CN106259132A - 一种获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法，其步骤如下：a、取性腺发育良好的雄性红鳍东方鲀及雌性红鳍东方鲀进行催产，分别取雄性红鳍东方鲀的精液及雌性红鳍东方鲀的卵子，将精液与卵子混合形成受精卵；b、采用冷休克法诱导红鳍东方鲀雄核发育。本发明取雄性红鳍东方鲀的精液及雌性红鳍东方鲀的卵子形成受精卵；用冷休克处理（受精后5~8min，2~4℃冰水，浸泡30~60min），诱导红鳍东方鲀卵核和第二极体一同释放，形成仅有精核的受精卵。这种无需卵子遗传失活，避免了繁琐的操作程序，廉价、易操作，解决了现有理化诱导对受精卵造成伤害的问题，提高了雄核发育率，有利于大规模生产使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的新方法，尤其是一种无需卵子失活、可快速、高效生产红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法。
背景技术
红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是鲀形目中个体最大、毒性最小、经济价值最高的名贵的海水鱼类。其肉质洁白、细嫩，肉味鲜美，享有“鱼中之王”美称。一直为日本、韩国和中国人所青睐，是我国北方海水养殖的首选和出口创汇的优势水产品。红鳍东方鲀雌雄生长速度虽然差异不大，但性成熟的雄鱼肉质好、精巢味美，所以成熟雄鱼价格是雌鱼的2倍。因此，如能采用既不用紫外线照射，也不进行投喂性激素，在生产上推广全雄性红鳍东方鲀养殖，可大幅度提高精巢产量，从而大大提高养殖企业的经济效益50%以上。其成果具有重要的学术意义和应用价值。
雄核发育(androgenesis)是指用精子生产只带父系遗传物质个体的繁殖方式。可用于纯系的建立，同时可冷藏濒危物种的精子，对物种的保护具有特殊的意义。另外，在水产养殖上，由于很多重要经济鱼类不同性别往往表现出不同的生产性能，如体型和体色的差异、生长速度的快慢、性成熟时间的不同等。杨永铨观察到饲养137天后莫桑比克罗非鱼的雄鱼体重增长速度比雌鱼快1.74倍。叶元士等研究发现，饲养2年的黄颡鱼，雌性体重一般为100~200 g，雄性体重一般为200~350 g。所以，通过雄核发育控制鱼类的性别，选择具有最佳生长性能的雄性进行单性养殖，具有极为重要的应用价值。
关于人工诱导雄核发育的研究多见于鱼类，已成功培育出川鲽(Platichthys flesus)、马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus msou)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、溪红点鲑(Salvelinus fontinalus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲫鱼(Carassius auratus)、吉福罗非鱼(Oreochromis niloticus)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudrus)、红鳍东方鲀(Paramisgurnus dabryanus)、斑马鱼(Danio rerio)、虎皮鱼(Puntius tetrazona)等雄核发育二倍体。但是雄核发育二倍体的成活率极低。人工诱导鱼类雄核发育的方法主要包括两个步骤，即卵细胞染色体遗传失活及精子染色体加倍。卵细胞染色体遗传失活是人工诱导雄核发育的关键技术之一。在鱼类雄核发育的诱导中γ射线、Х射线及紫外线(UV)是常用的遗传失活手段。此种灭活方法虽然简单易行，但是用射线破坏卵子细胞核的同时，细胞质和其他细胞器也会遭受到不同程度的破坏，导致其受精后不能正常发育。
探索无需卵子失活的雄核发育方法，以提高后代的存活力是极具应用价值的。
发明内容
为了解决现有技术所存在的上述技术问题，本发明提供了一种获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法，依次按如下步骤进行：
a、取性腺发育良好的雄性红鳍东方鲀及雌性红鳍东方鲀进行催产，分别取雄性红鳍东方鲀的精液及雌性红鳍东方鲀的卵子，将精液与卵子混合形成受精卵；
b、采用冷休克法诱导红鳍东方鲀雄核发育，即将受精卵在受精后5~8min，置于2~4℃冰水中，浸泡30~60min，然后置于常温水中进行孵化；孵化时按照现有技术的孵化方法经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通，及时用吸管吸出死卵，孵化出的鱼苗放入水槽中饲养。
本发明具有如下优点：
本发明取雄性红鳍东方鲀的精液及雌性红鳍东方鲀的卵子形成受精卵；用冷休克处理（受精后5~8min，2~4℃冰水，浸泡30~60min），诱导红鳍东方鲀卵核和第二极体一同释放，形成仅有精核的受精卵。这种无需卵子遗传失活，避免了繁琐的操作程序，廉价、易操作，解决了现有理化诱导对受精卵造成伤害的问题，提高了雄核发育率，有利于大规模生产使用。
附图说明
图1是本发明所制备的雄核发育单倍体红鳍东方鲀染色体（n=22）的图片；
图2是对照组（2n♀× 2n♂）红鳍东方鲀染色体（2n=44）的图片；
图3是引物F0080扩增红鳍东方魨基因组DNA微卫星鉴定结果分析峰图，A图为父本、B图为母本，C图为红鳍东方鲀普通二倍体鱼苗个体，D图为红鳍东方鲀雄核发育鱼苗个体。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：
本实施例提供了一种获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法，具体实施步骤如下：
a、取发育良好的红鳍东方鲀（雌、雄鱼）为亲本，用现有技术的催产方法进行催产，24h后轻压雌鱼腹部，观察是否有卵排出。待有卵排出，将种鱼提起，用力挤压腹部两侧，将卵收集到干净盆中，再将精子也收集到盆中。按现有技术的方法将稀释后的精液与卵子混合形成受精卵。
b、将受精卵在受精后8min，置于4℃冰水中，浸泡30min，然后置于常温水中进行孵化。孵化时按照现有技术的孵化方法经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通，及时用吸管吸出死卵，孵化出的鱼苗放入水槽中饲养。
实施例2：
本实施例提供了一种雄核发育鱼苗的鉴定方法，包括：1、早期胚胎染色体分析鉴定雄核发育鱼苗；2、通过微卫星分子标记鉴定雄核发育鱼苗。具体实施步骤如下：
1、染色体分析鉴定雌核发育鱼苗：
通过早期单个胚胎制片法对实施例1及对照组的红鳍东方鲀体细胞染色体数目进行检测，对照组与实施例1的区别是受精卵未经冷休克处理。
早期单个胚胎制片法为：取实施例1及对照组发育眼胞期的胚胎30~50个，用镊子剖去卵膜和卵黄后放入盛有0.0025%的秋水仙素中处理45min，0.8%的柠檬酸低渗20min，再用预冷的卡诺固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）固定3次，每次15~20min，最后-20℃冷冻过夜。冷滴片，10%吉姆萨染色，镜检，拍照。
图1结果表明：实施例1的雄核发育红鳍东方鲀染色体为单倍体（n=22）。
图2结果表明：对照组染色体为二倍体（2n=44）。
2、用微卫星标记鉴定雄核发育鱼苗
使用海洋动物组织基因组DNA试剂盒（北京，天根，DP324）提取雄核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA。从Gen Bank中以筛选到的红鳍东方鲀多态性微卫星引物中，选取微卫星引物F0080（引物序列F: GGCACTTGTAAATGGCTCT；R: CATCCTGTCCTGCCTACC）对基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系总体积25μl：灭菌去离子水17.8μl，10 x Buffer（Mg2+ free）2.5μl，dNTPs(10mM) 0.5μl，MgCl2（25mM）2μl，Forward Primer（10μM）0.5μl，Reverse Primer（10μM）0.5μl，rTaq E（10μM）0.2μl，DNA模板（100μg·ml-1）1μl。PCR扩增条件：95℃预变性3min，然后进行10个循环， 每个循环包括95℃变性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸30s，然后进行20个循环，每个循环包括95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后在 72℃延伸6min。然后使用3730XL测序列分析仪(美国 ABI 公司)进行STR检测，最后使用Genemapper软件分析SSR数据。
结果表明，经引物F0080扩增后红鳍东方鲀父母本间表现出明显差异（图A、B），符合下一步实验需要；普通鱼苗（32尾）经扩增均出现杂合子（图C）；低温诱导的雄核发育鱼苗（19尾）中，有7尾鱼苗表现出雄核发育个体特征，占总个体的36.84%（图D）。
Claims (2)
1.一种获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法，其特征在于所述方法依次按如下步骤进行：
a、取性腺发育良好的雄性红鳍东方鲀及雌性红鳍东方鲀进行催产，分别取雄性红鳍东方鲀的精液及雌性红鳍东方鲀的卵子，将精液与卵子混合形成受精卵；
b、采用冷休克法诱导红鳍东方鲀雄核发育。
2.根据权利要求1所述的获得红鳍东方鲀雄核发育单倍体的方法，其特征在于所述步骤b的具体步骤如下：
将受精卵在受精后5~8min，置于2~4℃冰水中，浸泡30~60min，然后置于常温水中进行孵化。
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