CN102134593B - 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用，其特征在于，微卫星标记的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2；用于扩增特异微卫星标记的引物，其上下游引物序列分别为SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4。把引物用于半滑舌鳎雌雄个体的鉴定，超雌体的扩增产物片段为218bp，雌性半滑舌鳎的扩增产物为2个DNA片段，大小分别为216-220bp和204-208bp；雄性半滑舌鳎的扩增产物为1个DNA片段，大小为204-208bp。本发明筛选到了半滑舌鳎W和Z染色体的特异性微卫星标记，并设计了微卫星引物。利用该微卫星标记可以快速的鉴定半滑舌鳎ZW雌鱼、WW超雌鱼以及ZZ雄鱼，解决了半滑舌鳎性别控制和单性苗种培育中难以进行WW超雌和ZW正常雌鱼鉴定的难题。

Description

半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用

技术领域

本发明属于水产生物技术中的鱼类性别鉴定和性别控制技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎的性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一种近海温水性大型底层鱼类，其肉质细嫩、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水鱼类主导养殖品种之一。但半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体生长缓慢、个体小，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成。而开展半滑舌鳎遗传性别检测和性别控制技术研究，特别是开展半滑舌鳎全雌苗种研制和生产已成为半滑舌鳎养殖业健康、持续、快速发展的关键。

半滑舌鳎具有雌性特异的性染色体(W染色体)，而雄性性染色体同型(ZZ)(周丽青等，2005)。半滑舌鳎雌鱼产生Z型和W型两种卵子，通过人工雌核发育可以生产ZZ型雄鱼和WW型超雌个体两种雌核发育鱼苗，将WW超雌鱼苗培育成熟，然后与ZZ雄鱼交配，即可大量生产ZW型全雌鱼苗。不过，由于重组交换的存在，在雌核发育鱼苗中也还存在一些ZW型雌性个体。而要筛选培育WW超雌个体，其前提是必须能鉴定出WW超雌个体和普通ZW雌性个体，因而半滑舌鳎WW超雌个体的鉴定成为研制半滑舌鳎全雌鱼苗的关键。

性别特异分子标记是鉴定性别的很有潜力的技术手段。但目前有关鱼类性别特异分子标记和快速鉴定方法的研究只在少数几种鱼类上进行过，如加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)筛选到大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；Griffiths等(2000)在三椎棘鱼(Gasterosteus aculea tus L.)中找到了两个雄性特异的AFLP标记。但是，当应用于另外两种棘鱼时，却不能正确鉴定其性别。Rachael等(2003)比较了4种鲑鱼(北极鲑鱼、大西洋鲑、棕鳟和虹鳟)的Y染色体连锁图谱，分别在北极鲑鱼和虹鳟中找到了2个和6个性别连锁的AFLP标记。但这些标记具有种的特异性，因此应用范围较窄。

由于鱼类性别分化较为原始，雌雄性染色体差异小，因而其遗传性别的鉴定较为困难。虽然采用鱼类的性别特异分子标记可以鉴定出少数鱼类的雌雄性别，但要采用这种标记鉴定ZW雌性个体和WW超雌个体则非常困难。例如，Chen等(2007)分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记，将其转化成SCAR标记后，建立了鉴定半滑舌鳎遗传性别的PCR方法。但因为AFLP标记是一种显性遗传的分子标记，难以区分纯合子与杂合子；因此，Chen等(2007)建立的半滑舌鳎AFLP雌性特异标记和遗传性别鉴定技术可以区分半滑舌鳎ZZ雄性个体和ZW雌性个体，但却不能区分ZW雌性个体和WW超雌个体。迄今，国内外尚未见有关半滑舌鳎WW超雌个体鉴定的分子生物学方法的文献报道。因此，探索能够鉴定出半滑舌鳎ZW正常雌性个体和WW超雌个体的分子生物学方法，对于筛选和大量培育半滑舌鳎WW超雌个体，进而培育半滑舌鳎全雌苗种，具有重要意义和应用价值。而微卫星标记具有共显性、多态性高、符合孟德尔遗传分离规律，与性别连锁等特点，如果筛选出雌性或雄性特异的微卫星标记，根据特异标记的序列设计引物，就有可能建立区分ZW雌性个体和WW超雌个体的分子生物学方法，从而解决半滑舌鳎ZW雌性和WW超雌个体鉴定的难题。而有关半滑舌鳎雌性特异微卫星标记及WW超雌鱼鉴定的分子标记方法，迄今在国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎的性别微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用，即通过筛选性别特异微卫星标记来获得半滑舌鳎WW超雌个体和ZW雌性个体鉴定的分子标记，采用此标记可以解决半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究中不能快速鉴别ZW雌鱼和WW超雌鱼的问题，以弥补现有技术的不足。

本发明通过在半滑舌鳎基因组测序中获得的雌性特异微卫星标记，根据该微卫星标记在ZZ雄鱼、ZW雌鱼和WW超雌鱼中的基因型的差异，建立了采用性别特异微卫星标记鉴定半滑舌鳎ZZ雄鱼、ZW雌鱼和WW超雌鱼的技术方法。为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种的生产提供了可靠的技术手段。

本发明的技术方案如下：

一种半滑舌鳎的性别特异微卫星标记，其特征在于微卫星标记的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。其中SEQ ID NO：1是218bp雌性W染色体特异微卫星标记的序列：

Gaggccgacaggatcgtacataatcccaacttcacaataactccacaattggcactttttgttttgtttttctcttttactttcttaacaattatacacactcggagcccgtatcgcaatgtcacaccgagggtttgtttcttctaaggtcacacacacacacacacacacaggcatgactgaagagtttctgtcgaaaaccaccggagtacgtcgta；

SEQ ID NO：2是206bp雄性Z染色体特异微卫星标记的序列：

Gaggccgacaggatcgtacatcctcccaacttcacaataactccacaattggcacttttttttttctcttttactttcttaacaattacacacactcggagcccgtatcacaatgtcacaccgagggtctgtttcttctaaggtcaaacacacacacacgggcatgactgaagagtttcagttgaaaaccaccggagtacgtcgta。

上述扩增引物的上游引物的序列为SEQ ID NO：3，下游引物的序列为SEQ IDNO：4。其中

SEQ ID NO：3：上游引物5’-gaggccgacaggatcgtac-3’；

SEQ ID NO：4：下游引物5’-tacgacgtactccggtggtttt-3’。

上述的引物用于鉴定半滑舌鳎超雌个体，包括半滑舌鳎基因组DNA提取、微卫星引物扩增、扩增产物的电泳检测步骤，其特征在于半滑舌鳎超雌个体的扩增产物电泳检测为一个DNA片段，大小为216-220bp；而雌性半滑舌鳎的扩增产物电泳检测为2个DNA片段，大小分别为216-220和204-208bp；雄性半滑舌鳎的扩增产物电泳检测为1个DNA片段，大小为204-208bp。

本发明筛选到了半滑舌鳎W染色体和Z染色体的特异性微卫星标记，并根据这些性别特异微卫星标记的序列设计了微卫星引物，利用微卫星引物来建立半滑舌鳎WW超雌鱼的鉴定方法。本发明的方法具有准确、快速、高效等优点，利用该性别特异微卫星标记可以快速鉴定半滑舌鳎ZW雌鱼、WW超雌鱼以及ZZ雄鱼，解决了半滑舌鳎性别控制和单性苗种培育中难以进行WW超雌和ZW正常雌鱼鉴定的难题，对于WW超雌鱼的批量化培育和筛选，以及全雌苗种的规模化生产和养殖，提高养殖产量和经济效益，推动半滑舌鳎养殖产业的健康、持续、快速发展，具有重要意义和产业应用价值。

附图说明：

图1：本发明的性别特异微卫星标记在半滑舌鳎雌性和雄性扩增产物的电泳图谱。

其中：图1的1-12泳道为半滑舌鳎雌性个体，13-24泳道为半滑舌鳎雄性个体；A：半滑舌鳎雌性特异的等位基因；B：在半滑舌鳎雌雄个体中都存在的等位基因。

图2：本发明的半滑舌鳎WW超雌个体微卫星标记电泳分析图谱。

其中：母本泳道为卵裂雌核发育仔鱼的母本；3、21、24和35号泳道的四个个体为WW超雌个体，其它泳道的个体为ZZ雄性个体。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

一、半滑舌鳎性别特异微卫星标记的筛选

1、半滑舌鳎性别特异微卫星标记的获得：

本发明专利中的雌性特异微卫星标记序列来源于我们对半滑舌鳎进行的基因组测序项目。对半滑舌鳎雌性个体和雄性个体采用SOLEXA测序技术分别进行全基因组测序，将雌性个体基因组序列与雄性个体基因组序列进行比对，从中筛选出10多个性别相关微卫星序列，根据这些性别相关微卫星序列，用引物设计软件针对重复单元的侧翼序列设计引物10多对。

2、性别特异微卫星标记的验证：采用12尾半滑舌鳎雄性个体与12尾雌性个体基因组DNA样品对10多个性别相关微卫星标记序列进行PCR扩增，扩增采用15μl体系，其中双蒸水10.6μl；10×Buffer 1.5μl；dNTP(2.5mM)0.8μl；上下游引物各0.5μl；为保证酶的活性最后加入的Takara酶(rTaq 5U/μl)0.1μl；充分蜗旋混匀分装，然后加入相应DNA模板1.5μl；总共15μl。扩增程序：94℃预变性5min，随后变性-退火-延伸按下列程序进行33个循环：94℃变性30S，58-62℃退火30s，72℃延伸30s。最后在72℃延伸5min，结束程序并4℃保存。扩增产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并通过银染方法进行染色，然后观察这些微卫星标记在雌雄个体中的基因型是否有显著差异。结果表明其中1个性别相关微卫星标记CseF-SSR1与半滑舌鳎性别紧密连锁。采用CseF-SSR1微卫星标记的引物SChen-1(上游引物5′-gaggccgacaggatcgtac-3′(SEQ ID NO：3)，下游引物5′-tacgacgtactccggtggtttt-3′(SEQ ID NO：4))扩增性成熟的半滑舌鳎12尾雌鱼和12尾雄鱼基因组DNA，从雌鱼基因组中共扩增出2个等位基因，按照大小顺序分别命名为A、B等位基因。根据与分子量标准比较，A等位基因大小约为216-220bp，B等位基因大小为204-208bp。而从12尾雄鱼基因组中只扩增出204-208bp的B等位基因，而没有扩增出216-220bp的A等位基因(图1)，因此，确定大小为216-220bp的A等位基因为半滑舌鳎雌性W染色体特异的微卫星标记，而204-208bp的B等位基因则为Z染色体特异的雄性微卫星标记。

3、性别特异微卫星标记的回收：

采用性别特异微卫星标记的引物，引物名称为SChen-1(上游引物5’-gaggccgacaggatcgtac-3’，下游引物5’-tacgacgtactccgg tggtttt-3’)扩增性成熟的半滑舌鳎雌鱼和雄鱼鳍条基因组DNA，鳍条基因组DNA提取按照常规方法进行。PCR扩增采用15μl体系，其中双蒸水10.6μl；Buffer(10×)1.5μl；dNTP(2.5mM)0.8μl；上下游引物各0.5μl；为保证酶的活性最后加入的Taka ra酶(rTaq 5U/μl)0.1μl；充分蜗旋混匀分装，然后加入相应DNA模板1.5μl；总共15μl。扩增程序：94℃预变性5min，随后变性-退火-延伸按下列程序进行33个循环：94℃变性30S，58℃退火30s，72℃延伸30s。最后在72℃延伸5min，结束程序并4℃保存。扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，从雌鱼基因组中共扩增出216-220和204-208bp大小的2个等位基因，从雄鱼基因组中扩增出204-208bp的一个等位基因。用刀片分别切下含有216-220和204-208bp DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。

4、性别特异微卫星标记的克隆：

将回收的性别特异微卫星标记DNA片段，采用常规基因克隆方法克隆到商业获得的pMD 18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。

5、半滑舌鳎性别标记序列的确定：

选取含有216-220和204-208bp性别特异微卫星标记DNA片段的阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析。分别获得218bp雌性W染色体特异微卫星标记的序列(SEQ ID NO：1)和206bp(SEQ ID NO：2)雄性Z染色体特异微卫星标记的序列。对获得的性别特异微卫星标记序列在GenBank中进行比对分析后没有找到任何同源序列。

二、用筛选出的标记进行半滑舌鳎超雌鱼的鉴定

1、半滑舌鳎WW超雌鱼的制备；

按照常规方法获取半滑舌鳎成熟卵，采用紫外灭活的半滑舌鳎或花鲈精子诱导半滑舌鳎卵子进行雌核发育，精子的灭活方法如下：首先将100μL新鲜或冷冻-解冻的精液用1mL MPRS(NaCl 60.35mM，KCl 5.23mM，NaHCO₃ 3.0mM，D-Glucose 55.5mM，NaH₂PO₄ 1.8mM，CaCl₂·6H₂O 1.13mM，MgCl₂·6H2O1.13mM)溶液稀释后，用60-80mJ/cm²紫外线照射灭活，即获得紫外灭活的精子。然后用紫外灭活的精子与半滑舌鳎卵子授精，授精后在20-23℃海水中培育，培育20-25分钟后，将上述授精卵转移至日本生产的Bio Press 5506静水压机的压力缸中，采用38-41MP压力进行静水压休克处理，处理时间为4-6min，静水压处理完毕后将卵移入20-23℃海水中进行孵化和培养；在雌核发育仔鱼孵出前后抽样提取DNA，或将这些雌核发育仔鱼培养至12厘米以上，从尾鳍中提取DNA用于WW超雌鱼的检测。

2、半滑舌鳎DNA抽提：包括：1)胚胎和仔鱼DNA抽提方法；2)半滑舌鳎鱼种和成鱼DNA抽提方法。

1)：单个胚胎和仔鱼DNA微量抽提方法：取20-40个半滑舌鳎雌核发育孵出前后的胚胎或仔鱼，将单个胚胎或仔鱼置于1.5ml离心管中，将离心管底部置入液氮0.5厘米深3-5秒钟，拿出后进行研磨和混匀样品，随后加入20μl蛋白酶K溶液，在56℃孵育30-60分钟，加入商业获得的200μl缓冲液GB(TiangenBiotech Co LTD，Beijing)和1μl载体RNA储存液，浓度1μg/μl(载体RNA储存液的配制为将310μg载体RNA溶解在310μl无Rnase酶的双蒸水中)，70C°放置10分钟，待液体变清亮后，简短离心10秒钟；加入200μl的无水乙醇，轻轻颠倒混匀样品，室温放置5分钟，简短离心，将所得溶液全部转入商业可得的吸附柱CR2(Tiangen Biotech Co LTD，Beijing)中，12,000rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中，随后按照CR2柱的操作说明将基因组DNA从柱上洗脱回收，将DNA产物保存在-20度，备用。

2)：半滑舌鳎鱼种和成鱼DNA抽提方法：对于12厘米以上的半滑舌鳎鱼种或成鱼，采取米粒大的尾鳍组织提取DNA，有关鳍条DNA的提取按照常用的酚-氯仿方法进行。

3.半滑舌鳎WW超雌鱼的鉴定

采用性别特异微卫星标记CseF-SSR1的引物SChen-1(上游引物5’-gaggccgacaggatcgtac-3’，下游引物5’-tacgacgt actccgg tggtttt-3’)扩增卵裂雌核发育半滑舌鳎基因组DNA，扩增采用15μl体系，其中双蒸水10.6μl；Buffer(10×)1.5μl；dNTP(2.5mM)0.8μl；上下游引物各0.5μl；为保证酶的活性最后加入的Takara酶(rTaq 5U/μl)0.1μl；充分蜗旋混匀分装，然后加入相应DNA模板1.5μl；总共15μl。扩增程序：94℃预变性5min，随后变性-退火-延伸按下列程序进行33个循环：94℃变性30S，58℃退火30s，72℃延伸30s。最后在72℃延伸5min，结束程序并4℃保存。扩增产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并通过银染方法进行染色，然后分析电泳图谱。如果同时扩增出216-220bp和204-208bp两个等位基因的个体是染色体为ZW型的遗传雌性个体，只扩增出204-208bp等位基因的个体一定是染色体为ZZ型的遗传上为雄性的个体，而只扩增出216-220bp等位基因的个体则是染色体为WW型的遗传上超雌的个体(图2)。采用这种方法即可从大量待测样本中快速鉴定出WW超雌鱼。并且，经本方法鉴定确定的超雌鱼，与正常的ZZ雄性受精都获得了全雌鱼苗，证实了本鉴定方法的准确性。

Claims (4)

1.半滑舌鳎性别特异微卫星标记，其特征在于，微卫星标记的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；其中SEQ ID NO：1是218bp雌性W染色体特异微卫星标记的序列：Gaggccgacaggatcgtacataatcccaacttcacaataactccacaattggcactttttgttttgtttttctcttttactttcttaacaattatacacactcggagcccgtatcgcaatgtcacaccgagggtttgtttcttctaaggtcacacacacacacacacacacaggcatgactgaagagtttctgtcgaaaaccaccggagtacgtcgta；

SEQ ID NO：2是206bp雄性Z染色体特异微卫星标记的序列：Gaggccgacaggatcgtacatcctcccaacttcacaataactccacaattggcacttttttttttctcttttactttcttaacaattacacacactcggagcccgtatcacaatgtcacaccgagggtctgtttcttctaaggtcaaacacacacacacgggcatgactgaagagtttcagttgaaaaccaccggagtacgtcgta。

2.用于扩增出权利要求1所述的微卫星标记的引物，名称为SChen-1，其上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4；其中

SEQ ID NO：3：上游引物5’-gaggccgacaggatcgtac-3’；

SEQ ID NO：4：下游引物5’-tacgacgtactccggtggtttt-3’。

3.权利要求2所述的引物用于半滑舌鳎超雌个体的鉴定的用途，包括半滑舌鳎基因组DNA提取、微卫星引物扩增、扩增产物的电泳检测步骤，其特征在于半滑舌鳎超雌个体的扩增产物为1个DNA片段，大小为216-220bp。

4.权利要求2所述的引物用于半滑舌鳎雌雄个体的鉴定的用途，包括半滑舌鳎基因组DNA提取、微卫星引物扩增、扩增产物的电泳检测步骤，其特征在于雌性半滑舌鳎的扩增产物为2个DNA片段，大小分别为216-220bp和204-208bp；雄性半滑舌鳎的扩增产物为1个DNA片段，大小为204-208bp。

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