CN110205398B - 一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记引物及应用 - Google Patents

一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10‑m619SN亚基的KASP标记引物及应用，包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R1；或包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R2，其中F1、F2、R1和R2的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。本发明提供的分子标记引物可用于鉴定待测小麦Dy10亚基SNP变异位点，根据SNP变异位点即可确定其高分子量谷蛋白Dy10‑m619SN亚基的表型，进而实现快速鉴定待测材料，或与SDS‑PAGE技术检测亚基表型联合使用达到辅助鉴定待测小麦的的目，提高待测材料选育效率，降低工作强度，缩短育种年限。

Description

一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记 引物及应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记引物及应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是我国乃至世界的主要粮食作物之一，其种植面积和产量约占谷物种植面积的30％。不同于其他粮食作物，小麦面粉中因含有面筋蛋白，其加水揉和后形成具有弹性和延展性的面团，这种特性使小麦适于制作各种各样的食品，如面包、饼干、面条、糕点等。随着人们生活水平的提高，小麦制品的需求量迅速增加，小麦加工品质也日益受到人们的关注。
小麦的加工品质主要取决于种子贮藏蛋白的特性。小麦种子储藏蛋白包括谷蛋白和醇溶蛋白。研究结果表明：醇溶蛋白和谷蛋白的组成、含量和比例是影响小麦加工品质的重要因素。醇溶蛋白主要是单体蛋白，分子间相互作用不强，缺少弹性，具有流动性，决定了面筋的黏性和延展性。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS；80-140KD)是谷蛋白的重要组成成分之一，并通过分子间二硫键与低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS；35-51KD)形成谷蛋白多聚合体(GMP)，决定了面团的强度和弹性。HMW-GS占小麦籽粒蛋白总量的10％，是决定小麦面团弹性的主要遗传因素，与小麦加工品质的关系最为密切。因此，选育更为优异的HMW-GS对为小麦品质育种提供可利用的基因资源具有重大意义。
HMW-GS的组成与含量对加工品质有重要影响。通过比较分析亚基组合加工品质效应，发现Glu-1等位亚基类型对加工品质的效应不同，一般认为Glu-D1位点亚基组合Dx5+Dy10对加工品质的贡献最大，Glu-B1位点亚基组合Bx17+By18比其他亚基更优质，Glu-A1位点1、2*是比Null更优质的亚基。Dx5+Dy10是目前公认的最优质亚基组合，具体到Dy10亚基，Kang等通过数量化理论及统计学鉴评100份小麦品种表明Dy10亚基对小麦蛋白质品质有积极意义，属于优质亚基，认为Dy10亚基有利于蛋白质数量的增加；Blechl等利用Dy10亚基超表达转基因株系，提高了谷蛋白聚合体含量和降低了面团延展性；Debbie等研究Dy10亚基缺失体，发现降低了面团揉混峰值时间；Wang等研究Dy10-m328SF亚基突变系，发现可以提高湿面筋量含量和面包体积。因此，Dy10亚基有利于提高面筋强度，对小麦加工品质也有重要影响。
我们利用EMS化学诱变获得一份普通小麦品种蜀麦482的Dy10亚基突变体，并命名该亚基为Dy10-m619SN，随后证明该突变体材料的高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基在合成过程中可以被部分切割，SDS-PAGE电泳检测存在两条Dy10亚基条带。我们首次在小麦高分子量谷蛋白亚基中发现蛋白切割的现象，这种Dy10-m619SN亚基可能为小麦加工品质的研究提供新的思路。因此，针对这份特异性材料，我们有必要开发一种可以快速、准确检测其表型的分子标记。
分子标记辅助选择育种技术，是利用与目的性状候选基因连锁的分子标记，通过分子生物学检测候选基因分型，达到对目的性状选择的目的。主要有操作简单，且不受环境及环境互作的影响，能够快速高效的选育出目标材料等优点。单核苷酸的多态性(SNP,Single Nucleotide Polymorphisms)是指在基因组上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括转换(transition)、颠换(transversion)、缺失(deletion)和插入(insertion)。KASP(竞争性等位基因特异性PCR，即Kompetitive Allele-Specific PCR)技术是LGC Genomics公司的SNPline基因分型检测方案。该方案的核心是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型。该项技术只要合成两个通用荧光探针再加合成针对具体位点的SNP PCR引物以及一个反向通用引物，就可以对SNP位点进行基因分型。
发明内容
本发明的目的在于提供2个基于KASP技术开发的分子标记引物用于快速鉴定或辅助鉴定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点，可以根据所述，检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基SNP变异位点确定其Dy10-m619SN亚基表型，进而实现快速鉴定待测材料或与SDS-PAGE技术检测亚基表型联合使用达到辅助鉴定待测小麦的目的，提高待测材料选育效率，降低工作强度，缩短育种年限。
为了实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记引物，所述的KASP标记引物包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R1；或包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R2。
所述的正向引物F1为：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGAGCAGCAAGCGGCCAA，(下划线表示FAM KASP荧光集团)；
所述的正向引物F2为：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAGCAGCAAGCGGCCAG，(下划线表示HEX KASP荧光集团)；
所述的反向引物R1为：CCCCCTCCATCCGACACAC；
所述的反向引物R2为：GGCTAGCCGACAATGCGTCG。
在本发明的另一方面，提供了检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基SNP变异位点的方法，包括以下步骤：
1)提取待测小麦样品的DNA；
2)取模板DNA，利用正向引物F1、正向引物F2以及反向引物R1/R2进行KASP PCR扩增；
3)采用Bio-Rad CFX96TM PCR扩增仪扩增PCR产物；
4)用生物学软件对PCR扩增产物进行基因分型。
所述的步骤(3)中PCR反应程序为：95℃预变性15min；第一步扩增反应：95℃变性20s，68℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环；15℃保存。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测小麦Dy10-m619SN亚基的方法是检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点是G:G、A:A还是G:A，以此确定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的表型。
检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点是G:G、A:A还是G:A的方法包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用KASP引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据荧光信号判断。FAM荧光型号携带基因型A:A，HEX荧光信号携带基因型G:G，携带两种荧光信号携带基因型G:A。
在本发明的另一方面，提供了一种用于检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的试剂盒，所述的试剂盒包含上述正向引物F1、正向引物F2和反向引物R1；或包含正向引物F1、正向引物F2和反向引物R2。
在本发明的另一方面，所述的正向引物F1、正向引物F2以及反向引物R1/R2在检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果为：
本发明基于待测小麦SNP变异位点开发了KASP标记专用引物，通过实验证明：利用本发明的KASP标记引物可用于鉴定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点为G:G、A:A还是G:A，根据待测小麦的SNP变异位点即可确定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的表型(即SDS-PAGE技术鉴定Dy10-m619SN亚基表型)。
KASP标记在待测材料苗期便可通过提取的叶片DNA判断下一代种子高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的表型，避免了繁琐的、大量的SDS-PAGE技术检测，有效降低了育种的工作量，大大缩短育种进程。例如：在待测材料的后代需要多次回交或者杂交纯化背景的操作时，利用KASP标记可以快速鉴定表型，选取所需后代、淘汰其他单株，工作量大大降低，增强了育种工作中的可操作性，同时节省了大量时间、缩短育种年限。
附图说明
图1是野生型与突变型材料SDS-PAGE技术鉴定的结果；其中星号为高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基条带的位置；
图2是野生型和突变型材料的高分子量谷蛋白Dy10亚基部分核苷酸序列的比对结果，红色方框表示SNP变异位点；
图3是不同高分子量谷蛋白亚基的部分核苷酸序列多重比对，以及选择合适的位置开发KASP分子标记引物，下划线表示引物的位置；
图4是本发明正向引物F1和反向引物R1引物组分子标记的鉴定结果，GG代表野生型Dy10，AA代表突变型Dy10-m619SN，GA代表杂合型；
图5是本发明正向引物F2和反向引物R2引物组分子标记的鉴定结果，GG代表野生型Dy10，AA代表突变型Dy10-m619SN，GA代表杂合型；
图6是野生型与突变型杂交后代SDS-PAGE技术的鉴定结果；其中星号为高分子量谷蛋白Dy10亚基条带的位置。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1引物的获得
待测材料的高分子量谷蛋白亚基表型如图1SDS-PAGE图所示(左侧为野生型，右测为突变型)。随后对待测材料野生型和突变型的高分子量谷蛋白Dy10亚基进行基因克隆测序，证明两份材料的高分子量谷蛋白Dy10亚基的核苷酸序列仅在1856bp处有一个SNP变异位点(图2)，另外也对待测材料的其他高分子量谷蛋白亚基(Ax1、Dx5、Bx7和By9)进行了基因克隆测序，图3所示为不同高分子量谷蛋白亚基核苷酸序列部分多重比对图。依据KASP引物的设计原则，结合高分子量谷蛋白亚基核苷酸序列比对结果，选择合适的基因位置设计KASP标记引物(如图3下划线所示)。
实施例2检测方法的建立
本发明提供的分子标记引物在检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的应用步骤，具体实验步骤如下：
1)提取待测小麦样品的DNA，稀释到模板浓度为100ng/μl；
2)取模板DNA 1.00μl，引物混合液0.14μl，KASP MasterMix 5.00μl，50mM的MgCl2溶液0.08μl，H2O 3.78μl，混合均匀进行PCR扩增(引物混合液中正向引物F1、正向引物F2以及反向引物R1/R2的终浓度均为10μM)；
其中正向引物F1为：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGAGCAGCAAGCGGCCAA；
正向引物F2为：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAGCAGCAAGCGGCCAG；
反向引物R1为：CCCCCTCCATCCGACACAC；
或反向引物R2为：GGCTAGCCGACAATGCGTCG。
3)采用Bio-Rad CFX96TMPCR扩增仪扩增PCR产物；
4)PCR反应程序为：95℃预变性15min；第一步扩增反应：95℃变性20s，68℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环；15℃保存；
5)利用生物学软件对PCR扩增产物进行基因分型。
实施例3对野生型和突变型的杂交后代分别进行SDS-PAGE技术鉴定和利用KASP标记检测
杂交后代F2种子采用半粒法磨粉进行SDS-PAGE技术检测，图6所示为部分F2籽粒谷蛋白检测结果，其中含有野生型、突变型以及杂合型。对SDS-PAGE技术检测的F2籽粒在垫有3-5ml蒸馏水润湿过的滤纸培养皿中进行发芽试验，提取DNA，采用上述(2)建立的KASP标记检测方法进行SNP变异位点的检测。图4和图5为两个标记的基因分型鉴定结果，结果表明KSAP实验结果与SDS-PAGE检测结果一致。说明本发明的KASP标记确实适用于检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基表型。
结果表明，上述KASP标记可以快速、准确地检测待测材料高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基表型。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记引物及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tcagagcagc aagcggccaa 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tcagagcagc aagcggccag 40
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccccctccat ccgacacac 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctagccga caatgcgtcg 20

Claims (5)

1.一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的KASP标记引物，其特征在于，所述的KASP标记引物包括正向引物F1、正向引物F2，以及反向引物R1或反向引物R2，所述的F1、F2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~2所示；反向引物R1和反向引物R2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3~4所示；
通过检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点是GG、AA或GA，确定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基表型，GG代表野生型Dy10，AA代表突变型Dy10-m619SN，GA代表杂合型。
2.一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的方法，其特征在于，包括：
提取待测小麦样品的DNA；
取模板DNA，利用权利要求1所述引物进行KASP PCR扩增；
采用PCR扩增仪扩增PCR产物；
用生物学软件对PCR扩增产物进行基因分型；通过检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点是GG、AA或GA，确定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基表型，GG代表野生型Dy10，AA代表突变型Dy10-m619SN，GA代表杂合型。
3.根据权利要求2所述的一种检测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：95℃预变性15min；第一步扩增反应：95℃变性20s，68℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环；15℃保存。
4.一种用于检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的KASP标记引物；通过检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点是GG、AA或GA，确定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基表型，GG代表野生型Dy10，AA代表突变型Dy10-m619SN，GA代表杂合型。
5.权利要求1所述的KASP标记引物在检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基中的应用，其特征在于，通过检测待测小麦高分子量谷蛋白Dy10亚基的SNP变异位点是GG、AA或GA，确定待测小麦高分子量谷蛋白Dy10-m619SN亚基表型，GG代表野生型Dy10，AA代表突变型Dy10-m619SN，GA代表杂合型。
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