CN103555847A - 一种罗非鱼亲子鉴定的方法 - Google Patents

一种罗非鱼亲子鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种罗非鱼亲子鉴定的方法，包括以下步骤：（1）采集待鉴别的罗非鱼样品，提取基因组DNA；（2）用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，选用9对微卫星引物进行PCR扩增；（3）对步骤（2）的PCR扩增产物进行电泳检测；（4）将电泳结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，获得每个个体之间的遗传距离，进行聚类分析，根据个体聚类结果，进行亲子关系鉴定。本发明可以快速准确地对罗非鱼进行亲子鉴定，区分不同家系，在罗非鱼家系选育中有很大的应用价值。

Description

一种罗非鱼亲子鉴定的方法
技术领域
本发明属于鱼类分子标记技术领域，涉及一种罗非鱼亲子鉴定的方法。
背景技术
罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，该鱼上世纪50年代引入我国，得到了较快发展，现在我国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。目前，家系选育是广泛应用于水产育种中的一个方法。选一对亲本配组繁殖，得到的后代就是一个家系，用这种方法构建多个家系，再通过养殖对比试验，分析各家系的生长、性别比例、抗逆等性状。由于罗非鱼性腺发育不同步，一对一配组繁殖获得家系成功率较低，因此常用多尾亲本如1雄多雌或多雄1雌的方法来提高构建家系的成功率，这就需要对后代进行亲子鉴定来确定它们的父本和母本。另外，在养殖对比试验中，为减少环境的影响，常常将不同家系的鱼放在同一池塘中养殖，这样也需要进行亲子鉴定来区别不同的家系。
发明内容
本发明的目的是提供一种罗非鱼亲子鉴定的方法，有助于快速、准确对罗非鱼进行亲子鉴定和家系区分。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种罗非鱼亲子鉴定的方法，包括以下步骤：
（1）采集待鉴别的罗非鱼的血液、鳍条或其他组织样品，采用DNA提取法提取基因组DNA；
（2）用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，选用9个微卫星引物进行PCR
扩增，这9对特异微卫星引物名称和序列列表如下；
正向引物DNA序列(5'-3') 反向引物DNA序列(5'-3') 退火温度
GTTTTGCAGCACATCACCTG GCCACAGTGACTTGACCACA 59℃
AGCTGCTGGGTGCTCTGA CTGCAACCTGCAGAGGAAAC 59℃
TGCTGGTTAAAAGAAAGAATG TTATGGGTGTTTAGTCTGGAA 55℃
TATAGAGGGGTGAGGGGAGAT AGAATACAAGCGCCACACAT 55℃
TCGTGCAGCCAAACTTTCATC CGACGCAGCCGAGCAG 55℃
AAAGGCTGGCACTGGA CTAAACTCGCCTATGATGGAA 55℃
CAGCTCGATAAAGGGAGACG GCTGCATTAGCATCGTGTGT 55℃
CCCTGGAGAACAGAGTGGTC CTTGGACTTGGCTCTGACCT 55℃
AGCTGTGTTTCCCTTGTGAGA ACCTGGAAACTCACCTGCAA 55℃
（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进
行电泳电泳检测、银染法染色后，拍照；
（4）将步骤（3）的电泳检测结果，进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，获得每个个体之间的遗传距离，进行聚类分析，根据个体间的遗传距离聚类结果，进行亲子鉴定。
所述步骤（2）中，在进行PCR扩增时，PCR反应总体积为10μL，其中含10×反应缓冲液1.0μL，Mg2+2mmol/L，dNTP200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.3U，DNA50ng～80ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。
步骤（2）中，PCR反应条件为：94℃3min；94℃20s，退火20s，72℃20s，25～30个循环；72℃延伸5min。
步骤（4）中，使用的遗传分析软件为populations软件和MEGA3.1软件。
本发明的有益效果：运用本发明所述的方法，可以快速准确地对罗非鱼进行亲子鉴定，区分不同家系，本发明中所选的9对微卫星引物，主要用于罗非鱼遗传图谱的构建，本发明中所选的这9对微卫星引物在罗非鱼中PCR扩增反应稳定、扩增片段清楚、多态性高，比较适用于罗非鱼的亲子鉴定。
附图说明
图1同一家系罗非鱼子代及其亲本12尾和未知来源罗非鱼10尾聚类图。
图2亲本5尾和子代10尾聚类图。
图3罗非鱼3个家系的子代及其亲本聚类图
具体实施方式
下列实施例中基因组DNA参照文献提取（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆试验指南[M].3版.黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.北京：科学出版社，2002：463-471）。
实施例1
同一家系罗非鱼子代及其亲本12尾（子代10尾，父本、母本各1尾），其它未知来源罗非鱼10尾，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。从每尾鱼的尾静脉采血0.5mL，取30μL血细胞抽提基因组DNA。以所取基因组DNA为模板，用9对引物对进行PCR扩增，PCR反应总体积为10μL，其中含10×反应缓冲液1.0μL，Mg2+2mmol/L，dNTP200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.3U，DNA50ng～80ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为：94℃3min；94℃20s，退火20s，72℃20s，30个循环；72℃延伸5min。PCR反应结束后，产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录。将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用populations软件分析获得每个个体之间的遗传距离，再根据遗传距离用MEGA软件进行聚类分析。聚类结果表明（图1），同一家系罗非鱼子代及其亲本聚类在1个大分枝上，可以确定他们的亲子关系，这与已知情况完全相同，而未知来源罗非鱼则聚类在其它分枝上。
其中9对特异微卫星引物名称和序列列表如下：
正向引物DNA序列(5'-3') 反向引物DNA序列(5'-3') 退火温度
GTTTTGCAGCACATCACCTG GCCACAGTGACTTGACCACA 59℃
AGCTGCTGGGTGCTCTGA CTGCAACCTGCAGAGGAAAC 59℃
TGCTGGTTAAAAGAAAGAATG TTATGGGTGTTTAGTCTGGAA 55℃
TATAGAGGGGTGAGGGGAGAT AGAATACAAGCGCCACACAT 55℃
TCGTGCAGCCAAACTTTCATC CGACGCAGCCGAGCAG 55℃
AAAGGCTGGCACTGGA CTAAACTCGCCTATGATGGAA 55℃
CAGCTCGATAAAGGGAGACG GCTGCATTAGCATCGTGTGT 55℃
CCCTGGAGAACAGAGTGGTC CTTGGACTTGGCTCTGACCT 55℃
AGCTGTGTTTCCCTTGTGAGA ACCTGGAAACTCACCTGCAA 55℃
实施例2
罗非鱼父本1尾，母本4尾，混合一起繁殖获得一批子代，从亲本5尾和子代10尾鱼的尾静脉采血0.5mL，取30μL血细胞抽提基因组DNA。以所取基因组DNA为模板，用9对引物对进行PCR扩增，PCR反应总体积为10μL，其中含10×反应缓冲液1.0μL，Mg2+2mmol/L，dNTP200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.3U，DNA50ng～80ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为：94℃3min；94℃20s，退火20s，72℃20s，30个循环；72℃延伸5min。PCR反应结束后，产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录。将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用populations软件分析获得每个个体之间的遗传距离，再根据遗传距离用MEGA软件进行聚类分析。聚类结果表明（图2），亲本1（父本）和亲本4（母本）和10尾子代聚类在1个分枝上，由此可判定，这批子代为亲本1和亲本4繁殖的后代。
其中9对特异微卫星引物名称和序列列表如下：
正向引物DNA序列(5'-3') 反向引物DNA序列(5'-3') 退火温度
GTTTTGCAGCACATCACCTG GCCACAGTGACTTGACCACA 59℃
AGCTGCTGGGTGCTCTGA CTGCAACCTGCAGAGGAAAC 59℃
TGCTGGTTAAAAGAAAGAATG TTATGGGTGTTTAGTCTGGAA 55℃
TATAGAGGGGTGAGGGGAGAT AGAATACAAGCGCCACACAT 55℃
TCGTGCAGCCAAACTTTCATC CGACGCAGCCGAGCAG 55℃
AAAGGCTGGCACTGGA CTAAACTCGCCTATGATGGAA 55℃
CAGCTCGATAAAGGGAGACG GCTGCATTAGCATCGTGTGT 55℃
CCCTGGAGAACAGAGTGGTC CTTGGACTTGGCTCTGACCT 55℃
AGCTGTGTTTCCCTTGTGAGA ACCTGGAAACTCACCTGCAA 55℃
实施例3
罗非鱼1＃家系12尾（子代10尾，父本、母本各1尾），2＃家系10尾（子代8尾，父本、母本各1尾），3＃家系12尾（子代10尾，父本、母本各1尾），从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。剪取每尾鱼尾鳍并抽提基因组DNA，以所取基因组DNA为模板，用9对引物对进行PCR扩增，PCR反应总体积为10μL，其中含10×反应缓冲液1.0μL，Mg2+2mmol/L，dNTP200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.3U，DNA50ng～80ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为：94℃3min；94℃20s，退火20s，72℃20s，30个循环；72℃延伸5min。PCR反应结束后，产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录。将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用populations软件分析获得每个个体之间的遗传距离，再根据遗传距离用MEGA软件进行聚类分析。聚类结果表明（图3），所有个体聚类成3个大分枝，每1个家系的子代及其亲本都聚类在1个大分枝上，根据聚类图表现出的亲子关系，可以区分3个家系。
其中9对特异微卫星引物名称和序列列表如下：
正向引物DNA序列(5'-3') 反向引物DNA序列(5'-3') 退火温度
GTTTTGCAGCACATCACCTG GCCACAGTGACTTGACCACA 59℃
AGCTGCTGGGTGCTCTGA CTGCAACCTGCAGAGGAAAC 59℃
TGCTGGTTAAAAGAAAGAATG TTATGGGTGTTTAGTCTGGAA 55℃
TATAGAGGGGTGAGGGGAGAT AGAATACAAGCGCCACACAT 55℃
TCGTGCAGCCAAACTTTCATC CGACGCAGCCGAGCAG 55℃
AAAGGCTGGCACTGGA CTAAACTCGCCTATGATGGAA 55℃
CAGCTCGATAAAGGGAGACG GCTGCATTAGCATCGTGTGT 55℃
CCCTGGAGAACAGAGTGGTC CTTGGACTTGGCTCTGACCT 55℃
AGCTGTGTTTCCCTTGTGAGA ACCTGGAAACTCACCTGCAA 55℃
                          SEQUENCE LISTING
 
<110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
 
<120>  一种罗非鱼亲子鉴定的方法
 
<130> 
 
<160>  18   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gttttgcagc acatcacctg                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gccacagtga cttgaccaca                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
agctgctggg tgctctga                                                   18
 
 
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
ctgcaacctg cagaggaaac                                                 20
 
 
<210>  5
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
tgctggttaa aagaaagaat g                                               21
 
 
<210>  6
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
ttatgggtgt ttagtctgga a                                               21
 
 
<210>  7
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
tatagagggg tgaggggaga t                                               21
 
 
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
agaatacaag cgccacacat                                                 20
 
 
<210>  9
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
tcgtgcagcc aaactttcat c                                               21
 
 
<210>  10
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  10
cgacgcagcc gagcag                                                     16
 
 
<210>  11
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  11
aaaggctggc actgga                                                     16
 
 
<210>  12
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  12
ctaaactcgc ctatgatgga a                                               21
 
 
<210>  13
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  13
cagctcgata aagggagacg                                                 20
 
 
<210>  14
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  14
gctgcattag catcgtgtgt                                                 20
 
 
<210>  15
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  15
ccctggagaa cagagtggtc                                                 20
 
 
<210>  16
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  16
cttggacttg gctctgacct                                                 20
 
 
<210>  17
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  17
agctgtgttt cccttgtgag a                                               21
 
 
<210>  18
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  18
acctggaaac tcacctgcaa                                                 20
 
 

Claims (4)

1.一种罗非鱼亲子鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）采集待鉴别的罗非鱼样品的血样或鳍条，提取基因组DNA；
（2）用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，选用9个微卫星引物进行PCR扩增，这9对特异微卫星引物名称和序列列表如下:
Figure FDA0000409953330000011
（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测、银染法染色后，拍照；
（4）将步骤（3）的电泳检测结果，进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，获得每个个体之间的遗传距离，进行聚类分析，根据个体间的遗传距离聚类结果，进行亲子鉴定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，在进行PCR扩增时，PCR反应总体积为10μL，其中含10×反应缓冲液1.0μL，Mg2+2mmol/L，dNTP200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.3U，DNA50ng～80ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR反应条件为：94℃3min；94℃20s，退火20s，72℃20s，25～30个循环；72℃延伸5min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，使用的遗传分析软件为populations软件和MEGA3.1软件。
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