CN105021686A - 一种同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，包括提取谷蛋白亚基和制胶电泳。本发明的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，能够同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基，方法操作简单，工作量小，检测快捷。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法。
背景技术
高分子量(HMW)麦谷蛋白亚基组成是预测小麦品质的一项重要指标，自应用SDS-PAGE分离蛋白质多肽混合物以来,各国的科学家根据已有实验条件，逐步摸索，提出了许多用来分析高分子量(HMW)麦谷蛋白亚基的SDS-PAG方法，在SDS-PAGE实验中，获得准确可靠、分辨率高的高分子量(HMW)麦谷蛋白亚基图谱是品质鉴定、筛选优良品种的重要保证。此实验要求条件比较严格，需要在冷却循环的环境下进行，对上样蛋白的质量要求较高，且电泳时间较长，迁移率相近的亚基很难区分、工作量较大、耗费的时间较长。同时低分子量(LMW)蛋白检测也存在工作量大、耗费时间长的问题。
发明内容
本发明的目的之一是为解决高分子量和低分子量谷蛋白检测工作量大，耗时长，效率低的问题，提供一种相对简单、高效的，能够同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法。
本发明提供一种同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，包括提取谷蛋白亚基和制胶电泳，所述制胶电泳包括以下步骤：
将玻璃板清理干净，再用蒸馏水冲洗晾干；
将制胶器放平，用1mm胶条放在玻璃板两侧，将两块玻璃板盖上，用两边旋钮上紧；
配制分离胶，吸取所述分离胶，向所述玻璃板直接灌胶，控制灌胶速度，至离上玻璃板面3cm处停止灌胶，加超纯水至胶面形成两相界面，将胶面压平且防止胶面干燥，在室温下凝胶45min；
分离胶聚合以后，将水倒出，用滤纸把剩余的水吸干；
配制浓缩胶，摇匀灌胶，插入梳子，室温下凝聚30min；
拔出梳子，用lx电极缓冲液冲洗样槽，将凝胶转移到电泳槽上，调整点样孔；
电泳槽中加入电极缓冲液，每个点样孔上样10μl，稳流30mA/板，电泳3.5h后停止；
取下胶后，先用超纯水洗胶一次，去掉点样时的梳孔胶，在胶的一边切去一角，做好标记，再加染色液，置摇床上染色过夜；
过夜后，用脱色液脱色至背景清晰，然后用蒸馏水冲洗2遍，拍照分析，晾干保存。
进一步的，所述配制分离胶为取30％丙烯酰胺溶液10.72ml、pH 8.8的1.5mol/L Tris-HCl3.75ml和10％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液200μl混合，最后加入APS(过硫酸铵)200μl和TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)20μl，用超纯水定容至200ml，立刻摇匀即得。
进一步的，所述配制浓缩胶为取30％丙烯酰胺溶液2.50ml、pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl3.75ml和10％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液150μl混合，最后加入APS(过硫酸铵)56μl和TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)18.2μl，用超纯水定容至200ml，摇匀即得。
进一步的，所述电极缓冲液为取甘氨酸72g、Tris14.4g和10％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液10ml混合，用超纯水定容至1L，摇匀即得。
进一步的，所述染色液为取考马斯亮蓝R-250 1.0g、甲醇500ml、乙酸100ml和蒸馏水400ml混合，摇匀即得。
进一步的，所述脱色液脱色时间3h；所述蒸馏水脱色时间1d；所述脱色液为取甲醇200ml、乙醇70ml和蒸馏水730ml混合，摇匀即得。
进一步的，所述提取谷蛋白亚基步骤包括：
将种子制成粉末；
将所述粉末倒入离心管，加入提取液A，充分混合均匀后放置摇床上；
摇好的离心管离心后弃上清液，将离心管倒扣在吸水纸上吸水，再加入提取液B1，充分震荡，水浴加热后离心；
取离心后的上清液，置于另一离心管中然后加入提取液B2，充分混匀，水浴加热；
然后加入提取液C，充分混匀，水浴加热后，放置冰箱备用。
进一步的，所述提取液A为取7.5ml正丙醇、0.3M NaI，加双蒸水定容至100ml；提取液A加入量为1ml，摇床温度为60℃或常温，时间大于1h。
进一步的，所述提取液B1为取体积分数50％的正丙醇和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl按1:1混合，再加入相当于混合溶液体积1.0％的DTT(二硫苏糖醇)，摇匀即得；所述提取液B1加入量为100μl，水浴条件为60℃，大于30min，离心条件为10000r/min离心5min。
进一步的，所述提取液B2为取体积分数50％的正丙醇和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl按1:1混合，再加入相当于混合溶液体积1.4％的4-VP(4-乙烯基吡啶)，摇匀即得；所述上清液与提取液B2均为50μl，水浴条件为65℃，15min。
进一步的，提取液C为质量分数2％的SDS(十二烷基硫酸钠)，质量分数40％的甘油40ml，质量分数0.02％的溴酚蓝和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl0.02g混合溶液；提取液C加入量为0.1ml，水浴条件为65℃，15min。
本发明的有益效果在于：本发明的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，能够同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基，方法操作简单，工作量小，检测快捷。
附图说明
图1所示为本发明同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法的电泳图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
本发明的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，包括提取谷蛋白亚基和制胶电泳。
提取谷蛋白亚基步骤包括：
将种子放在称量纸片上，然后用锤子将种子砸细成粉末。
将砸碎的粉末倒入1.5ml离心管，然后加入1ml提取液A(每100ml提取液含7.5％正丙醇+0.3M NaI，加dd水定容至100ml)，充分混合均匀后放置60℃摇床上摇1h以上(亦可在常温)。
然后在10000r/min离心5min后弃上清，将离心管倒扣在吸水纸上几分钟，保证去除干净，加入100μl提取液B1(体积分数50％的正丙醇和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl按1:1混合，再加入相当于混合溶液体积1.0％的dtt，摇匀即得。)充分震荡，60℃水浴至少30min后10000r/min离心5min。
取上清50μl于另一离心管中然后加入等体积的提取液B2(体积分数50％的正丙醇和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl按1:1混合，再加入相当于混合溶液体积1.4％的4-VP，摇匀即得。)充分混匀，65℃水浴15min。
然后加入0.1ml提取液C(质量分数2％的SDS，质量分数40％的甘油40ml，质量分数0.02％的溴酚蓝，0.08M，PH8.0的Tris-Hcl0.02g)，充分混匀，65℃水浴15min放置冰箱备用。
制胶电泳包括以下步骤：
玻璃板的清洗：将玻璃板用去污剂清理干净，最后用蒸馏水冲洗晾干。
组装制胶：将制胶器放平，用1mm胶条放在玻璃板两侧，将两块玻璃板盖上，用两边旋钮上紧。
分离胶的灌制：配制分离胶，用注射器吸取胶液，直接灌胶，用手控制灌胶速度，快慢适当(顺玻璃板慢慢倾入，切勿夹进气泡，约至离上玻璃板面3cm处停止灌胶)，后用移液器吸取超纯水，缓缓加至胶面形成一个两相界面，将胶面压平且防止胶面干燥，在室温下凝胶约45min。
分离胶聚合以后，将水倒出，用滤纸把剩余的水吸干，不要碰到胶面，避免胶面不平整，影响后续试验。
浓缩胶的灌制：配制浓缩胶，插入梳子(如有气泡，可通过调整梳子赶出气泡)，室温下凝聚30min。
拔出梳子，用lx电极缓冲液冲洗样槽数次，将凝胶转移到电泳槽上，用注射器调整点样孔。
上样及电泳：电泳槽中加入电极缓冲液，每个点样孔上样10μl，电泳(稳流30mA/板)，电泳3.5h停止电泳。
拔胶、染色：取下胶后，先用超纯水洗胶一次，去掉点样时的梳孔胶，在胶的一边切去一角，做好标记，再加染液，置摇床上染色过夜(染色液可重复使用3-5次)。
脱色、照相：过夜后，先用脱色液脱色3h左右至背景清晰，然后用蒸馏水继续脱色1d至背景清洗。用凝胶成像仪拍照分析，将胶用两层玻璃纸夹好晾干保存。
通过上述方法得到的高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳图如图1所示，图1中A层为高分子量谷蛋白亚基，B层为低分子量谷蛋白亚基，A层和B层之间分界明显，说明检测的两种谷蛋白亚基相互之间无干扰，能够被同时检测出来。
分离胶配制
浓缩胶配制
电极缓冲液配制
染色液的配制
脱色液的配制
常规试剂配制
本发明的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，能够同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基，方法操作简单，工作量小，检测快捷。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (10)
1.一种同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，包括提取谷蛋白亚基和制胶电泳，所述制胶电泳包括以下步骤：
将玻璃板清理干净，再用蒸馏水冲洗晾干；
将制胶器放平，用1mm胶条放在玻璃板两侧，将两块玻璃板盖上，用两边旋钮上紧；
配制分离胶，吸取所述分离胶，向所述玻璃板直接灌胶，控制灌胶速度，至离上玻璃板面3cm处停止灌胶，加超纯水至胶面形成两相界面，将胶面压平且防止胶面干燥，在室温下凝胶45min；
分离胶聚合以后，将水倒出，用滤纸把剩余的水吸干；
配制浓缩胶，摇匀灌胶，插入梳子，室温下凝聚30min；
拔出梳子，用lx电极缓冲液冲洗样槽，将凝胶转移到电泳槽上，调整点样孔；
电泳槽中加入电极缓冲液，每个点样孔上样10μl，稳流30mA/板，电泳3.5h后停止；
取下胶后，先用超纯水洗胶一次，去掉点样时的梳孔胶，在胶的一边切去一角，做好标记，再加染色液，置摇床上染色过夜；
过夜后，用脱色液脱色至背景清晰，然后用蒸馏水冲洗2遍，拍照分析，晾干保存。
2.如权利要求1所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述配制分离胶为取30％丙烯酰胺溶液10.72ml、pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl 3.75ml和10％SDS溶液200μl混合，最后加入APS200μl和TEMED20μl，用超纯水定容至200ml，立刻摇匀。
3.如权利要求1所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述配制浓缩胶为取30％丙烯酰胺溶液2.50ml、pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl 3.75ml和10％SDS溶液150μl混合，最后加入APS56μl和TEMED18.2μl，用超纯水定容至200ml，摇匀。
4.如权利要求1所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述电极缓冲液为取甘氨酸72g、Tris14.4g和10％SDS溶液10ml混合，用超纯水定容至1L，摇匀。
5.如权利要求1所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述染色液为取考马斯亮蓝R-250 1.0g、甲醇500ml、乙酸100ml和蒸馏水400ml混合，摇匀。
6.如权利要求1所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述脱色液脱色时间3h；所述蒸馏水脱色时间1d；所述脱色液为取甲醇200ml、乙醇70ml和蒸馏水730ml混合，摇匀。
7.如权利要求1所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述提取谷蛋白亚基步骤包括：
将种子制成粉末；
将所述粉末倒入离心管，加入提取液A，充分混合均匀后放置摇床上；
摇好的离心管离心后弃上清液，将离心管倒扣在吸水纸上吸水，再加入提取液B1，充分震荡，水浴加热后离心；
取离心后的上清液，置于另一离心管中然后加入提取液B2，充分混匀，水浴加热；
然后加入提取液C，充分混匀，水浴加热后，放置冰箱备用。
8.如权利要求7所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述提取液A为取7.5ml正丙醇、0.3M NaI，加双蒸水定容至100ml；所述提取液A加入量为1ml，摇床温度为60℃或常温，时间大于1h。
9.如权利要求7所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述提取液B1为取体积分数50％的正丙醇和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl按1:1混合，再加入相当于混合溶液体积1.0％的DTT，摇匀即得；所述提取液B1加入量为100μl，水浴条件为60℃，大于30min，离心条件为10000r/min离心5min。
10.如权利要求7所述的同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法，其特在于，所述提取液B2为取体积分数50％的正丙醇和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl按1:1混合，再加入相当于混合溶液体积1.4％的4-VP，摇匀即得；所述上清液与提取液B2均为50μl，水浴条件为65℃，15min；提取液C为质量分数2％的SDS，质量分数40％的甘油40ml，质量分数0.02％的溴酚蓝和0.08M，PH8.0的Tris-Hcl0.02g混合溶液；所述提取液C加入量为0.1ml，水浴条件为65℃，15min。
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