CN102586449A

CN102586449A - 一种利用issr分子标记技术鉴定狼尾草属牧草的方法

Info

Publication number: CN102586449A
Application number: CN2012100574859A
Authority: CN
Inventors: 张蕴薇; 王乐; 杨富裕; 毛培胜; 于晓丹; 刘斯佳; 李洪超
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-03-06
Filing date: 2012-03-06
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明属于牧草种质资源鉴定领域，具体涉及一种利用ISSR分子标记技术鉴定狼尾草属牧草的方法，其中ISSR-PCR所用的引物为UBC815和UBC835，其核苷酸序列分别为：UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG；UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。本发明填补了应用ISSR分子标记方法区分狼尾草属牧草种(品种)的空白，本发明最终绘制的区分试验所用7份狼尾草属牧草材料的电泳模式图，可作为区分鉴定这7份材料的依据。本发明摆脱了传统形态学鉴定的不可靠因素，快速、准确的区分7份狼尾草属牧草材料，作为种、品种、品系审定的可靠依据，确保种质在生产上的大力推广。

Description

一种利用ISSR分子标记技术鉴定狼尾草属牧草的方法

技术领域

本发明属于牧草种质资源鉴定领域，具体涉及一种利用分子标记技术鉴定牧草的方法。

背景技术

狼尾草属(Pennisetum Rich.)牧草为一年生或多年生禾本科牧草，是优质的牧草资源。其中象草(P.purpureum)具有高产、营养价值丰富并喜高温多雨等特点，美洲狼尾草(P.americanum)品质优，适口性好，美洲狼尾草(父本)与象草(母本)的种间三倍体杂种杂交狼尾草兼具父本与母本的优点，并有适应性强、供草期长的特点，作为草食动物优良的青饲料，在养殖生产中发挥着重要的作用。随着研究的深入，优质狼尾草的引种和选育就显得越来越重要，然而由于狼尾草属种内种间反复杂交，导致遗传分化越来越多样，新老品种繁多，品种间的形态学差异越来越小，且不同地域经常交换，造成同名异物或同物异名现象，单靠传统的形态学鉴定方法已经很难区分如此众多的品种，随着分子生物学技术的迅猛发展，从DNA分子的角度准确可靠地对品种进行基因鉴定成为可能，现阶段已被广泛应用。

DNA分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，分子标记具有较多的优越性：在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；不受外界环境影响；大多数分子标记为共显性，有利于选择隐性性状；分子标记揭示来自DNA的变异；检测手段简单、迅速。现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于物种品种鉴定、亲缘关系鉴别、遗传育种、基因定位、基因克隆等方面。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats，简单序列重复)分子标记是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的，属于DNA分子标记技术的一种。其基本原理是：利用生物基因组中广泛存在的简单重复序列SSR(Simple Sequence Repeat)设计引物，无需预先克隆和测序，在PCR反应中，对与引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行扩增。所扩增的Inter SSR区域的多个条带通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨。与SSR标记相比，ISSR引物可在不同种间通用，不像SSR标记引物具有较强的种特异性；与RAPD标记相比，稳定性高，获得的信息量大；与PFLP相比，具有检测方便、快捷等优点。目前，ISSR分子标记技术被广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。

由于ISSR分子标记快速、简便、可靠、重复性好，并且ISSR-PCR扩增产物多态性高，因此可用于植物品种鉴定。ISSR-PCR可扩增出大量特异性DNA片段，这些特异性片段的组合可作为某一品种区别于其他品种的独特标记，也有人称之为“指纹”。通过检测样品是否具有特有的“指纹”，可以有效的进行品种鉴定。Charter利用ISSR分子标记区分鉴定了可可豆种质，魏臻武在苜蓿基因组ISSR分析的基础上，构建了苜蓿基因组DNA指纹图谱，作为苜蓿品种鉴定的依据。但至今国内外未见应用ISSR分子标记方法区分鉴定狼尾草属牧草的报道。狼尾草属牧草种子和幼苗形态相近，不易区分，应用ISSR分子标记方法鉴定狼尾草属牧草，一方面可弥补传统鉴定方法的不足，另一方面可促进引种、选育过程的规范化、标准化。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利用ISSR分子标记技术鉴定狼尾草属牧草的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用ISSR分子标记技术鉴定狼尾草属牧草的方法，其中ISSR-PCR所用的引物为UBC815和UBC835其核苷酸序列分别为：

UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG；

UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。

所述ISSR分子标记所用引物还可包括UBC817或UBC843，其核苷酸序列分别为：

UBC817-CACACACACACACACAA；

UBC843-CTCTCTCTCTCTCTCTRA。

所述鉴定方法的具体步骤为：

(1)提取狼尾草属DNA，构建DNA池；

(2)利用ISSR-PCR反应扩增狼尾草属DNA；

(3)构建狼尾草属DNA电泳模式图；。

(4)鉴定狼尾草属牧草。

步骤(1)所述狼尾草属牧草的DNA池分别由每种材料的三个单株的DNA等量混合稀释而成，DNA终浓度为10ng/μL。步骤(2)所述ISSR-PCR反应引物及核苷酸序列为UBC815((CT)₈G)、UBC835((AG)₈YC)。

步骤(2)所述ISSR-PCR反应体系及程序：25μL体系：Taq酶2U、10×Taq Buffer 2.5μL、25mM/L的Mg²⁺1.5μL、2.5mM/L的4种dNTP混合物1.2μL、10ng/μl的引物1.5μL、10ng/μl DNA模板1.5μL、ddH₂O补足25μL；；扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性45s，50～60℃退火45s，72℃延伸45s，循环38次，72℃再延伸10min。

步骤(3)中用1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳模式图。

所述绘制电泳模式图，以最终ISSR-PCR扩增产物多态性好、品种区分度高的电泳图谱为基础，选取条带清晰的多态性位点绘制电泳模式图，可直观的区分狼尾草属7种牧草。

本发明还提供了上述方法在鉴定狼尾草属牧草中的应用。

所述狼尾草属牧草优选为杂交狼尾草一号、杂交狼尾草二号、杂交狼尾草三号、象草、杂交狼尾草、紫光狼尾草、阔叶狼尾草。

本发明有效解决了狼尾草属牧草在引种、选育、生产中单靠形态无法进行品种区分的困难。ISSR分子标记快速、简便、可靠、稳定性高、DNA需要量少，可减轻传统品种区分所带来的工作量。本发明大大改善了品种在生产推广过程中，以劣充优，鱼龙混杂，以假乱真的问题。建立起的ISSR-PCR产物电泳模式图可直观的显示种(品种)之间基因的差异性，保证生产科研中种(品种)真实性、一致性，快速有效的鉴定其身份，也可为新品种的登记提供有力的证据，可确保其在生产上的大力推广。

附图说明

图1引物UBC815扩增结果；

图2引物UBC835扩增结果；

图3引物UBC815扩增电泳模式图；

图4引物UBC835扩增电泳模式图；

图5引物UBC817扩增结果；

图6引物UBC843扩增结果；

图7引物UBC817扩增电泳模式图；

图8引物UBC843扩增电泳模式图。

其中，1代表杂交狼尾草一号，2代表杂交狼尾草二号，3代表杂交狼尾草三号，4代表象草，5代表杂交狼尾草，6代表紫光狼尾草，7代表阔叶狼尾草。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 筛选狼尾草属的ISSR分子标记

(1)以搜集到的狼尾草属主要的2个种及其杂交种的7份材料为对象，分别为：杂交狼尾草一号、杂交狼尾草二号、杂交狼尾草三号、象草、杂交狼尾草、紫光狼尾草、阔叶狼尾草；

(2)幼苗培养：选取各品种均匀一致的种子各100粒，温室条件下，培养20d，形成的正常幼苗作为试验材料；

(3)采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根试剂公司)进行单株幼苗的总DNA提取，每种材料随机选取三单株，采用0.8％琼脂凝胶电泳检测并用核酸蛋白分析仪测定DNA样品的浓度见表1，制备每种材料的DNA池，使DNA终浓度为10ng/μL；

表1 样品DNA浓度测定结果

(4)ISSR-PCR反应体系及程序：参考乔良普的已优化体系及程序；

ISSR-PCR反应体系见表2，扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性45s，50～60℃退火45s，72℃延伸45s，循环38次，72℃再延伸10min，最后4℃保存。用于ISSR-PCR反应的试剂均购自Takata生物公司。用1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液为介质电泳检测扩增结果。

表2 ISSR-PCR反应体系

(5)引物筛选：以7份狼尾草属牧草的DNA池筛选ISSR随机引物，共对UBC大学公布50条引物(参见表3)进行扩增，选出扩增条带清晰、特异性条带多、不同样品区分度高的引物；

表3 50条引物信息

注：R＝(A，G)，Y＝(C，T)

本试验ISSR-PCR反应引物采用UBC公布的序列，并由上海生工合成。本试验根据不同引物Tm值调整退火温度，退火温度设定为Tm-5℃。根据扩增条带的清晰度及多态性，筛选出10条引物UBC808、UBC809、UBC815、UBC817、UBC822、UBC826、UBC835、UBC843、UBC845、UBC846。

(6)引物精确筛选，选出条带清晰、种(品种)区分度高的引物UBC815、UBC835；

(7)以引物UBC815、UBC835扩增电泳图为基础绘制电泳模式图(图3-4)，其中，1代表杂交狼尾草一号，2代表杂交狼尾草二号，3代表杂交狼尾草三号，4代表象草，5代表杂交狼尾草，6代表紫光狼尾草，7代表阔叶狼尾草。根据不同材料的特异性条带可以鉴定和区分不同材料。引物UBC815对各份材料扩增结果显示，1特征片段1000bp左右，2特征片段1800bp左右，3同时具备三条特征片段1000bp左右、300bp左右、200bp左右，4特征片段1000bp左右，5同时具备三条特征片段1000bp左右、750bp左右、300bp左右，6同时具备两条特征片段1500bp左右、1300bp左右，7同时具备三条特征片段1500bp左右、1300bp左右、600bp左右，根据上述特征片段除了无法将1与4区分外，其余的都可两两区分，参见图3，引物UBC835对各份材料扩增结果显示1具备三条特征片段750bp左右、270bp左右、150bp左右，4仅一条特征片段750bp左右，可将1与4区分，参见图4。

应用ISSR-PCR反应对7份狼尾草属牧草种质DNA池进行扩增，根据扩增条带的清晰度及多态性从UBC公布的50条引物UBC801-UBC850中筛选出10条条带清晰、多态性高引物，再用7个DNA池对已筛出的10条引物精确筛选，扩增产物均用1％琼脂糖凝胶，以0.5×TBE缓冲液为介质电泳检测。其中引物UBC815、UBC835扩增的“指纹”条带特异性强，各电泳图请分别参见图1-2。这四种引物，种(品种)区分度高，可作为区分7份材料的依据，并绘制区分7份材料的电泳模式图。

实施例2 鉴定方法1

(1)提取狼尾草属DNA，构建DNA池；

选取需鉴定杂交狼尾草一号、杂交狼尾草二号、杂交狼尾草三号、象草、杂交狼尾草、紫光狼尾草、阔叶狼尾草这七份狼尾草属材料中的一份或几份，从各份待鉴定材料中选取均匀一致的种子各100粒，温室条件下培养20d，形成正常种苗，取单株幼苗叶片，采用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒提取各份狼尾草属牧草基因组DNA，每份材料分别提取三单株，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测并用核酸蛋白分析仪测定DNA样品浓度，用每种材料的三个单株的DNA等量混合稀释制备各份需鉴定狼尾草属材料DNA样品的DNA池，根据DNA样品浓度测定结果，使各份材料DNA池终浓度为10ng/μL。

(2)利用ISSR-PCR反应扩增狼尾草属DNA；

以UBC815、UBC835为引物，经过ISSR-PCR反应，对各份狼尾草属牧草DNA池进行扩增。ISSR-PCR反应体系及程序：即25μL体系：Taq酶2U、10×Taq Buffer 2.5μL、Mg²⁺(25mM)1.5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)1.2μL、Primers(10ng/μl)1.5μL、DNA模板(10ng/μl)1.5μL、ddH₂O补足25μL，扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，循环38次，72℃再延伸10min，最后4℃保存。

(3)构建狼尾草属DNA电泳模式图；

用1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液为介质电泳检测扩增结果。

(4)鉴定狼尾草；

以电泳图谱为基础，绘制电泳模式图(参见图3、图4)，其中，1代表杂交狼尾草一号，2代表杂交狼尾草二号，3代表杂交狼尾草三号，4代表象草，5代表杂交狼尾草，6代表紫光狼尾草，7代表阔叶狼尾草。由图3可以鉴别2、3、5、6、7、1或4，由图4可鉴别1和4。

实施例3 鉴定方法2

(1)提取狼尾草属DNA，构建DNA池；

(2)利用ISSR-PCR反应扩增狼尾草属DNA；

以UBC815、UBC835、UBC817和UBC843为引物，经过ISSR-PCR反应，对各份狼尾草属牧草DNA池进行扩增。ISSR-PCR反应体系及程序：即25μL体系：Taq酶2U、10×Taq Buffer 2.5μL、Mg²⁺(25mM)1.5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)1.2μL、Primers(10ng/μl)1.5μL、DNA模板(10ng/μl)1.5μL、ddH₂O补足25μL，扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，循环38次，72℃再延伸10min，最后4℃保存。

(3)构建狼尾草属DNA电泳模式图；

用1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液为介质电泳检测扩增结果。

(4)鉴定狼尾草；

以电泳图谱(参见图1、2、5、6)为基础，绘制电泳模式图(参见图3、4、7、8)，其中，1代表杂交狼尾草一号，2代表杂交狼尾草二号，3代表杂交狼尾草三号，4代表象草，5代表杂交狼尾草，6代表紫光狼尾草，7代表阔叶狼尾草。由图3可以鉴别2、3、5、6、7、1或4，由图4可鉴别1和4，由图7可鉴别1、6、7，由图8可鉴别5、6、7。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用ISSR分子标记技术鉴定狼尾草属牧草的方法，其特征在于，ISSR-PCR所用的引物为UBC815和UBC835，其核苷酸序列分别为：UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG；

UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ISSR分子标记所用引物还可包括UBC817或UBC843，其核苷酸序列分别为：

UBC817-CACACACACACACACAA；

UBC843-CTCTCTCTCTCTCTCTRA。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)提取狼尾草属DNA，构建DNA池；

(2)利用ISSR-PCR反应扩增狼尾草属DNA；

(3)构建狼尾草属DNA电泳模式图；

(4)鉴定狼尾草属牧草。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述狼尾草属牧草的DNA池分别由每种材料的三个单株的DNA等量混合稀释而成，DNA终浓度为10ng/μL。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述ISSR-PCR反应所用引物为UBC815和UBC835。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述ISSR-PCR反应体系及程序为：25μL体系：Taq酶2U、10×Taq Buffer 2.5μL、25mM/L的Mg²⁺1.5μL、2.5mM/L的4种dNTP混合物1.2μL、10ng/μl的引物1.5μL、10ng/μl的DNA模板1.5μL、ddH₂O补足25μL；扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性45s，50～60℃退火45s，72℃延伸45s，循环38次，72℃再延伸10min。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中用1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳模式图。

8.如权利要求1～7任意一项所述的方法在鉴定狼尾草属牧草中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述狼尾草属牧草为杂交狼尾草一号、杂交狼尾草二号、杂交狼尾草三号、象草、杂交狼尾草、紫光狼尾草、阔叶狼尾草。