CN113355446B - 与白菜紫色性状相关的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及与白菜紫色性状相关的InDel分子标记及其应用。本发明提供与白菜紫色性状相关的InDel分子标记，所述InDel分子标记的多态性为缺失/插入序列，通过序列如SEQ ID NO.2‑3所示的特异性引物扩增得到。该分子标记可用于区分鉴定紫色白菜和绿色白菜，具有较高的准确性，可作为紫色白菜育种的分子标记辅助选择工具，在实际生产中具有重要意义。

Description

与白菜紫色性状相关的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及与白菜紫色性状相关的InDel分子标记及其应用。

背景技术

白菜是十字花科、芸薹属的草本植物。大白菜(Brassica rapaL.ssp.pekinensis)为白菜的一种，是原产于中国的一种蔬菜作物，在中国的芸薹属蔬菜作物当中种类多，种植面积广，在生产中占据十分重要的经济地位。紫色大白菜和绿色大白菜是白菜的两种不同表型颜色，紫色大白菜表现为叶片上、下表皮均为紫色，内叶至外叶均为紫色，绿色大白菜则整株为绿色，其表型差异主要由花青素含量不同所致。

花青素苷属类黄酮类物质，为构成植物颜色的重要水溶性色素之一，常见花青素有6种，包括矢车菊花青素苷(Cyanidin)、天竺葵花青素苷(Pelargonidin)、芍药花青素苷(Peonidin)、锦葵花青素苷(Malvidin)、矮牵牛花青素苷(Petunidin)、飞燕草色素(Delpinidin)。花青素不仅使紫色大白菜叶色鲜亮，还具有保健功能，有研究表明其强大的抗氧化能力能帮助人类预防癌症、心脑血管等疾病。近年来育种学家对紫色基因进行遗传性状、花青素成分测定、基因定位及相关基因的表达进行了研究，探索花青素表达模式及决定基因。

随分子生物学技术逐渐发展，人们对白菜类蔬菜叶色相关基因做了许多研究，研究叶色决定基因及其定位，并分析其调控机理。对叶色决定基因进行定位研究，发现不同叶色决定基因分别定位于A02、A03、A07、A09染色体，于不同材料中，对白菜叶色调控起一定作用的基因位于不同染色体，表明白菜叶色调控过程相对复杂。调控花青素代谢途径的转录调控蛋白主要有三类，R2R2-MYB、bHLH及WDR，其中R2R2-MYB、bHLH属于转录调控因子，WDR参与调控过程，三者组成MBW三元复合体。与白菜叶色相关基因调控过程相对复杂，开发大白菜叶色相关基因的分子标记对研究白菜紫色基因和紫色性状具有一定意义，并能够作为一种分子标记辅助育种手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种与白菜紫色性状相关的InDel分子标记，本发明的另一目的是提供该分子标记的应用。

第一方面，本发明提供与白菜紫色性状相关的InDel分子标记，所述InDel分子标记的多态性为缺失/插入序列，所述分子标记通过序列如SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物扩增得到。

正向引物：5’-ATGGATGATCTGTCGTATAGGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

反向引物：5’-CTAATCAAGCTCCCCAGTCTCTTC-3’(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。如SEQ ID NO.1所示的序列为紫色白菜A02染色体的叶色相关基因特有序列，与白菜的紫色基因紧密连锁。

以上所示的正向引物和反向引物涵盖的待扩增区域为本发明所述的紫色白菜A02染色体的叶色相关基因特有序列的全部序列。

第二方面，本发明提供用于检测所述InDel分子标记的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO.2-3所示。

第三方面，本发明提供含有所述特异性引物对的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的其他试剂，包括但不限于PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、ddH₂O等。

第四方面，本发明提供所述InDel分子标记或所述特异性引物对或所述试剂盒在白菜叶色性状鉴定或辅助鉴定中的应用。

第五方面，本发明提供所述InDel分子标记或所述特异性引物对或所述试剂盒在白菜遗传育种中的应用。

第六方面，本发明提供所述InDel分子标记或所述特异性引物对或所述试剂盒在选育紫色白菜中的应用。

第七方面，本发明提供所述InDel分子标记或所述特异性引物对或所述试剂盒在白菜紫色基因检测中的应用。

第八方面，本发明提供一种鉴定白菜紫色性状的方法，该方法为：以待测白菜的基因组为模板，利用序列如SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对进行PCR扩增，若存在1188bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为紫色白菜，若不存在1188bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为非紫色白菜。

优选地，该方法为：以待测白菜的基因组为模板，利用序列如SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对进行PCR扩增，若存在1188bp的扩增产物，且其序列如SEQ ID NO.1所示，则待测白菜鉴定为紫色白菜，若不存在1188bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为非紫色白菜。

优选地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、20s，35个循环；72℃、5min。

所述PCR扩增的反应体系中，所述特异性引物对中的正向引物和反向引物的浓度为10μM。

进一步优选地，所述PCR扩增的反应体系如下：2×Rapid Taq Master Mix 5μl，正向引物(10μM)0.3μl，反向引物(10μM)0.3μl，gDNA 1μl，ddH₂O：3.4μl。

对于PCR扩增产物的检测可采用本领域常规的技术手段，例如：电泳检测、DNA测序等。本发明优选采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测。

作为本发明的优选方案，所述鉴定白菜紫色性状的方法包括如下步骤：

(1)从待测植株样品中提取基因组DNA。

(2)采用SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR扩增，SEQ ID NO.2所示的正向引物结合于紫色白菜特有序列的上游，SEQ ID NO.3所示的反向引物结合于紫色白菜特有序列的下游。

(3)通过电泳检测PCR扩增产物中是否存在1188bp的产物，若存在1188bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为紫色材料，若不存在1188bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为非紫色材料。

上述步骤(1)中，所述待测植株样品可为植株的整体或植株的一部分，例如叶片、茎。本发明优选使用植株叶片。

本发明中“白菜”是指十字花科芸薹属的白菜，白菜类蔬菜包括大白菜、小白菜、乌塌菜、青梗菜、菜心等。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种与白菜紫色性状相关的InDel分子标记，该分子标记可用于区分鉴定紫色白菜和绿色白菜，具有较高的准确性，可作为紫色白菜育种的分子标记辅助选择工具，在实际生产中具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例3中紫色大白菜及绿色大白菜的PCR扩增产物电泳结果，其中，DNA marker的条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图2为本发明实施例3中紫色大白菜及绿色大白菜的PCR扩增产物电泳结果，其中，DNA marker的条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1与白菜紫色性状相关的InDel分子标记的开发

对不同品种的紫色大白菜和绿色大白菜样本分别进行转录组测序和序列分析，发现差异表达基因，经筛选确定目标差异表达基因，该差异表达基因存在序列的插入，其为与紫色大白菜叶色相关的核苷酸长度多态性。根据上述发现的紫色白菜特有基因片段设计正向引物InDelA02-C3563-F，序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物InDelA02-C3563-R，序列如SEQ ID NO.3所示。利用正、反向引物对紫色白菜gDNA及绿色白菜gDNA进行扩增，紫色白菜gDNA中扩增得到片段长度为1188bp(序列如SEQ ID NO.1所示)，绿色白菜中无扩增片段。

实施例2利用InDel分子标记进行白菜叶色鉴定的方法

本实施例提供利用实施例1的InDel分子标记进行白菜叶色鉴定的方法，具体如下：

1、从待测植株样品中提取基因组DNA(gDNA)

(1)取一指甲盖大小白菜叶片样品置2ml管子中，加入2粒4mm钢珠，加入200μl TPS溶液；

(2)于50Hz粉碎机粉碎50s；

(3)加入600μl TPS，75℃水浴30min；

(4)12000rpm离心10min；

(5)取上清加等体积异丙醇，-20℃放置0.5h以上；

(6)12000rpm离心5min，去上清；

(7)加入1ml 75％酒精，静置10min，12000rpm离心2min，去酒精，干燥；

(8)加入100μl ddH₂O，混合均匀，-20℃保存。

2、PCR扩增

PCR扩增反应体系如下：2×Rapid Taq Master Mix：5μl，正向引物F：0.3μl，反向引物R：0.3μl，gDNA：1μl，ddH₂O：3.4μl。

PCR扩增程序如下：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、20s；72℃、5min。

3、PCR扩增产物的检测和性状鉴定

利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，琼脂糖凝胶制备及电泳的操作步骤如下：

(1)配置1.5％琼脂糖凝胶

①称取1.5g琼脂糖加入100ml 0.5％TAE缓冲液；

②加热至琼脂糖完全溶解，加入7μl核酸染料，混合均匀；

③立即进行灌胶并插入梳子，注意倒胶后不要有气泡，梳子在一条直线上，不要倾斜；

④室温放置直至琼脂糖凝胶凝固。

(2)琼脂糖凝胶电泳

利用(1)中配置的凝胶进行电泳检测，电泳条件为180V，15min。判断PCR扩增产物中是否存在1188bp的产物，若存在1188bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为紫色白菜，若不存在1188bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为非紫色白菜。

实施例3利用InDel分子标记进行白菜叶色鉴定的应用

利用实施例2的方法对48份大白菜材料进行鉴定，分别以不同大白菜材料gDNA为模板、以SEQ ID NO.2-3所示引物进行PCR扩增，电泳检测结果如图1和图2所示，其中，其中26份材料(编号1-18、21、22、25、26、31、32、37、38)均有长度为1188bp的PCR产物，符合紫色大白菜特征；其中22份材料(编号19、20、23、24、27-30、33-36、39-48)未见PCR产物出现，符合绿色大白菜特征。将上述分子标记鉴定结果与实际植株的叶色进行比较，结果表明26份材料(编号1-18、21、22、25、26、31、32、37、38)为紫色白菜材料，琼脂糖凝胶电泳结果与紫色表型相符；22份材料(编号19、20、23、24、27-30、33-36、39-48)为绿色白菜材料，琼脂糖凝胶电泳结果与绿色表型相符。由此可见，InDelA02-C3563-F、InDelA02-C3563-R可作为区分大白菜材料的叶色为紫色或绿色的标记，具有较高的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 与白菜紫色性状相关的InDel分子标记及其应用

<130> KHP211112210.1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggatgatc tgtcgtatag gttgagaaaa ggtgcatgga ctgctgaaga agattgtctc 60

ttgagggagt gcgttgataa gtttggagaa ggaaaatggt acctagttcc tgcaagagct 120

ggtatgttat ttacacagat aactgatcac gaatattcgt ttctctatat ttaagacgta 180

tttaattagt tgctcactaa tgttgttgct aaaactctct cattaatttg tctttcagta 240

aaaacactca aacgtcgtac acgtacatta tttactttgc tgtgcaaaaa ttattcatga 300

taaaatgaaa aatgtataac aacttagcaa gagacgttta agcaaaaaaa aaaaaaaaaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacttagcaa gagatgaaag caatctctga 420

aaacgtataa ttgatatatg gttttttgat aatataaaaa ctgatagagt taattatgtc 480

aatatttgga tttgtagggc taaaccgatg cagaaagagc tgcagactaa gatggttgaa 540

ctacttgaag ccaagcatca aaagaggaaa acttagctct gatgaagttg atcttctttc 600

tcgccttcat aagcttctag gaaacaggtt ttgtttctga agctccacat tttattttta 660

acctagtttc tactttaata ctatagatat ttaccgttta caatgcttag gtggtccttg 720

attgccggta gattacctgg tcggaccgct aatgacataa aaaattactg gaacacctat 780

atgagtaaga agccagaccc attttgtaag accgagatga aagaacgaaa ccctactgga 840

tcagagacca taccagcccc aaaagtcgat gtaataaagc ctcaacctcg atctttctgc 900

aataaaaaca gtctcagcca cgtcaacggc ctcccagaag ttgccctaga tgatggtatc 960

acatgtaaca aagctgacga gaaatataag catgtggaaa acgtaatgga tgcaaagagt 1020

atgtggtggg agaatttgct agtggaaatc ggaggggttg gtgcggtgga tccggcagcc 1080

atgggtaccg acgaggcagg tacttcgttg atgaactcat cgtcgtccgt atttgatatt 1140

gagcaacttt ggagtttgtt caatgaagag actggggagc ttgattag 1188

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggatgatc tgtcgtatag gtt 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctaatcaagc tccccagtct cttc 24

Claims (9)

1.与白菜紫色性状相关的InDel分子标记基因片段，其特征在于，所述InDel分子标记基因片段的多态性为缺失/插入序列，通过序列如SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物扩增得到。

2.根据权利要求1所述的InDel分子标记基因片段，其特征在于，所述插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.用于检测权利要求1或2所述的InDel分子标记基因片段的特异性引物对，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.2-3所示。

4.含有权利要求3所述的特异性引物对的试剂盒。

5.权利要求1或2所述的InDel分子标记基因片段或权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在白菜紫色或绿色叶色性状鉴定或辅助鉴定中的应用。

6.权利要求1或2所述的InDel分子标记基因片段或权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在紫色或绿色白菜遗传育种中的应用。

7.权利要求1或2所述的InDel分子标记基因片段或权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在选育紫色白菜中的应用。

8.一种鉴定白菜紫色性状的方法，其特征在于，以待测白菜的基因组为模板，利用序列如SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对进行PCR扩增，若存在1188 bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为紫色白菜，若不存在1188 bp的扩增产物，则待测白菜鉴定为非紫色白菜。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：95℃、3 min；95℃、15 s，56℃、15 s，72℃、20 s，35个循环；72℃、5 min；

和/或，所述PCR扩增的反应体系中，所述特异性引物对中的正向引物和反向引物的浓度为10 μM。

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