射使金鱼卵子的核DNA遗传失活，然后用二倍体精子与遗传失活的卵子混合，混合1～2分钟后，将受精卵置于20～21℃水温条件下孵化，孵化出的鱼苗经养殖，获得雌雄两性可育的雄核发育鱼，选择雌、雄性成熟的雄核发育鱼，将其产生的精液和卵子混合，获得了存活的自交后代。