CN106244687B - 一种水稻gs3功能基因分子标记及检测方法 - Google Patents
一种水稻gs3功能基因分子标记及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种水稻GS3功能基因分子标记，所述分子标记的名称分别为HGS3F3R3、HGS3F7R7、HGS3F10R10、HGS3F15R15，与其对应的核苷酸序列如Seq ID No.1、Seq ID No.4、Seq ID No.7、Seq ID No.10所示序列。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体地说，涉及一种与水稻GS3功能基因紧密连锁的分子标记及检测方法。
背景技术
水稻作为人类最重要的粮食作物，改良水稻品质、提高水稻产量一直是作物育种学研究主要内容，由于我国耕地减少人口却增多，粮食产量不高，因此提高水稻产量有着特别重要的战略性意义，也是保障粮食安全的重要路径。因此，对水稻的研究，特别是对水稻产量的主要影响因素如水稻穂数、每穗的粒数、每粒重量等的研究从位间断。而水稻的粒重是由水稻的长和圆等性状所决定的,GS3基因定位于水稻第3染色体近着丝粒区（康美花,王丰,贺浩华等.稻米外观品质性状的遗传与标记定位研究进展[J].广东农业科学,2010,37(5):168-170.），影响着水稻种子籽粒大小，经过研究证实了水稻的GS3基因控制水稻籽粒的长粒和圆粒，从而影响水稻的产量和品质，水稻GS3基因作为负调节控制水稻籽粒的大小，性状表现为长粒的水稻不含有GS3蛋白（丁丹,张亚东,郑佳等.水稻粒长基因GS3和qGL3功能标记的设计及应用[J].江苏农业学报,2014,(6):1191-1197.）。这些研究成果对水稻品种改良及水稻产量提升等育种方面有着重要作用。
稻谷粒形的遗传基础比较复杂，是典型的数量性状。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL(Quantitative Trait Locus) 进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子来进行研究。利用这种方法，近年来已经发现和克隆了部分控制稻谷粒形的QTLs。总体来看，已克隆与粒形有关的基因主要有3 类：第一类为多效基因，对粒形的影响只是其作用之一，但效应可能很大。其典型代表为矮秆小粒基因，如 d11(Tanabe etal.2005.A Novel Cytochrome P450Is Implicated in Brassinosteroid Biosynthesisvia the Characterization of a Rice Dwarf Mutant,dwarf11,with Reduced SeedLength.The Plant Cell3:776-790)、d1(Ueguchi-Tanaka et al.2000.Rice dwarfmutant d1,which is defective in theαsubunit of the heterotrimeric G protein,affects gibberellin signal transduction.Proc Natl Acad Sci USA 21:11638-11643) 等，均表现植株矮化，谷粒短而圆。此类基因一般难以直接应用于生产；第二类为粒宽主效控制基因，可能对水稻的籽粒灌浆速度有一定影响，对其它农艺性状的影响较小。已克隆的基因主要有 GW2(Song et al.2007.A QTL for rice grain width and weightencodes a previously unknown RING-type E3ubiquitin ligase.Nature Genetics 39:623-630)、GW5(Weng et al.2008.Isolation and initial characterization of GW5,amajor QTL associated with rice grain width and weight.Cell Research 12:1199-1209)、GS5(Li et al.2011.Natural variation in GS5plays an important role inregulating grain size and yield in rice.Nature Genetics 12:1266-1269) 和 qGW8(Wang et al.2012. Control of grain size,shape and quality by OsSPL16inrice.Nature Genetics 8:950-954)；第三类为粒长主效控制基因，可能对粒宽或水稻的籽粒灌浆速度有一定影响，对其它农艺性状的影响较小。已克隆的基因主要有 GS3(Zhang etal. 2013.Fine mapping of GS3, a dominant gene for big grain rice. The CropJournal 1:160-165)。
基于DNA多态性的分子标记因其具有的独特优越性而成为解决这些科学问题的有力工具之一。其优越性体现在 ：①表现稳定，多态性直接以 DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响 ；②数量多，理论上遍及整个基因组 ；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件 ；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体 ；⑥成本低，一般实验室均可进行。 对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 基于这些特点，分子标记现已被广泛用于水稻有关功能基因标记、基因克隆、遗传图谱和物理图谱的绘制、农艺性状的分子标记辅助选择、生物进化、遗传多样性研究等许多方面研究。
尽管已克隆出一批控制水稻粒形的基因，然而目前对其遗传基础的了解还相当有限。因此，迫切需要应用数量较大的种质资源，挖掘更多新的水稻粒形控制基因位点，筛选出相关的特异性标记，可为水稻GS3功能基因分子标记辅助选择的开展提供极大的便利，并可为理解控制水稻粒形的基因得遗传基础提供条件，也为更好更快地培育具有理想粒形的水稻新品种提供基因资源和技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供水稻GS3功能基因分子标记及检测方法，通过检测这些与水稻GS3功能基因紧密连锁的分子标记，从而获得水稻圆粒和长粒功能基因的确切标记，为水稻圆粒和长粒品种选育奠定理论基础。
本发明提供一种水稻GS3功能基因分子标记，所述分子标记的名称分别为HGS3F3R3、HGS3F7R7、HGS3F10R10、HGS3F15R15，与其对应的核苷酸序列如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。
所述分子标记HGS3F3R3的引物对的正向引物如Seq ID No .2所示序列，反向引物如Seq ID No .3所示序列；所述分子标记HGS3F7R7的引物对的正向引物如Seq ID No .5所示序列，反向引物如Seq ID No .6所示序列；所述分子标记HGS3F10R10的引物对的正向引物如Seq ID No .8所示序列，反向引物如Seq ID No .9所示序列；所述分子标记HGS3F15R15的引物对的正向引物如Seq ID No .11所示序列，反向引物如Seq ID No .12所示序列。
所述Seq ID No .2：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’，
Seq ID No .3：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’；
Seq ID No .5：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’，
Seq ID No .6：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’；
Seq ID No .8：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’，
Seq ID No .9：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’；
Seq ID No .11：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’，
Seq ID No .12：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’。
所述分子标记是由上述引物对以水稻基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
所述分子标记如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。
本发明的与水稻GS3功能基因紧密连锁的分子标记，即水稻粒形主效基因位点GS3的分子标记（HGS3F1R1、HGS3F2R2、HGS3F3R3、HGS3F4R4、HGS3F5R5、HGS3F6R6、HGS3F7R7、HGS3F8R8、HGS3F9R9、HGS3F10R10、HGS3F11R11、HGS3F12R12、HGS3F13R13、HGS3F14R14、HGS3F15R15、HGS3F16R16、HGS3F17R17、HGS3F18R18、HGS3F19R19、HGS3F20R20、HGS3F21R21、HGS3F22R22、GS3-FR1、GS3-FR2、gS3-F1R），由下述之一的引物对经 PCR 扩增获得：
1) 分子标记名称，HGS3F1R1
Seq ID No .：5’- TACTCGTTGGAAGTGTGCGT -3’
Seq ID No .：5’- TTGGGGTTGGGCGTAAATGA -3’
2) 分子标记名称，HGS3F2R2
Seq ID No .：5’- CCAAAAACGGCAATCCCCTC-3’
Seq ID No .：5’-CCATTGCCATGTCACTCCGAA -3’
3) 分子标记名称，HGS3F3R3
Seq ID No .：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’
Seq ID No .：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’
4) 分子标记名称，HGS3F4R4
Seq ID No .：5’- CAGTTCCCCAAAAACTGCTCC-3’
Seq ID No .：5’- ACTGGTGTGTTAGTGCAGTG-3’。
5) 分子标记名称，HGS3F5R5
Seq ID No .：5’- GCGTCCCTCCACCTAAACTC-3’
Seq ID No .：5’- ACTCCACAAACCGCTAGAGA-3’
6) 分子标记名称，HGS3F6R6
Seq ID No .：5’- GCTGGTCCACGCTAGTTTCT-3’
Seq ID No .：5’- ATATGCATGCGCTGCTTGAG-3’
7) 分子标记名称，HGS3F7R7
Seq ID No .：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’
Seq ID No .：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’
8) 分子标记名称，HGS3F8R8
Seq ID No .：5’- CATGCCCATCTCCCTCGTTT-3’
Seq ID No .：5’- TCATGATCAAAAACTGGGGTAAGT-3’。
9) 分子标记名称，HGS3F9R9
Seq ID No .：5’- CCAGCACATTTAATTTCTGAACG-3’
Seq ID No .：5’- AACTTGCTCTTACGGGAGGAC-3’
10) 分子标记名称，HGS3F10R10
Seq ID No .：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’
Seq ID No .：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’
11) 分子标记名称，HGS3F11R11
Seq ID No .：5’- CCTTGGACTAATTCGCGAGAC-3’
Seq ID No .：5’- TTTTAGCCCATGTCATATCGGA-3’
12) 分子标记名称，HGS3F12R12
Seq ID No .：5’- AAGCCAAGTCACGTGTGGAA-3’
Seq ID No .：5’- CCGGCCGGTACATAACACAA-3’。
13) 分子标记名称，HGS3F13R13
Seq ID No .：5’- AAAGCAATGTCTATGTTAATGGT-3’
Seq ID No .：5’- TGGCCCACAATACGCAAGTA-3’
14) 分子标记名称，HGS3F14R14
Seq ID No .：5’- ACTTCGTCGATTGTGTGTGGACT-3’
Seq ID No .：5’- TCGCTTCTCCGATGAACTGC-3’
15) 分子标记名称，HGS3F15R15
Seq ID No .：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’
Seq ID No .：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’
16) 分子标记名称，HGS3F16R16
Seq ID No .：5’- ATGTGCAAGACCAGCGATCA-3’
Seq ID No .：5’- GCTCCGATCCACCTCAAACA-3’。
17) 分子标记名称，HGS3F17R17
Seq ID No .：5’- TGAACAATGACGCTGTCTCT-3’
Seq ID No .：5’- TCGACGTTTTGTACATGTTTGAGG-3’
18) 分子标记名称，HGS3F18R18
Seq ID No .：5’- ACTGGACCACGAACTCATTG-3’
Seq ID No .：5’- TGAAGGGTAGGAAGAGAAGGTT-3’
19) 分子标记名称，HGS3F19R19
Seq ID No .：5’- TCTGCCACCAGTGAATGCAA-3’
Seq ID No .：5’- GGCCATTTCGGTGGAACCTA-3’
20) 分子标记名称，HGS3F20R20
Seq ID No .：5’- TAGAACGATAAGTAATTTGAAGCGG-3’
Seq ID No .：5’- CACTTGCTCTGCACAAACAG-3’。
21) 分子标记名称，HGS3F21R21
Seq ID No .：5’- GGCGTCCCTCGTGCTG -3’
Seq ID No .：5’- AGTACGCGCGCAGCTC-3’。
22) 分子标记名称，HGS3F22R22
Seq ID No .：5’- GCTGCCATGATGAGTACGTG -3’
Seq ID No .：5’- GCTCTCGCATGAGAGCCAA-3’。
23) 分子标记名称，GS3-FR1
Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’
Seq ID No .：5’- AGGGCTGGCTTACTCGCTG-3’。
24) 分子标记名称，GS3-FR2
Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’
Seq ID No .：5’- CAGCAGGCTGGCTTACTCTATT-3’。
25) 分子标记名称，gS3-F1R
Seq ID No .：5’- GCTGCCTCCAGATGCCGC-3’
Seq ID No .：5’- CAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’。
本发明还提供一种鉴定和选育水稻大粒品种的方法，包括以下步骤 ：
1) 分别以水稻功能基因GS3 的供体、受体材料作为亲本，提取亲本基因组 DNA，利用HGS3F3R3、HGS3F7R7、HGS3F10R10、HGS3F15R15用于 PCR 扩增与水稻功能基因GS3 紧密连锁的分子标记的引物对进行PCR 扩增，选取在供体材料与受体材料间扩增产物多态性好、易于鉴定识别的引物对作为检测标记 ；
2) 提取待测水稻的基因组 DNA，利用步骤 1) 中筛选到的检测标记进行 PCR 扩增，检测扩增产物。
如果待测水稻具有纯合 GS3 供体带型，判定其基因型为 GS3GS3，如果待测水稻具有杂合带型，判定其基因型为 GS3gs3，如果待测水稻具有纯合受体带型，判定其基因型为gs3gs3。
PCR 扩增体系按 20μl 计为 ：正向、Seq ID No .各1.5μl、0.2μl dNTP（10mM）、2μl 10×PCR 缓冲液、 0.1μl Taq DNA 聚合酶（5U/μl），用 ddH2O 补齐至 18μl，最后加模板DNA 2μl。
PCR 扩增程序为 ：94℃预变性 5 分钟 ；94℃变性 30 秒、55℃退火 30 秒、72℃延伸45秒，35 个循环 ；72℃延伸 7 分钟。
PCR 扩增产物经 6％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色法检测，或采用本领域已知的常规检测技术。
本发明中涉及的水稻功能基因GS3 的供体材料包括世纪五丰公司提供的22中品系的水稻携带功能基因GS3 的衍生材料及其它具有功能基因GS3 的材料，具体包括13种长粒水稻 7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38，9种圆粒水稻1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。在水稻插栽10-15天时，每株取上部1～3片长约5～10cm的幼叶叶尖，每种材料取4个样。
发明中涉及的水稻功能基因GS3 的受体材料包括稻属所有材料，例如栽培稻及野生稻。
本发明还提供水稻粒形主效基因位点 GS3 的分子标记检测方法，即用上述之一的引物对扩增功能基因GS3 的供体 ( 包括‘川大粒’及其携带功能基因GS3 的衍生材料 )及受体 ( 包括栽培稻及野生稻在内的稻属所有材料 ) 基因组 DNA，扩增产物多态性好、易于辨别的引物对即可作为检测标记，选用其中 1-2 个引物对作为检测标记。待测材料具有 GS3纯合供体带型说明其基因型为 GS3GS3，杂合带型 ( 既有供体带型又有受体带型 )说明其基因型为 GS3gs3，纯合受体带型说明其基因型为gs3gs3。
筛选上述标记引物的过程如下 ：
（1）DNA提取与质量检测
将提取到的DNA原液10µl稀释到2ml,用紫外分光光度计测定230 nm、260 nm及280nm的吸光值，DNA在260nm处有吸收峰，DNA检测OD260/OD280在1.8至2.0时，提取的DNA样质量比较纯，电泳时，跑出来的条带比较清晰，带型完整。
（2）GS3特异PCR扩增结果
回收用于测序的水稻DNA样品包括HGS3F3R3引物扩增的圆粒，HGS3F7R7引物扩增的长粒，HGS3F7R7引物扩增的圆粒，HGS3F10R10引物扩增的圆粒，HGS3F15R15引物扩增的圆粒。
（3）序列比对分析
双向测序的序列通过ContigExpres软件进行序列拼接，将拼接的序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information）美国国立生物技术信息中心检测，目的基因与已知基因比较其差异性。
一种水稻GS3功能基因分子标记的检测方法，包括步骤：根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记；其中所述分子标记HGS3F3R3的引物对的正向引物如Seq ID No .2所示序列，反向引物如Seq ID No .3所示序列；所述分子标记HGS3F7R7的引物对的正向引物如Seq ID No .5所示序列，反向引物如Seq ID No .6所示序列；所述分子标记HGS3F10R10的引物对的正向引物如Seq ID No .8所示序列，反向引物如Seq ID No .9所示序列；所述分子标记HGS3F15R15的引物对的正向引物如Seq ID No .11所示序列，反向引物如Seq ID No.12所示序列。
本发明提供了一种筛选大粒水稻的方法，利用本发明提供的上述 23 个引物对之一进行 PCR 扩增供体、受体及待检水稻基因组 DNA，如果供体和受体水稻基因组 DNA 的扩增产物存在易于识别、稳定的多态性，该引物对即可用于检测待检水稻。如果均为大粒基因GS3 供体带型，说明为纯合大粒基因型 GS3GS3 ；如果既有供体带型又有受体带型，说明为杂合基因型 GS3GS3 ；如果均为受体带型，说明为纯合小粒基因型 GS3GS3。
本发明首次发现了与功能基因GS3 紧密连锁的分子标记，借助分子标记辅助选择技术可有目的地进行大粒基因的导入和聚合，培育大粒 ( 或长粒 ) 型水稻新品种 ( 或亲本 )。本发明的有益效果表现在 ：
( 1 ) 本发明首次精细定位了水稻材料中的功能基因 GS3。
(2 ) 通过本发明分子标记定位的主效基因位置明确，鉴定方便。通过检测与GS3基因位点连锁的分子标记，即可预测水稻的粒形，可用于苗期早期筛选、检测基因型纯合与否及进行多基因聚合育种。在聚合多个长粒 ( 或大粒 ) 基因培育 ( 或创制 ) 高档特长粒品种 ( 或亲本 ) 时效果尤其显著。而且，本发明检测方便快速，不受环境影响。
附图说明
图1为实施例水稻总DNA检测结果；
图2为实施例引物HGS3F3R3扩增DNA条带；
图3为实施例引物HGS3F7R7扩增DNA条带；
图4为实施例引物HGS3F10R10扩增DNA条带；
图5为实施例引物HGS3F15R15扩增DNA条带。
具体实施方式
本实施例提供水稻GS3功能基因分子标记，所述分子标记分别如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。
所述分子标记HGS3F3R3的引物对的正向引物如Seq ID No .2所示序列，反向引物如Seq ID No .3所示序列；所述分子标记HGS3F7R7的引物对的正向引物如Seq ID No .5所示序列，反向引物如Seq ID No .6所示序列；所述分子标记HGS3F10R10的引物对的正向引物如Seq ID No .8所示序列，反向引物如Seq ID No .9所示序列；所述分子标记HGS3F15R15的引物对的正向引物如Seq ID No .11所示序列，反向引物如Seq ID No .12所示序列。
所述引物对分别为：
Seq ID No .2：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’，
Seq ID No .3：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’；
Seq ID No .5：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’，
Seq ID No .6：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’；
Seq ID No .8：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’，
Seq ID No .9：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’；
Seq ID No .11：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’，
Seq ID No .12：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’。
所述分子标记是上述的引物对以水稻基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
所述分子标记如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。
本实施例的与水稻GS3功能基因紧密连锁的分子标记，即水稻粒形主效基因位点GS3的分子标记（HGS3F1R1、HGS3F2R2、HGS3F3R3、HGS3F4R4、HGS3F5R5、HGS3F6R6、HGS3F7R7、HGS3F8R8、HGS3F9R9、HGS3F10R10、HGS3F11R11、HGS3F12R12、HGS3F13R13、HGS3F14R14、HGS3F15R15、HGS3F16R16、HGS3F17R17、HGS3F18R18、HGS3F19R19、HGS3F20R20、HGS3F21R21、HGS3F22R22、GS3-FR1、GS3-FR2、gS3-F1R），由下述之一的引物对经 PCR 扩增获得：
1) 分子标记名称，HGS3F1R1
Seq ID No .：5’- TACTCGTTGGAAGTGTGCGT -3’
Seq ID No .：5’- TTGGGGTTGGGCGTAAATGA -3’
2) 分子标记名称，HGS3F2R2
Seq ID No .：5’- CCAAAAACGGCAATCCCCTC-3’
Seq ID No .：5’-CCATTGCCATGTCACTCCGAA -3’
3) 分子标记名称，HGS3F3R3
Seq ID No .：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’
Seq ID No .：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’
4) 分子标记名称，HGS3F4R4
Seq ID No .：5’- CAGTTCCCCAAAAACTGCTCC-3’
Seq ID No .：5’- ACTGGTGTGTTAGTGCAGTG-3’。
5) 分子标记名称，HGS3F5R5
Seq ID No .：5’- GCGTCCCTCCACCTAAACTC-3’
Seq ID No .：5’- ACTCCACAAACCGCTAGAGA-3’
6) 分子标记名称，HGS3F6R6
Seq ID No .：5’- GCTGGTCCACGCTAGTTTCT-3’
Seq ID No .：5’- ATATGCATGCGCTGCTTGAG-3’
7) 分子标记名称，HGS3F7R7
Seq ID No .：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’
Seq ID No .：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’
8) 分子标记名称，HGS3F8R8
Seq ID No .：5’- CATGCCCATCTCCCTCGTTT-3’
Seq ID No .：5’- TCATGATCAAAAACTGGGGTAAGT-3’。
9) 分子标记名称，HGS3F9R9
Seq ID No .：5’- CCAGCACATTTAATTTCTGAACG-3’
Seq ID No .：5’- AACTTGCTCTTACGGGAGGAC-3’
10) 分子标记名称，HGS3F10R10
Seq ID No .：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’
Seq ID No .：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’
11) 分子标记名称，HGS3F11R11
Seq ID No .：5’- CCTTGGACTAATTCGCGAGAC-3’
Seq ID No .：5’- TTTTAGCCCATGTCATATCGGA-3’
12) 分子标记名称，HGS3F12R12
Seq ID No .：5’- AAGCCAAGTCACGTGTGGAA-3’
Seq ID No .：5’- CCGGCCGGTACATAACACAA-3’。
13) 分子标记名称，HGS3F13R13
Seq ID No .：5’- AAAGCAATGTCTATGTTAATGGT-3’
Seq ID No .：5’- TGGCCCACAATACGCAAGTA-3’
14) 分子标记名称，HGS3F14R14
Seq ID No .：5’- ACTTCGTCGATTGTGTGTGGACT-3’
Seq ID No .：5’- TCGCTTCTCCGATGAACTGC-3’
15) 分子标记名称，HGS3F15R15
Seq ID No .：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’
Seq ID No .：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’
16) 分子标记名称，HGS3F16R16
Seq ID No .：5’- ATGTGCAAGACCAGCGATCA-3’
Seq ID No .：5’- GCTCCGATCCACCTCAAACA-3’。
17) 分子标记名称，HGS3F17R17
Seq ID No .：5’- TGAACAATGACGCTGTCTCT-3’
Seq ID No .：5’- TCGACGTTTTGTACATGTTTGAGG-3’
18) 分子标记名称，HGS3F18R18
Seq ID No .：5’- ACTGGACCACGAACTCATTG-3’
Seq ID No .：5’- TGAAGGGTAGGAAGAGAAGGTT-3’
19) 分子标记名称，HGS3F19R19
Seq ID No .：5’- TCTGCCACCAGTGAATGCAA-3’
Seq ID No .：5’- GGCCATTTCGGTGGAACCTA-3’
20) 分子标记名称，HGS3F20R20
Seq ID No .：5’- TAGAACGATAAGTAATTTGAAGCGG-3’
Seq ID No .：5’- CACTTGCTCTGCACAAACAG-3’。
21) 分子标记名称，HGS3F21R21
Seq ID No .：5’- GGCGTCCCTCGTGCTG -3’
Seq ID No .：5’- AGTACGCGCGCAGCTC-3’。
22) 分子标记名称，HGS3F22R22
Seq ID No .：5’- GCTGCCATGATGAGTACGTG -3’
Seq ID No .：5’- GCTCTCGCATGAGAGCCAA-3’。
23) 分子标记名称，GS3-FR1
Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’
Seq ID No .：5’- AGGGCTGGCTTACTCGCTG-3’。
24) 分子标记名称，GS3-FR2
Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’
Seq ID No .：5’- CAGCAGGCTGGCTTACTCTATT-3’。
25) 分子标记名称，gS3-F1R
Seq ID No .：5’- GCTGCCTCCAGATGCCGC-3’
Seq ID No .：5’- CAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’。
本实施例还提供一种鉴定和选育水稻大粒品种的方法，包括以下步骤 ：
1) 分别以水稻功能基因GS3 的供体、受体材料作为亲本，提取亲本基因组 DNA，利用权利要求 1 所述的用于 PCR 扩增与水稻功能基因GS3 紧密连锁的分子标记的引物对进行PCR 扩增，选取在供体材料与受体材料间扩增产物多态性好、易于鉴定识别的引物对作为检测标记 ；
2) 提取待测水稻的基因组 DNA，利用步骤 1) 中筛选到的检测标记进行 PCR 扩增，检测扩增产物。
如果待测水稻具有纯合 GS3 供体带型，判定其基因型为 GS3GS3，如果待测水稻具有杂合带型，判定其基因型为 GS3gs3，如果待测水稻具有纯合受体带型，判定其基因型为gs3gs3。
PCR 扩增体系按 20μl 计为 ：正向、Seq ID No .各1.5μl、0.2μl dNTP（10mM）、2μl 10×PCR 缓冲液、 0.1μl Taq DNA 聚合酶（5U/μl），用 ddH2O 补齐至 18μl，最后加模板DNA 2μl。
PCR 扩增程序为 ：94℃预变性 5 分钟 ；94℃变性 30 秒、55℃退火 30 秒、72℃延伸45秒，35 个循环 ；72℃延伸 7 分钟。
PCR 扩增产物经 6％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色法检测，或采用本领域已知的常规检测技术。
本实施例中涉及的水稻功能基因GS3 的供体材料包括世纪五丰公司提供的22中品系的水稻携带功能基因GS3 的衍生材料及其它具有功能基因GS3 的材料，具体包括13种长粒水稻 7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38，9种圆粒水稻1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。在水稻插栽10-15天时，每株取上部1～3片长约5～10cm的幼叶叶尖，每种材料取4个样。
实施例中涉及的水稻功能基因GS3 的受体材料包括稻属所有材料，例如栽培稻及野生稻。
本实施例还提供水稻粒形主效基因位点 GS3 的分子标记检测方法，即用上述之一的引物对扩增功能基因GS3 的供体 ( 包括‘川大粒’及其携带功能基因GS3 的衍生材料 )及受体 ( 包括栽培稻及野生稻在内的稻属所有材料 ) 基因组 DNA，扩增产物多态性好、易于辨别的引物对即可作为检测标记，选用其中 1-2 个引物对作为检测标记。待测材料具有 GS3纯合供体带型说明其基因型为 GS3GS3，杂合带型 ( 既有供体带型又有受体带型 )说明其基因型为 GS3gs3，纯合受体带型说明其基因型为gs3gs3。
筛选上述标记引物的过程如下 ：
（1）DNA提取与质量检测
将提取到的DNA原液10µl稀释到2ml,用紫外分光光度计测定230 nm、260 nm及280nm的吸光值，DNA在260nm处有吸收峰，DNA检测OD260/OD280在1.8至2.0时，提取的DNA样质量比较纯，电泳时，跑出来的条带比较清晰，带型完整。图1为水稻总DNA检测结果，其中泳道：1～22分别代表水稻品种7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。
（2）GS3特异PCR扩增结果
回收用于测序的水稻DNA样品包括HGS3F3R3引物扩增的圆粒，HGS3F7R7引物扩增的长粒，HGS3F7R7引物扩增的圆粒，HGS3F10R10引物扩增的圆粒，HGS3F15R15引物扩增的圆粒。DNA样在6%聚丙烯酰胺电泳检测结果如图2-5所示：图2为引物HGS3F3R3扩增DNA条带，其中M:分子量标记， 泳道：1～22分别代表水稻品种7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；图3为引物HGS3F7R7扩增DNA条带M:分子量标记， 泳道：1～22分别代表水稻品种7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；图4为引物HGS3F10R10扩增DNA条带，其中M:分子量标记， 泳道：1～22分别代表水稻品种7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；图5为引物HGS3F15R15扩增DNA条带，其中M:分子量标记， 泳道：1～22分别代表水稻品种7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；其中，表1对聚丙烯酰胺电泳结果的多态进行统计。
表1聚丙烯酰胺电泳结果多态统计表
（3）序列比对分析
双向测序的序列通过ContigExpres软件进行序列拼接，拼接序列结果：
1.HGS3F3R3圆粒样品序列拼接：
TTCTCCACCGCGAGATCGGATTCCTCGAGCGTACTGTCTATATCACTACCATTCATACTCCTTCGATCTTGCTTCAAAACAAAAAAAGATATATTTCCTACTTCATATTCATATACACACGTACGGCTTGCTATCTGTCGAATTGTTTGCTTCTGCATGCATGCATCACTCTCATTGTAAGTTTTCCCCAGCTTAAAACCACTCCTTTGA
2.HGS3F7R7长粒样品序列拼接：
CTTGCAGTCTCTGGACGTTGGTTGGTTGTACGAGACGGTAGACAAAGGCGCGAGTTACTGAATGGACTCCTGACTGAGCTAGCATGGTGGGTACCTTGTGCCTTTGCACTTGAAGCAGGACCATTTTTCTCATCTACAGTCTTAGATACTGCCTGATTGTTCTCCTTTTTAGTGTCCACCAGATCTGAAAATCAAGCAAGTAAAAGAAAATGCTAAGGCAGATATCAATCAGTATCGATTTAGGAGGCATAGATCTTAGTGCTAATATGATAGCATTAGCAGTGAAGTACTTGCT；
3.HGS3R7R7圆粒样品序列拼接：
TTGCAAGTACTGTCACTGCTAATGAACAAACACAACATATACAGTTAGGTTGCAGTGTCGTACTTTACTTAGGTTAATTTTAGAAGCTTTAAAAATGGTGCTAATTAAAACGGAGTAGTTTTACTCCTAATAGCACAGGAAATCAAGCCAATAAATAAATTATTGGAGGAAAAAAAAGCTGGGCATCACCATTTAAATTATTTTAATTATAAAGGCGAATATTGACAATTCCAAAACAGATGCTTTGAGCAG；
4.HGS3F10R10圆粒样品序列拼接：
TCTACTGCGTCTTGGAGTCCGTGCTATAGCTGACTACAAATCTATAGCCCGCTGCTCTTCTCTCTCCTTATTTATCTCCTTAAAATATGTTTGCAGCTGGCTGATAGCCTGCTATTGTACCTGCTCTAAAAACAGTGCAGAGACTGTTCAAAAAGTCATTGCACAATAACTATTCACATGGAACTGTGAAAAGTATATATTGGAACTTAGGGCCTGTTTGG；
5.HGS3F15R15圆粒样品序列拼接：
TCTGCACTGTGCTAATTGGTGTACACATTATGTGATCATCAGTCCAAGTTAATTATTACTTACAAAACTGAACTAATAAACACTAGAAAATATGTAACTTGCAAAGTACATATTGAATCAGGGATTCATATATAGAACTCCACCTGCAGATTTCTTCCAATATATATATGCTGTCACCATGTTTTCACTTGTCACCTAGTACACCTTTCCTTGATGATCGACGTGGTCA。
将拼接的序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information）美国国立生物技术信息中心检测，目的基因与已知基因比较其差异性结果，结果如表2-7所示：
表2 HGS3F3R3圆粒基因GS3基因比对检测结果
表3 HGS3F7R7圆粒基因GS3基因比对检测结果
表4 HGS3F10R10圆粒基因GS3基因比对检测结果
表5 HGS3F15R15圆粒基因GS3基因比对检测结果
表6 目的基因比对序列统计表
其中所有的圆粒水稻基因序列比对上的序列为同一个水稻品种ARC7291，是水稻粒长GS3基因序列，由数据可知，试验中所测的目的序列与比对上的序列相似度可达98%以上，其同源关系可信度极高，可能为同一种基因；而HGS3F7R7长粒的基因序列比对另一种粳稻高产的品种基因序列。
表7 HGS3F7R7长粒与HGS3F7R7圆粒序列比对结果如下
如表7所示，Query为HGS3F7R7长粒基因序列，Sbjct为HGS3F7R7圆粒基因序列，其中HGS3F7R7长粒序列长度为294bp,比对上了20bp；HGS3F7R7圆粒基因序列长度为152bp,比对上21bp,所以HGS3F7R7长粒基因和HGS3F7R7圆粒基因有显著的差异性。可确认的GS3功能基因的确切标记。
一种水稻GS3功能基因分子标记的检测方法，包括步骤：根据上述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记；其中所述引物为上述的引物对。
本实施例提供了一种筛选大粒水稻的方法，利用本实施例提供的上述 23 个引物对之一进行 PCR 扩增供体、受体及待检水稻基因组 DNA，如果供体和受体水稻基因组 DNA的扩增产物存在易于识别、稳定的多态性，该引物对即可用于检测待检水稻。如果均为大粒基因GS3 供体带型，说明为纯合大粒基因型 GS3GS3 ；如果既有供体带型又有受体带型，说明为杂合基因型 GS3gs3 ；如果均为受体带型，说明为纯合小粒基因型 gs3gs3。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 惠州学院，惠州市世纪五丰农业科技股份有限公司
<120> 一种水稻GS3功能基因分子标记及检测方法
<130> 2016
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttctccaccg cgagatcgga ttcctcgagc gtactgtcta tatcactacc attcatactc 60
cttcgatctt gcttcaaaac aaaaaaagat atatttccta cttcatattc atatacacac 120
gtacggcttg ctatctgtcg aattgtttgc ttctgcatgc atgcatcact ctcattgtaa 180
gttttcccca gcttaaaacc actcctttga 210
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctccaccgcg agatcggatt 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaggagtggt tttaagctgg gg 22
<210> 4
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgcaagtac tgtcactgct aatgaacaaa cacaacatat acagttaggt tgcagtgtcg 60
tactttactt aggttaattt tagaagcttt aaaaatggtg ctaattaaaa cggagtagtt 120
ttactcctaa tagcacagga aatcaagcca ataaataaat tattggagga aaaaaaagct 180
gggcatcacc atttaaatta ttttaattat aaaggcgaat attgacaatt ccaaaacaga 240
tgctttgagc ag 252
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctcaaagca tctgttttgg aattg 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agcaagtact gtcactgcta atg 23
<210> 7
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tctactgcgt cttggagtcc gtgctatagc tgactacaaa tctatagccc gctgctcttc 60
tctctcctta tttatctcct taaaatatgt ttgcagctgg ctgatagcct gctattgtac 120
ctgctctaaa aacagtgcag agactgttca aaaagtcatt gcacaataac tattcacatg 180
gaactgtgaa aagtatatat tggaacttag ggcctgtttg g 221
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctactgcgtc ttggagtccg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccaaacaggc cctaagttcc a 21
<210> 10
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tctgcactgt gctaattggt gtacacatta tgtgatcatc agtccaagtt aattattact 60
tacaaaactg aactaataaa cactagaaaa tatgtaactt gcaaagtaca tattgaatca 120
gggattcata tatagaactc cacctgcaga tttcttccaa tatatatatg ctgtcaccat 180
gttttcactt gtcacctagt acacctttcc ttgatgatcg acgtggtca 229
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctgcactgtg ctaattggtg t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaccacgtcg atcatcaagg a 21
Claims (5)
1.水稻GS3功能基因分子标记，其特征在于，所述分子标记的名称分别为HGS3F3R3、HGS3F7R7、HGS3F10R10、HGS3F15R15，与其对应的核苷酸序列如Seq ID No .1、Seq ID No.4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列；所述分子标记HGS3F3R3的引物对的正向引物如Seq ID No .2所示序列，反向引物如Seq ID No .3所示序列；所述分子标记HGS3F7R7的引物对的正向引物如Seq ID No .5所示序列，反向引物如Seq ID No .6所示序列；所述分子标记HGS3F10R10的引物对的正向引物如Seq ID No .8所示序列，反向引物如Seq ID No.9所示序列；所述分子标记HGS3F15R15的引物对的正向引物如Seq ID No .11所示序列，反向引物如Seq ID No .12所示序列。
2.根据权利要求1所述的水稻GS3功能基因分子标记，其特征在于，
所述Seq ID No .2：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’，
Seq ID No .3：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’；
Seq ID No .5：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’，
Seq ID No .6：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’；
Seq ID No .8：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’，
Seq ID No .9：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’；
Seq ID No .11：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’，
Seq ID No .12：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’。
3.根据权利要求1所述的水稻GS3功能基因分子标记，其特征在于：所述分子标记是由权利要求1所述的引物对以水稻基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
4.根据权利要求3所述的水稻GS3功能基因分子标记，其特征在于：所述分子标记如SeqID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。
5.一种水稻GS3功能基因分子标记的检测方法，其特征在于，包括步骤：根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记；其中所述引物为权利要求1所述的引物对。
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