CN108387630B - 一种改良sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改良SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺，本发明对传统SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行了改良，根据传统SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳后经考马斯亮蓝染色，查看中国春和宁春4号HMW‑GS分离情况，然后用直尺测量宁春4号1Ax1亚基在分离胶内的迁移距离，并据此计算放大胶的灌入量，在原有的基础上增加了放大胶，改良SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳技术通过放大胶的放大作用，将不同蛋白质亚基条带间的距离明显拉大，其分辨率得到显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及电泳技术领域，具体涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术领域，具体是指一种改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物的电泳技术，由Raymond和Weintraub于1959年最早采用，Leonard、White和Davis等人又于20世纪60年代初进行了不连续电泳系统方面的研究。在此基础上，shapiro于1967年建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，经过不断完善，SDS-PAGE技术已成为蛋白质分离检测最常用的方法。目前，SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，该体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成，其中浓缩胶的作用主要是堆积作用；进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快，大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
然而，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳还是容易将迁移率相近的不同蛋白亚基做出误判，尤其是上样量大的情况下，电泳条带变宽，蛋白亚基之间的差异就更会被掩盖，往往认为是同一个蛋白亚基。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺点与不足，提供一种改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺，通过放大胶的放大作用，将不同蛋白质亚基条带间的距离明显拉大，其分辨率得到显著提高。
为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：
(1)高分子量谷蛋白亚基的提取
分别取小麦品种为中国春和宁春4号的小麦种子放入一个离心管中，然后进行研磨，按每mg小麦种子加25μL蛋白质提取液，于蜗旋混匀器上充分混匀；沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液上样；
(2)改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用双板夹芯式垂直电泳槽和电泳仪，
浓缩胶浓度为5％，放大胶的浓度为12.5％，分离胶浓度为8％，三者交联度均为3.33％，当溴酚蓝跑出凝胶后即停止电泳，用考马斯亮蓝染色。
进一步设置是所述的分离胶包括以下组分，以体积份数计：
进一步设置是所述的放大胶包括以下组分，以体积份数计：
进一步设置是所述的浓缩胶包括以下组分，以体积份数计：
进一步设置是所述的放大胶的浓度为12.5％通过以下步骤实现，取步骤(1)上清液进行传统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体包括：
采用双板夹芯式垂直电泳槽和电泳仪；浓缩胶的5％，分离胶的浓度为12.5％，二者交联度均为3.33％，当溴酚蓝跑出凝胶后即停止电泳，用考马斯亮蓝染色；查看中国春和宁春4号高分子量谷蛋白亚基分离情况，然后用直尺测量宁春4号的1Ax1谷蛋白亚基在分离胶内的迁移距离，并据此计算放大胶的灌量。
进一步设置是所述的步骤(1)具体为：
用刀片切取1/3-1/2粒小麦种子放入一个预先准确称量质量的1.5mL离心管中，再称量其质量以计算样品的质量；然后往离心管中放入1粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min；按每mg加25μL蛋白质提取液，于蜗旋混匀器上充分混匀；沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液上样。
进一步设置是步骤(1)中所述的离心管的精度为0.001g。
进一步设置是步骤(1)中所述的蛋白质提取液为70mmol L-1Tris-HCl,2％(V/V)β-巯基乙醇，2％(W/V)SDS，20％(V/V)甘油，0.005％(W/V)溴酚兰的混合物。
本发明的改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术通过放大胶的放大作用，将不同蛋白质亚基条带间的距离明显拉大，其分辨率得到显著提高。具体见实施例实验数据。
附图说明
图1(A)传统SDS-PAGE凝胶电泳图
图1(B)改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体的实施案例对本发明进一步说明。
本发明实施例所用的小麦品种中国春和宁春4号。其中，中国春的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成为N,1Bx7+1By8,1Dx2+1Dy12，宁春4号的HMW-GS组成为1Ax1,1Bx17+1By18,1Dx5+1Dy10。
本发明实施例所用的试剂：
传统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)所需试剂
①聚丙烯酰胺凝胶原液：：30％(w/v，Acr:Bis＝29:1)
②分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)
③浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)
④10％(w/v)SDS溶液
⑤10％(w/v)过硫酸铵溶液
⑥SDS-PAGE电泳缓冲液：0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.10％(w/v)SDS
⑦考马斯亮蓝R-250染色液：45％(v/v)甲醇，10％(v/v)醋酸，0.2％(w/v)考马斯亮蓝R-250
⑧脱色液：10％(v/v)甲醇，10％(v/v)醋酸
(2)分离胶
分离胶(12.5％)配方
(3)浓缩胶
浓缩胶(5％)配方
2、改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)所需试剂
同传统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)分离胶
分离胶(8％)配方
(3)放大胶
放大胶(12.5％)配方
注：根据测量宁春4号1Ax1亚基在分离胶内的迁
移距离，取1.42mL灌胶
(4)浓缩胶
浓缩胶(5％)配方
实施例
(1)HMW-GS的提取
用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入一个预先准确称量质量(精度为0.001g)的1.5mL离心管中，再称量其质量以计算样品的质量；然后往离心管中放入1粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min；按每mg加25μL蛋白质提取液(70mmol L-1Tris-HCl,2％(V/V)β-巯基乙醇，2％(W/V)SDS，20％(V/V)甘油，0.005％(W/V)溴酚兰)，于蜗旋混匀器上充分混匀；沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液上样。
(2)传统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳采用双板夹芯式垂直电泳槽(北京六一DYCZ-30C)和DYY-8C型电泳仪。浓缩胶的5％，分离胶的浓度为12.5％，二者交联度均为3.33％，当溴酚蓝跑出凝胶后即停止电泳，考马斯亮蓝染色。
(3)改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
传统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后经考马斯亮蓝染色，查看中国春和宁春4号HMW-GS分离情况，然后用直尺测量宁春4号1Ax1亚基在分离胶内的迁移距离，并据此计算放大胶的灌入量。改良SDS-PAGE凝胶电泳的浓缩胶浓度为5％，放大胶的浓度为12.5％，分离胶浓度为8％，三者交联度均为3.33％，电泳时间跟传统SDS-PAGE凝胶电泳相同，考马斯亮蓝染色。
传统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：从图1(A)可以看出，中国春的1Dy12亚基和宁春4号的1Dy10亚基的迁移速率非常接近，尤其是泳道1中的1Dy12亚基与泳道2中的1Dy10亚基的迁移速率几乎不能看出差异，这样就很容易将二者误认为同一亚基。
改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：从图1(B)可以看出，中国春及宁春4号不同亚基间的距离被明显拉大，不同泳道间亚基迁移速率的差异也被放大，能够较轻松地将泳道1和泳道3中的1Dy12亚基与泳道2和泳道4中的1Dy10亚基区分开来。
与传统SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术相比，改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术增加了放大胶，改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术通过放大胶的放大作用，将不同蛋白质亚基条带间的距离明显拉大，其分辨率得到显著提高。
Claims (4)
1.一种改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)高分子量谷蛋白亚基的提取
分别取小麦品种为中国春和宁春4号的小麦种子放入一个离心管中，然后进行研磨，按每mg小麦种子加25μL蛋白质提取液，于蜗旋混匀器上充分混匀；沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液上样；
(2)改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用双板夹芯式垂直电泳槽和电泳仪，
浓缩胶浓度为5％，放大胶的浓度为12.5％，分离胶浓度为8％，三者交联度均为3.33％，当溴酚蓝跑出凝胶后即停止电泳，用考马斯亮蓝染色；
所述的分离胶包括以下组分，以体积份数计：
所述的放大胶包括以下组分，以体积份数计：
所述的浓缩胶包括以下组分，以体积份数计：
2.根据权利要求1所述的改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺，其特征在于，所述的步骤(1)具体为：
用刀片切取1/3-1/2粒小麦种子放入一个预先准确称量质量的1.5mL离心管中，再称量其质量以计算样品的质量；然后往离心管中放入1粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min；按每mg加25μL蛋白质提取液，于蜗旋混匀器上充分混匀；沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液上样。
3.根据权利要求1所述的改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺，其特征在于，步骤(1)中所述的离心管的精度为0.001g。
4.根据权利要求1所述的改良SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳工艺，其特征在于，步骤(1)中所述的蛋白质提取液为70mmol L-1 Tris-HCl,2％(V/V)β-巯基乙醇，2％(W/V)SDS，20％(V/V)甘油，0.005％(W/V)溴酚兰的混合物。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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