CN114517241A - 一种小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记及其应用。具体地公开了检测小麦Rht8基因的第1649‑1650位核苷酸是否由“CG”突变为“T”的物质在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中的应用。本发明公开了核苷酸序列为SEQ ID No.1和/或2所示的分子标记。本发明提供了所述分子标记的引物组合物、含有所述引物组合物的试剂盒及利用所述引物组合物鉴定小麦株高的方法。本发明的KASP分子标记及其引物能够快速、精准、高通量地鉴定Rht8基因的矮杆等位型，可高效检测和追踪小麦品种/品系中基因Rht8，加快矮杆基因Rht8的高效育种利用，具有准确性高、特异性强、检测简单便捷，经济高效的特点。

Description

一种小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体地涉及一种小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记及其应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是世界上栽培最广泛的粮食作物，为人类提供了约21％的食物热量和20％的蛋白质。小麦也是我国的主要粮食作物之一，持续提高我国小麦产量水平对于确保国家粮食安全具有十分重要的意义。我国新的粮食安全战略目标为要确保谷物自给率保持在95％以上，其中水稻、小麦两大口粮保持100％自给。因此，随着人口不断增加和耕地面积的减少，培育高产优质小麦新品种，进一步提高我国小麦单产对于保障国家粮食安全具有重要的战略意义。

株高是影响小麦株型和产量的重要性状。降低株高可以增强小麦的抗倒伏能力，同时提高收获指数，从而实现小麦的增产与稳产。在小麦由中产向高产转变的过程中，生产上遇到的首要问题是因生产条件的改善而引起的倒伏问题。过去生产上延用的中高秆品种在高产条件下会出现严重倒伏而减产，抗倒伏是高产育种的主要目标之一。尽管倒伏还与茎秆的坚韧度、弹性、基部节间长度以及根的分布深度等特性有关，但株高仍是造成倒伏的主要因素。由于小麦矮秆品种具有茎秆矮、抗倒伏、收获指数高、水肥增产效应大等优点，因此提高了其产量潜力，改良了稳产性能。随着小麦产量水平的提高和生产条件的改善，小麦品种株高逐步矮化，进一步选育矮秆和半矮秆品种是现代小麦育种的发展趋势。因此，研究小麦株高的遗传决定机制，开发与小麦矮杆基因连锁的分子标记，从而利用该标记筛选矮杆基因的等位变异类型，为选育高产抗倒伏小麦品种奠定理论基础，对小麦品种改良至关重要。

KASP(竞争性等位基因特异性PCR，Kompetitive Allele Specific PCR)技术是一种基于PCR过程中引物末端碱基特异性匹配来实现SNP(Single NucleotidePolymorphisms，单核苷酸多态性)及InDel(insertion-deletion，插入缺失位点)检测分型的方法，能够精确地进行双等位基因分型，且通量高、成本低、效率高、准确度高、遗传稳定性好。KASP在小到中等数量的标记应用中显示出了成本效益和可扩展的灵活性，因此基于KASP技术挖掘鉴定小麦株高的KASP分子标记，用于筛选矮秆和半矮秆品种小麦，对小麦高产辅助选择育种具有重要价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何更快速、精准和/或高通量地鉴定或辅助鉴定小麦株高性状。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸是否由“CG”突变为“T”的物质在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中的应用。

所述小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸对应于小麦基因组中SEQ ID No.2的第64-65位。

上述应用中，所述物质含有扩增包含所述小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸在内的小麦基因组DNA片段的PCR引物。

上述应用中，所述物质含有扩增包含分子标记在内的小麦基因组DNA片段的PCR引物，所述分子标记是核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子和/或SEQ ID No.2所示的DNA分子。

所述分子标记是一种小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记，命名为KASP-Rht8，所述分子标记KASP-Rht8可以是核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子(命名为KASP-Rht8-1)和/或核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的DNA分子(命名为KASP-Rht8-2)。分子标记KASP-Rht8是根据小麦矮杆基因Rht8(基因RNHL-D1)相关的序列变异位点(即小麦Rht8基因的第1649-1650位碱基)设计的KASP-Rht8的引物扩增DNA模板所获得的DNA分子。

所述变异位点的基因型为CG基因型或者T-基因型，其中所述CG基因型为RNHL-D1基因为CG纯合基因型，为rht8等位类型(rht8基因型)；所述T-基因型为RNHL-D1基因为T-纯合基因型，为Rht8等位类型(Rht8基因型)。

分子标记KASP-Rht8-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，由86个核苷酸组成，用于鉴定T-基因型(Rht8基因型)。

分子标记KASP-Rht8-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，由87个核苷酸组成，用于鉴定CG基因型(rht8基因型)。

上述应用中，所述PCR引物可为用于检测小麦Rht8基因的第1649-1650位脱氧核糖核苷酸的基因型的引物组合物，所述引物组合物由引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L中的至少两种引物组成，所述引物KASP-Rht8-F为核苷酸序列是SEQ IDNo.3的单链DNA，所述引物KASP-Rht8-H为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；所述引物KASP-Rht8-L为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA。

进一步地，所述引物组合物可为下述任一种：

D1)由引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L组成的引物组合物；

D2)由引物KASP-Rht8-F和引物KASP-Rht8-L组成的引物组合物；

D3)由引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L组成的引物组合物。

所述引物KASP-Rht8-F为高杆等位型下游引物；所述引物KASP-Rht8-H为矮杆等位型下游引物；所述引物KASP-Rht8-L为共用上游引物。

所述引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L是基于小麦矮杆基因Rht8功能变异位点开发的KASP标记专用引物，所述KASP标记专用引物可以用来鉴定或辅助鉴定待测小麦材料中Rht8基因的等位类型，具体地，所述KASP标记专用引物可以用来检测小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸是否由“CG”突变为“T”。

在本发明的一个实施方案中，所述引物KASP-Rht8-F(SEQ ID No.3)的5’端到3’端依次为FAM荧光序列和单链DNA分子，其中第1-21位为FAM荧光序列，第22-39位为单链DNA分子；所述引物KASP-Rht8-H(SEQ ID No.4)的5’端到3’端依次为HEX荧光序列和单链DNA分子，其中第1-21位碱基为HEX荧光序列，第22-39位为单链DNA分子。

在本发明的一个实施方案中，所述引物组合物可以包含引物KASP-Rht8-F(SEQ IDNo.3)和引物KASP-Rht8-L(SEQ ID No.5)两种引物，其用于扩增或检测RNHL-D1基因(Rht8基因)的第1649-1650位DNA的基因型为CG的片段。

在本发明的一个实施方案中，所述引物组合物可以包含引物KASP-Rht8-H(SEQ IDNo.4)和引物KASP-Rht8-L(SEQ ID No.5)两种引物，其用于扩增或检测RNHL-D1基因(Rht8基因)的第1649-1650位DNA的基因型为T-的片段。

所述分子标记KASP-Rht8，和/或，所述PCR引物，和/或，所述引物组合物均在本发明的保护范围内。

含有所述PCR引物或含有所述引物组合物的试剂或试剂盒也在本发明的保护范围内。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、Mg²⁺中的一种或多种。

进一步地，所述试剂盒还包括荧光探针和/或淬灭探针。

进一步地，所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

所述试剂或试剂盒可以应用于鉴定或辅助鉴定待鉴定小麦的Rht8基因型(T-基因型)和/或rht8基因型(CG基因型)，即可以应用于检测小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸是否由“CG”突变为“T”。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，所述方法包括以下步骤：以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用所述引物组合物进行KASP，得到PCR产物；根据所述PCR产物的荧光信号确定待鉴定小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸(对应于小麦基因组中SEQ ID No.2的第64-65位)是否由“CG”突变为“T”来鉴定小麦株高性状。

上述方法中，根据所述PCR产物的荧光信号来鉴定小麦株高性状为：Rht8基因的第1649-1650位核苷酸(对应于小麦基因组中SEQ ID No.2的第64-65位)没有由“CG”突变为“T”的待鉴定小麦的株高高于Rht8基因的第1649-1650位核苷酸(对应于小麦基因组中SEQID No.2的第64-65位)由“CG”突变为“T”的待鉴定小麦。

本发明还提供了所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中的应用。

本发明还提供了所述分子标记，和/或，所述PCR引物，和/或，所述引物组合物，和/或，所述试剂或试剂盒的下述任一种应用：

B1)在制备鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的产品中的应用；

B2)在选育小麦株高性状优良品种中的应用；

B3)在制备选育小麦株高性状优良品种的产品中的应用；

B4)在小麦育种中的应用；

B5)在制备小麦育种的产品中的应用；

B6)在小麦种质资源分析或鉴定中的应用。

进一步地，所述小麦育种包括：以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用所述引物组合物进行PCR扩增，得到PCR产物；选择所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示分子标记的所述待鉴定小麦作为亲本进行育种。所述小麦育种的目的可包括培育小麦矮秆品种和/或小麦半矮秆品种。

本发明还提供了一种小麦育种的方法(如选育株高性状优良的小麦的方法)，所述方法包括选择T-基因型的小麦作为亲本进行育种，所述T-基因型的小麦是小麦染色体中Rht8基因的第1649-1650位核苷酸(对应于小麦基因组中SEQ ID No.2的第64-65位)由“CG”突变为“T”的小麦。

进一步地，所述选育株高性状优良的小麦的方法包括：选择Rht8基因型(T-基因型)的小麦品种进行育种，得到目的小麦；所述Rht8基因型为小麦2D染色体的Rht8基因的第1649-1650位脱氧核糖核苷酸为T-的纯合体。

本发明还提供了一种鉴定或者辅助鉴定小麦Rht8矮杆基因变异类型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)检测待测小麦Rht8(RNHL-D1)基因第1649-1650位脱氧核糖核苷酸的基因型是GC和T-的哪一种；以及

2)根据步骤1)所获得的所述待测小麦的基因型确定T-基因型(包含Rht8等位类型)的待测小麦的株高低于GC基因型(包含rht8等位类型)的待测小麦，

其中所述T-基因型为RNHL-D1基因的第1649-1650位脱氧核糖核苷酸为T-的纯合体；所述CG基因型为RNHL-D1基因的第1649-1650位脱氧核糖核苷酸为CG的纯合体。

在一个优选实施方案中，所述的株高性状为成熟期小麦的株高，即步骤2)中确定T-基因型的待测小麦的株高低于CG基因型的待测小麦的株高。

在本发明的鉴定方法中，步骤1)的检测步骤包括：

a)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用本发明的KASP分子标记引物组合物进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，和

b)根据所述荧光信号判断待测小麦RNHL-D1基因的第1649-1650位糖核苷酸的基因型是CG或者T-中的哪一种。

在步骤a)中所采用的KASP分子标记引物组合物由下游引物KASP-Rht8-F、下游引物KASP-Rht8-H及上游引物KASP-Rht8-L组成。

在本发明的鉴定方法中，根据荧光信号判断的步骤可以包括利用Bio-Rad CFXMaestro软件根据荧光信号判断基因型：若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经软件分析呈现蓝色(HEX荧光信号)，则待测小麦变异位点的基因型为T-基因型；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经软件分析呈现橙色(FAM荧光信号)，则待测小麦变异位点的基因型为CG基因型。

在本发明的一个具体实施方案中，用于PCR扩增的PCR扩增体系可以采用如下的体系(总体积为8μL)：100ng/μL模板DNA 1.0μL，2×KASP reaction mix 4.0μL，引物混合试剂1μL，ddH₂O 1μL，其中2×KASP reaction mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B、以及高保真的Taq酶和dNTP等。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(SEQ ID No.6)，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(SEQ ID No.7)，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′(SEQ ID No.8)，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′(SEQ ID No.9)，3′末端连接淬灭基团BHQ。

引物混合试剂(引物组合物)包括引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L。在一个优选实施方案中，引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L在PCR扩增体系中体积比为1:1:2.5，例如，引物KASP-Rht8-F和引物KASP-Rht8-H在PCR扩增体系中的终浓度均为3μM，引物KASP-Rht8-L在PCR扩增体系中的终浓度为7.5μM。

在一个优选实施方案中，PCR扩增可以采用Touch down PCR扩增程序，具体如下：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性20s，65℃退火和延伸60s，10个循环，每个循环退火温度下降0.8℃；(扩增程序)94℃变性20s，57℃退火60s，30个循环；PCR产物4℃避光保存。

在一个优选实施方案中，PCR扩增反应可以在本领域中常用的PCR扩增仪(例如，Long Gene-A300 PCR扩增仪)上进行，得到PCR扩增产物，然后将PCR扩增产物在本领域中常见的实时定量仪器(例如Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler)上根据荧光信号进行基因分型，再利用本领域中常用的荧光分型软件(例如，Bio-Rad CFX Maestro软件)读取分型后的数据。

在本发明中，小麦株高性状以株高表示，因此株高性状优良的小麦是指株高相对较矮的小麦品种。

在本发明中，所述小麦可为小麦自交系。小麦包括但不限于如下品种中的任一种或任几种：白高38、济麦19、济麦20、济麦21、济麦22、济麦23、济南8号、济南13和良星66等。

本文中，术语“rht8基因型”和“CG基因型”具有相同的含义，可互换使用。

本文中，术语“Rht8基因型”和“T-基因型”具有相同的含义，可互换使用。

本发明所述KASP基因分型指一项独特的竞争型等位基因特异性PCR，可对包括复杂基因组的各种基因组DNA样本，针对重测序数据或者其他数据的SNP和InDel进行高精度双等位基因分型，或者KASP可以对经过性状定位得到的候选标记进行大群体的验证工作。

KASP技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels。由于SNPline的高度灵活性，其应用也十分广泛，适合于各种基因分型研究，无论是低通量研发项目，NGS之后的SNP验证，还是农业种群研究等都是其适用的范围。由于传统方式对品种进行鉴定或对种子质量进行评估的成本较高，鉴定周期较长，而KASP技术则可以有效的避免这两个缺点，使得育种成本大大降低，鉴定周期也明显缩短，因此，KASP技术对于分子育种工作中品种鉴定与种子质量控制是一项优选技术。

本发明涉及小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记引物、包含该KASP标记引物的试剂盒及利用该KASP标记引物鉴定或辅助鉴定小麦株高的应用方法。

本发明提供了一个与小麦植株构型相关的变异位点，并基于该位点开发了KASP标记及其专用引物。利用本发明的KASP标记及其专用引物可用于鉴定待测小麦的基因型为rht8基因型(变异位点为CG)还是Rht8基因型(变异位点为T-)，对77份小麦材料进行单倍型分析结果表明，根据待测小麦的基因型可确定Rht8基因型的待测小麦的株高性状(成熟期株高)小于(低于)rht8基因型的待测小麦，进而用于筛选株高性状优良的小麦品种，为选育高产稳产矮杆抗倒伏的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

本发明的KASP分子标记能够快速、精准、高通量地鉴定Rht8基因的矮杆等位型，可高效检测和追踪小麦品种/品系中基因Rht8，加快矮杆基因Rht8的高效育种利用，在小麦的各个组织及各个发育阶段均可检测到，可以在小麦的苗期筛选，加快了小麦选择育种进程。本发明的KASP分子标记的引物，具有准确性高、特异性强、检测简单便捷，经济高效的特点，可以提高品种品质改良的选择效率。

附图说明

图1为小麦2D染色体的Rht8基因的核苷酸序列以及本发明的序列变异位点(序列差异)的位置图。图1中显示该变异位点位于Rht8基因的第1649-1650位脱氧核糖核苷酸：上边为rht8基因型(又称CG基因型)的变异位点序列CG，下边为Rht8基因型(又称T-基因型)的变异位点序列T-。

图2为本发明的KASP标记与Rht8基因的连锁图。

图3为供试小麦品种Rht8基因的KASP标记检测结果。

图4为供试小麦品种不同基因型的株高比较结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记及其引物的开发

位于小麦2D染色体短臂上的Rht8基因是小麦矮秆基因之一，该基因降低株高的同时并不表现出明显的负效应，对小麦的半矮化育种做出了重要贡献。利用图位克隆技术，Rht8基因已经被成功克隆，命名为RNHL-D1，该基因编码一个包含Ribonuclease H-like结构域的未知功能蛋白(Chai L,Xin M,Dong C,Chen Z,Zhai H,Zhuang J,et al.A naturalvariation in Ribonuclease H-like gene underlies Rht8 to confer"GreenRevolution"trait in wheat.[J].Molecular Plant.2022,15(3):377-380.；Xiong H,Zhou C,Fu M,et al.Cloning and Functional Characterization of Rht8,a"GreenRevolution"Replacement Gene in Wheat.[J].Molecular Plant.2022,15(3):373-376.)。基因序列分析发现，RNHL-D1在近等基因系矮秆材料NIL-Rht8和高秆材料NIL-rht8之间存在序列差异，即Rht8基因的第1649-1650位碱基由‘CG’到‘T-’的移码突变，该变异导致蛋白翻译提前终止。根据上述序列差异，开发了KASP分子标记，并利用该标记对77份小麦材料进行单倍型分析，探究其应用价值。

图1图示了小麦2D染色体的Rht8基因的核苷酸序列以及本发明的序列变异位点(序列差异)的位置，图1中显示该变异位点位于Rht8基因的第1649-1650位脱氧核糖核苷酸：上边为rht8基因型(又称CG基因型)的变异位点序列CG，下边为Rht8基因型(又称T-基因型)的变异位点序列T-。

基于上述小麦矮杆基因Rht8功能变异位点开发的KASP分子标记分别命名为KASP-Rht8-1和KASP-Rht8-2(总称为分子标记KASP-Rht8)。

分子标记KASP-Rht8-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，由86个核苷酸组成，用于鉴定T-基因型(Rht8基因型)。

分子标记KASP-Rht8-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，由87个核苷酸组成，用于鉴定CG基因型(rht8基因型)。Rht8基因的第1649-1650位碱基‘CG’对应于SEQ ID No.2的第64-65位。

根据得到的分子标记KASP-Rht8-1(SEQ ID No.1)和分子标记KASP-Rht8-2(SEQID No.2)设计特异性扩增分子标记的引物，所设计的引物序列如下所示：

特异性扩增分子标记KASP-Rht8-1(SEQ ID No.1)的引物：

引物KASP-Rht8-H：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGATCATCTTCACAACCGAATGA-3’(SEQ ID No.4)，

引物KASP-Rht8-L：5’-CTGCCGCGAGGGAGATT-3’(SEQ ID No.5)。

其中，引物KASP-Rht8-H为5’端带有HEX荧光标签序列(下划线为直线的碱基)的下游引物，和引物KASP-Rht8-L(公共上游引物)用于扩增或检测RNHL-D1基因(Rht8基因)的第1649-1650位DNA的基因型为T-的片段。用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到HEX基团的荧光信号。

特异性扩增分子标记KASP-Rht8-2的引物：

引物KASP-Rht8-F：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATCTTCACAACCGAATGCG-3’(SEQID No.3)，

引物KASP-Rht8-L：5’-CTGCCGCGAGGGAGATT-3’(SEQ ID No.5)。

其中，引物KASP-Rht8-F为5’端带有FAM荧光标签序列(下划线为直线的碱基)的下游引物，和引物KASP-Rht8-L(公共上游引物)用于扩增或检测RNHL-D1基因(Rht8基因)的第1649-1650位DNA的基因型为CG的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到FAM基团的荧光信号。

实施例2、小麦矮杆基因Rht8的功能分子标记KASP-Rht8在分离群体中的验证

本实施例中使用的群体为豫麦8679和京411衍生的RIL(重组自交系)群体。目的是验证功能分子标记KASP-Rht8与Rht8基因连锁，可以用于小麦材料基因分型。

小麦品种“豫麦8679”、“京411”及其RIL群体记载在如下文献中：Zhai HJ,FengZY,Li J,Liu XY,Xiao SH,Ni ZF,Sun QX(2016)QTL Analysis of Spike MorphologicalTraits and Plant Height in Winter Wheat(TriticuM aestivuM L.)Using a High-Density SNP and SSR-Based Linkage Map.Frontiers in Plant Science 7.doi:10.3389/fpls.2016.01617。RIL群体的株高表型和群体的基因型数据也可从该文献获得。

1、苗期叶片总DNA的提取

对两个亲本豫麦8679和京411及其RIL群体的小麦材料叶片进行基因组DNA的提取。具体步骤如下：

(1)取新鲜叶片长度1cm，放入1.2mL的离心管，加入2颗直径4mm的钢珠，液氮速冻后磨碎。

(2)加入300μL的CTAB，65℃恒温水浴30分钟，每隔10分钟混匀一次。

(3)加入300μL的氯仿：异戊醇(体积比24:1)，轻轻颠倒使其混匀，室温条件下10000rpm离心10分钟，吸取100μL的上清液转入新的PCR板。

(4)加入100μL异丙醇，至于-20℃冷冻30min让DNA析出；4℃条件下，10000rpm离心5min沉淀DNA，倒掉上清液，用75％的乙醇清洗沉淀2次，沉淀置于通风橱吹干。

(5)加入100μL ddH₂O溶解DNA，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。

2、引物的合成及PCR扩增

通过生物公司合成KASP引物(引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L)。

利用两个亲本豫麦8679和京411的DNA以及RIL群体作为模板(即以步骤1提取的基因组DNA为模板)，利用溶解后的引物对DNA模板进行PCR扩增：

PCR反应体系(8μL体系)如下：100ng/μL模板DNA 1.0μL，2×KASP reaction mix4.0μL，引物混合试剂2.0μL，ddH₂O 1.0μL。

其中：2×KASP reaction mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(SEQID No.6)，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(SEQ ID No.7)，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′(SEQ ID No.8)，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′(SEQ ID No.9)，3′末端连接淬灭基团BHQ。引物混合试剂(引物组合物)中包括引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L，引物KASP-Rht8-F和引物KASP-Rht8-H在PCR扩增体系中的终浓度均为3μM，引物KASP-Rht8-L在PCR扩增体系中的终浓度为7.5μM。

PCR反应程序(8μL体系)如下：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性20s，65℃退火和延伸60s，10个循环，每个循环退火温度下降0.8℃；(扩增程序)94℃变性20s，57℃退火60s，30个循环；4℃避光保存。

将PCR产物利用Bio-Rad CFX Maestro软件检测。

3、基因型分型验证功能分子标记KASP-Rht8与Rht8基因连锁

根据软件判读的基因型，分离群体的荧光信号依情况分别读作A和B，分别表示来源于豫麦8679和京411，获得分子标记基因型数据。利用Joinmap4.0软件对RIL群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱(图2)。基于该遗传图谱，KASP-Rht8分子标记与文献(柴岭岭.普通小麦2D染色体株高和穗长QTL的精细定位与图位克隆.博士学位论文，2019年1月)Rht8基因的鉴定标记CAPS-Rht8的基因型完全一致，在遗传连锁图谱上表现为完全连锁。

结果可以看出，KASP-Rht8分子标记可以被SEQ ID No.3所示的单链DNA分子、SEQID No.4所示的单链DNA分子和SEQ ID No.5所示的单链DNA分子进行标记。

实施例3、分子标记KASP-Rht8在矮秆小麦育种中的应用

供试材料如表1所示，77个供试小麦品种均为常规品种，公众可以从中国农业大学农学院小麦研究中心获得，以重复本申请实验。

1、以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用实施例1中设计的引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L进行KASP。具体步骤如下：

分别提取表1中各个品种小麦的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用KASP-Rht8分子标记专用引物(引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物根据荧光信号进行基因分型(部分分型结果如图3所示)。其中，携带荧光序列FAM的PCR扩增产物分析后以橙色表示，而携带荧光序列HEX的PCR扩增产物分析后以蓝色表示。

PCR扩增体系如下(总体积为8μL)：100ng/μL模板DNA 1.0μL，2×KASP reactionmix 4.0μL，引物混合试剂2.0μL，ddH₂O 1.0μL。

其中：2×KASP reaction mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(SEQID No.6)，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(SEQ ID No.7)，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′(SEQ ID No.8)，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′(SEQ ID No.9)，3′末端连接淬灭基团BHQ。引物混合试剂(引物组合物)中包括引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L，引物KASP-Rht8-F和引物KASP-Rht8-H在PCR扩增体系中的终浓度均为3μM，引物KASP-Rht8-L在PCR扩增体系中的终浓度为7.5μM。

PCR扩增反应在Long Gene-A300 PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR反应程序(8μL体系)如下：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性20s，65℃退火和延伸60s，10个循环，每个循环退火温度下降0.8℃；(扩增程序)94℃变性20s，57℃退火60s，30个循环；PCR产物4℃避光保存。

得到PCR扩增产物，然后将PCR扩增产物在本领域中常见的实时定量仪器(例如Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler)上根据荧光信号进行基因分型，再利用本领域中常用的荧光分型软件(例如，Bio-Rad CFX Maestro软件)读取分型后的数据。携带荧光序列FAM的PCR扩增产物分析后以橙色表示，则说明待测小麦Rht8基因(图1)的第1649-1650位点碱基均为T-，该小麦基因型为Rht8基因型(又称T-基因型)；仅显示橙色图像则说明待测小麦Rht8基因(图1)的第1649-1650位点碱基均为CG，该小麦基因型为rht8基因型(又称CG基因型)。

2、根据PCR产物鉴定小麦株高性状

根据PCR产物的荧光信号确定待鉴定小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸(对应于小麦基因组中SEQ ID No.2的第64-65位)是否由“CG”突变为“T”来鉴定小麦株高性状。

具体地：对各小麦品种PCR扩增产物进行两两比较，若A小麦PCR扩增产物仅显示蓝色，Rht8基因的第1649-1650位点碱基均为CG，该小麦基因型为rht8基因型(CG基因型)；B小麦的PCR扩增产物为仅显示橙色，Rht8基因的第1649-1650位点碱基均为T-，该小麦基因型为Rht8基因型(T-基因型)；则B小麦的株高低于A小麦的株高，B小麦的Rht8基因控制的株高表型性状优于A小麦。

上述各个小麦的基因型及其小麦株高性状如表1所示。分析不同基因型的小麦材料株高均值，结果如图4所示，基因型为Rht8基因型(T-基因型)的供试材料株高均值为66.41cm，显著低于基因型为rht8基因型(CG基因型)的供试材料的株高均值69.63cm(P<0.05，student t-test)。因此本申请的KASP分子标记及其引物可以准确鉴定或辅助鉴定小麦株高性状。

表1 77个供试小麦品种的分子标记KASP-Rht8的基因型和株高结果

表1中Rht8表示Rht8基因型(T-基因型)；rht8表示rht8基因型(CG基因型)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ctgccgcgag ggagattgcg gccatggtgc aaaatgtggc gttctggacc gaggtcgagg 60

cgatcattcg gttgtgaaga tgatca 86

<210> 2

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

ctgccgcgag ggagattgcg gccatggtgc aaaatgtggc gttctggacc gaggtcgagg 60

cgacgcattc ggttgtgaag atgatca 87

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tcatcttcac aaccgaatgc g 41

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat ttgatcatct tcacaaccga atga 44

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

ctgccgcgag ggagatt 17

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

agcatgaact tggtcacctt c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

aatccgttga ctccgacctt c 21

Claims (10)

1.检测小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸是否由“CG”突变为“T”的物质在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质含有扩增包含所述小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸在内的小麦基因组DNA片段的PCR引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述物质含有扩增包含分子标记在内的小麦基因组DNA片段的PCR引物，所述分子标记是核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的DNA分子和/或SEQ ID No.2所示的DNA分子。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述PCR引物为引物组合物，所述引物组合物由引物KASP-Rht8-F、引物KASP-Rht8-H和引物KASP-Rht8-L中的至少两种引物组成，所述引物KASP-Rht8-F为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA，所述引物KASP-Rht8-H为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；所述引物KASP-Rht8-L为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA。

5.权利要求3中所述的分子标记，和/或，权利要求2或3中所述的PCR引物，和/或，权利要求4中所述的引物组合物，和/或，含有权利要求2或3中所述的PCR引物或权利要求4中所述的引物组合物的试剂或试剂盒。

6.一种鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用权利要求4中所述引物组合物进行KASP，得到PCR产物；根据所述PCR产物的荧光信号确定待鉴定小麦Rht8基因的第1649-1650位核苷酸是否由“CG”突变为“T”来鉴定小麦株高性状。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，根据所述PCR产物的荧光信号来鉴定小麦株高性状为：Rht8基因的第1649-1650位核苷酸没有由“CG”突变为“T”的待鉴定小麦的株高高于Rht8基因的第1649-1650位核苷酸由“CG”突变为“T”的待鉴定小麦。

8.权利要求5中所述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中的应用。

9.权利要求3中所述的分子标记，和/或，权利要求2或3中所述的PCR引物，和/或，权利要求4中所述的引物组合物，和/或，权利要求5中所述的试剂或试剂盒的下述任一种应用：

B1)在制备鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的产品中的应用；

B2)在选育小麦株高性状优良品种中的应用；

B3)在制备选育小麦株高性状优良品种的产品中的应用；

B4)在小麦育种中的应用；

B5)在制备小麦育种的产品中的应用；

B6)在小麦种质资源分析或鉴定中的应用。

10.小麦育种的方法，其特征在于，所述方法包括选择T-基因型的小麦作为亲本进行育种，所述T-基因型的小麦是小麦染色体中Rht8基因的第1649-1650位核苷酸由“CG”突变为“T”的小麦。

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