CN102864241A

CN102864241A - 一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法

Info

Publication number: CN102864241A
Application number: CN2012103843471A
Authority: CN
Inventors: 李建林; 俞菊华; 唐永凯; 李红霞; 徐跑
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-10-11
Also published as: CN102864241B

Abstract

本发明公布了一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，包括以下步骤：（1）采集待鉴别的罗非鱼样品，提取基因组DNA；（2）用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；（3）对步骤（2）的PCR扩增产物进行电泳检测；（4）根据PCR的电泳检测结果，鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交鱼：尼罗罗非鱼电泳检测结果有1条178bp的条带，奥利亚罗非鱼有1条187bp的条带，尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交鱼有2条条带，分别为178bp和187bp。本发明有助于快速、准确鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼，在罗非鱼种质鉴定、保种和选育中有极大的应用价值。

Description

一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法

技术领域

本发明属于鱼类分子标记技术领域，涉及一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，该鱼上世纪50年代引入我国，得到了较快发展，现在我国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。我国主要养殖的罗非鱼品种有尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus),奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和奥尼杂交罗非鱼等。由于不同品种的罗非鱼有很大的形态特征重叠，这使形态上鉴别不同罗非鱼品种非常困难。另外，罗非鱼品种间很容易杂交，且杂种可育，杂交种形态又与亲本很相似，因此，很容易造成罗非鱼种质混杂，导致优良经济性状退化，这也是目前制约我国罗非鱼养殖业发展的突出问题。运用分子标记技术在DNA水平上寻找不同罗非鱼品种的差异，可以快速、准确鉴别不同罗非鱼品种，为罗非鱼的品种鉴定、种质保护等提供依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，有助于快速、准确鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼，在罗非鱼种质鉴定、保种和选育中有极大的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，包括以下步骤：

（1）采集待鉴别的罗非鱼的血液、鳍条或其他组织样品，采用DNA提取法提取基因组DNA；

（2）用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（3）对步骤（2）的PCR扩增产物进行电泳检测；

（4）根据PCR的电泳检测结果，鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交鱼：尼罗罗非鱼电泳检测结果有1条178bp的条带，奥利亚罗非鱼有1条187bp的条带，尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交鱼有2条条带，分别为178bp和187bp。

步骤（2）中，PCR扩增采用的正义引物序列为：5′AATAAAACAGTTGATGGTGA 3′，反义引物为：5′ AAATGAAGAAACGCCCTCTT 3′。PCR体系总体积20 μL，其中含10×反应缓冲液2 μL，Mg²⁺　2 mmol/L，dNTP　200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板 100 ng～200 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为：94℃ 2min；94℃ 50s，50℃退火 50s，72℃ 50min，30个循环；72℃ 延伸5 min，4℃保存。

步骤（3）中，电泳检测的方法可采用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。

本发明的有益效果：运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地同时将奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼区别开来。

附图说明

图1为奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其两者的杂交鱼PCR电泳检测结果，

其中M：分子量标准

1-8：奥尼罗非鱼

9-14：尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)

15-20：尼罗罗非鱼(♂)×奥利亚罗非鱼(♀)

21-28：尼罗罗非鱼；

图2为待检奥利亚罗非鱼PCR电泳检测结果，

其中M：分子量标准

1-36：待检奥尼罗非鱼

37-39：尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)；

图3为待检尼罗罗非鱼PCR电泳检测结果，

其中M：分子量标准

1-36：待检尼罗罗非鱼

37-39：尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)。

具体实施方式

下列实施例中基因组DNA参照文献提取（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著. 分子克隆试验指南 [M]. 3版.黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.北京：科学出版社，2002：463-471）。

实施例1

种类确定的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼各8尾，尼罗罗非鱼♂×奥利亚罗非鱼♀杂交鱼6尾，尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂杂交鱼6尾，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。每尾鱼取30μL血细胞抽提基因组DNA，分别以提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，正义引物序列为：5′AATAAAACAGTTGATGGTGA 3′，反义引物为：5′ AAATGAAGAAACGCCCTCTT 3′，PCR反应体系总体积为20 μL，其中含10×反应缓冲液2 μL，MgC1₂　2 mmol/L，dNTP 　200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA 100 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为：94℃ 2min；94℃ 50s，50℃退火 50s，72℃ 50min，30个循环；72℃ 延伸5 min，4℃保存。PCR反应结束后，产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。如图1所示，电泳检测发现，奥利亚罗非鱼都只有一条187bp的条带；尼罗罗非鱼都只有一条178bp的条带；尼罗罗非鱼♂×奥利亚罗非鱼♀杂交鱼6尾和尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂杂交鱼6尾都有两条条带，一条为178bp,另一条为187bp，由电泳图谱可将奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼以及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的杂交罗非鱼区别开来。

实施例2

待检奥利亚罗非鱼36尾，以尼罗罗非鱼♂×奥利亚罗非鱼♀杂交鱼3尾作为对照，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。剪取每尾鱼尾鳍并抽提基因组DNA，采用如实施例1所述的方法进行PCR扩增。PCR反应结束后，产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。电泳检测发现，如图2所示，36尾尼奥利亚罗非鱼都只一条187bp的条带，3尾尼罗罗非鱼♂×奥利亚罗非鱼♀杂交鱼有两条条带，一条为178bp,另一条为187bp。根据电泳结果可判定：所检测的36尾鱼均为奥利亚罗非鱼。

实施例3

待检尼罗罗非鱼36尾，以尼罗罗非鱼♂×奥利亚罗非鱼♀杂交鱼3尾作为对照，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。剪取每尾鱼尾鳍并抽提基因组DNA，采用如实施例1所述的方法进行PCR扩增。PCR反应结束后，产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。电泳检测发现，如图3所示，36尾尼罗罗非鱼中34尾鱼有一条178bp的条带， 2尾鱼有两条条带，一条为178bp,另一条为187bp，与尼罗罗非鱼♂×奥利亚罗非鱼♀杂交鱼条带相同。根据电泳检测结果可判定：所检测的36尾鱼中，34尾为尼罗罗非鱼，2尾为杂交罗非鱼。

Claims

1.一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）采集待鉴别的罗非鱼样品，提取基因组DNA；

（2）用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物进行电泳检测；

（4）根据步骤（3）的电泳检测结果，鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交鱼：尼罗罗非鱼电泳检测结果有1条178bp的条带，奥利亚罗非鱼有1条187bp的条带，尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交鱼有2条条带，分别为178bp和187bp。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，PCR扩增采用的正义引物序列为：5′AATAAAACAGTTGATGGTGA 3′，反义引物为：5′ˊ AAATGAAGAAACGCCCTCTT 3′。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，PCR体系总体积20 μL，其中含10×反应缓冲液2 μL，Mg²⁺ 2 mmol/L，dNTP　200μmol/L，上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板 100 ng～200 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。