CN113866250A - 一种有效检测泪蛋白降解的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有效检测泪蛋白降解的方法，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法检测角膜接触镜清洗溶液中的蛋白含量，获得表征蛋白降解量的蛋白条带，其具体包括：将被检测蛋白样本加入镜片洗护液中形成混合溶液，控制该混合溶液中被检测蛋白的理论浓度，自该混合溶液中定量取样液进行电泳解离，电泳解离完成后定量取所述样液的上样，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述上样中的蛋白上样量，获得表征蛋白降解量的蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量。通过本发明所述的有效检测泪蛋白降解的方法可以定量定性的检测出镜片泪蛋白的降解情况，证明镜片清洗设备的去蛋白能力，为用户提供实验检测数据，保障用户消费使用安全。
Description
技术领域
本发明涉及生物蛋白检测领域，尤其涉及一种有效检测角膜接触镜上泪蛋白是否完全降解的方法。
背景技术
角膜接触镜如何除蛋白的问题困扰了行业半个多世纪，引发了各国的眼视光行业对接触镜佩戴安全的高度重视。我国也因角膜接触镜上的角膜感染案例频发，从而将接触镜在2012年便列入第三类医疗器械类，作为高风险管理，其原因在于：接触镜材质结构有大量肉眼不见的纤维透痒孔，人眼时刻分泌大量的泪液，泪液里含有大量泪蛋白，泪蛋白极易渗透到纤维透痒孔中，造成镜片DK值降低(透氧率)，造成角膜缺氧、水肿等症状，严重的会造成角膜受损，细菌感染，角膜炎症甚至是视力受损等问题。
为了有效清除接触镜表面的泪蛋白，保障消费者的眼部安全，市场也推出了多种用于去除角膜接触镜表面泪蛋白的方法，但由于肉眼不可见泪蛋白是否被完全有效的洗脱降解，逐渐的蛋白检测方法就被重视发展起来，以使得通过科学检测有效验证是否蛋白被完全降解，但是现阶段市场上的角膜接触镜有效除蛋白的检测方法具有局限性，无法精准定量定性测得接触镜清洗后的蛋白残留，因此其检测结果不全面，仅具有一定的参考意义，其并不能成为定量定性检测蛋白降解程度的专业检测依据。
因此，亟需提出一种新的技术方案来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种有效检测角膜接触镜上泪蛋白是否完全降解的方法，采用的技术方案如下：
一种有效检测泪蛋白降解的方法，其具体包括：
将被检测蛋白样本加入镜片洗护液中形成混合溶液，控制该混合溶液中被检测蛋白的理论浓度，自该混合溶液中定量取样液进行电泳解离，电泳解离完成后定量取所述样液的上样，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述上样中的蛋白上样量，获得表征蛋白降解量的蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量。
在一个进一步的实施例中，所述有效检测蛋白降解的方法具体包括：
提供被检测蛋白样本；
将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为3mg/mL，取3微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液进行电泳解离，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入B镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液进行电泳解离，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
进一步的，所述被检测蛋白样本为溶菌酶，所述溶菌酶的分子量为 14Kda，
进一步的，所述A镜片洗护液为0.9％NaCl溶液，
进一步的，所述B镜片洗护液为含0.9％NaCl的3N专用清洁液，
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中，溶液中被检测蛋白的理论浓度为3mg/mL，以使得被检测蛋白于0.9％NaCl溶液中浸泡跑胶，30分钟后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
进一步的，所述方法通过加入电泳缓冲液、蛋白电泳上样缓冲液、染色液、脱色液和凝胶配合所述被检测蛋白于0.9％NaCl溶液中浸泡跑胶。
在一个进一步的实施例中，所述有效检测蛋白降解的方法具体包括：
提供被检测蛋白样本；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入C镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入D镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液，2小时后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
进一步的，所述被检测蛋白样本为溶菌酶，所述溶菌酶的分子量为 14Kda，
进一步的，所述C镜片洗护液为除蛋白组合液，
进一步的，所述D镜片洗护液为除蛋白双氧水。
在一个进一步的实施例中，将被检测蛋白样本加入镜片洗护液中形成混合溶液，控制该混合溶液中被检测蛋白的理论浓度，所述混合溶液中被检测蛋白的理论浓度大于等于0.001mg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果中的一个或多个：
1.本发明提供一种有效检测泪蛋白降解的方法，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法(SDS-PAGE)检测不同护理液对蛋白的降解，为了使检测结果直观可见，实验中将人工泪液中溶菌酶的理论浓度由1.9mg/mL提高到3mg/mL，所述SDS-PAGE检测方法通过控制变量法检测不同护理液对蛋白的降解情况，并通过表征蛋白降解量的蛋白条带反映检测情况，通过所述蛋白条带可直接读出蛋白含量值，实现了定量定性检测。
2.本发明可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法(SDS-PAGE)检测市售其它护理液对蛋白的降解，同样通过控制变量法检测其他护理液对蛋白的降解情况，通过对照可验证不同护理液对蛋白的降解情况不同，同样可通过表征蛋白降解量的蛋白条带反映检测情况，通过所述蛋白条带可直接读出蛋白含量值，实现了定量定性检测。
3.本发明所述的检测方法可以用来检测市售的隐形眼镜清洗设备及护理液对镜片上泪蛋白的降解效果，实验得到的数据可以为消费者提供指导性意见，保障消费者的健康安全。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为验证例2中用12％SDS-PAGE检测3N护理液对溶菌酶的降解情况得到的电镜图；
图2为验证例2中用15％SDS-PAGE检测市场商用硬性角膜接触镜除蛋白液对溶菌酶的降解情况得到的电镜图；
图3为验证例3中将蛋白加到镜片上，25℃吸附48小时后紫外灯下观察的电镜图，其中左边的镜片(a)、右边的镜片(b)为相同条件下的实验镜片；
图4为对图3中的镜片(a)和镜片(b)进行对比实验后得到的蛋白荧光检测图，其中左边的镜片(a1)为对图3中的镜片(a)进行电泳后得到的，右边的镜片(b1)为对图3中的镜片(b)进行电泳后得到的。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或者元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
下面结合附图与实施例进一步说明本发明要旨。
实施例：
本发明所述的有效检测蛋白降解的方法可以对通过隐形眼镜清洗设备清洗过的镜片进行去蛋白效果验证，在此先说明的是，隐形眼镜清洗设备对镜片进行清洗去蛋白处理是通过电泳解离实现降解蛋白的，降解原理如下：
电泳解离除蛋白方法主要是将蛋白电泳技术与电解技术进行叠加。首先，蛋白电泳技术(Electrophoresis)是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象，大分子的蛋白质，多肽，病毒粒子，甚至细胞或小分子的氨基酸，核苷等在电场中都可作定向泳动，在本发明所述隐形眼镜清洗器的作用下，泪蛋白带电荷，在清洗仓镜片清洗槽内探针场强作用下向着探针电极位置移动，从而达到清洁角膜接触镜的功效。再者，电解技术是指，将电流通过电解质溶液或熔融态电解质(又称电解液)后，在阴极和阳极上引起氧化还原反应的过程。
在一种实施例中，可以将Nacl溶液作为清洗镜片的电解质溶液，电解过程中Nacl溶液中的氯离子向正极探针移动，并失去电子被还原为氯气，一定浓度的Nacl溶液，产生的氯气一部分通过由气泡排出，一部分溶于水并发生如下化学反应：
Cl2+H2O＝HCl+HClO
该反应生成的HClO具有降解蛋白质和杀菌消毒的作用。
以上理论证明了本发明在实现电泳解离除蛋白灭菌方法时使用的电解质溶液可以是任何不含重金属的含氯离子的溶液，甚至于生理盐水、普通护理液(基本上市面流通的护理液均含有氯离子)都可以作为本发明所述的电解质溶液，比较常规的比如NaCl溶液、KCl溶液、MgCl2溶液，以及含Cl-的眼镜护理液，或者这些溶液中多种的组合(前提是不会发生反应从而破坏电解使得在镜片清洗槽内不能产生次氯酸)。
为了验证隐形眼镜清洗设备的去蛋白效果，出现了一种检测蛋白降解的方法，其是通过微量紫外分光光度计检测角膜接触镜清洗溶液中的蛋白含量，具体包括：
利用清洗设备配合电泳解离液电泳解离实验组的一定量的蛋白样本，通过所述微量紫外分光光度计检测实验组中电泳解离后所述电泳解离液中的蛋白含量，获得实验蛋白浓度值；
利用所述清洗设备配合电泳解离液对平行对照组进行电泳解离，通过所述微量紫外分光光度计检测平行对照组的清洗溶液中的蛋白含量，获得对照蛋白浓度值；
将实验蛋白浓度值和对照蛋白浓度值进行对比，获得实际蛋白浓度值。
上述技术方案进一步的，利用所述清洗设备配合电泳解离液电泳解离时，所述电泳解离液中生成次氯酸根，
进一步的，通过所述微量紫外分光光度计检测实验组中电泳解离后所述电泳解离液中的蛋白含量，具体包括：
于所述清洗槽中加入中和所述次氯酸的离子溶液；
利用所述微量紫外分光光度计进行电泳解离液中蛋白浓度检测，获得实验蛋白浓度值。
进一步的，中和所述次氯酸的离子溶液包括亚硫酸钠。
进一步的，利用清洗设备配合电泳解离液电泳解离实验组的一定量的蛋白样本，具体包括：
提供分子量为14Kda的溶菌酶作为蛋白样本，
将所述蛋白样本加入所述电泳解离液中获得混合溶液，所述电泳解离液为0.9％NaCl溶液，
自所述混合溶液中定量取2～5毫升上样，将所述上样加入清洗设备的清洗槽中进行电泳解离，
电泳解离完成后于所述清洗槽中加入10％的亚硫酸钠，通过所述微量紫外分光光度计检测溶液中蛋白浓度，获得实验蛋白浓度值。
进一步的，平行设置多组所述实验组，对多组所述实验组电泳解离后上样中的蛋白浓度进行检测，获得多组实验蛋白浓度值，对所述多组实验蛋白浓度值取平均值，该平均值作为最终实验蛋白浓度值。
进一步的，利用所述微量紫外分光光度计检测电泳解离前上样中的蛋白浓度，作为电泳解离前所述蛋白样本的原始浓度值，对多组所述实验组进行原始浓度检测获得多组所述原始浓度值，对多组所述原始浓度值取平均值作为最终原始浓度值，
进一步的，将所述最终实验蛋白浓度值与所述最终原始浓度值进行对比，得到清洗溶液中蛋白的降解量。
进一步的，利用所述清洗设备配合电泳解离液对平行对照组进行电泳解离，具体包括：
进一步的，将2～5毫升0.9％NaCl溶液加入清洗设备的清洗槽中，启动清洗设备对清洗槽内的NaCl溶液进行电泳解离，于完成电泳解离的清洗槽中加入10％的亚硫酸钠，通过所述微量紫外分光光度计检测溶液中蛋白浓度，获得对照蛋白浓度值。
进一步的，所述平行对照组不加入蛋白样本，通过所述微量紫外分光光度计检测获得的对照蛋白浓度值为零，将实验蛋白浓度值和对照蛋白浓度值进行对比，获得实际蛋白浓度值。
利用上述检测蛋白降解的方法验证隐形眼镜清洗设备对蛋白质的清除效果，可参见下述验证例1。
验证例1：
验证本发明所述隐形眼镜清洗设备对蛋白质的清除效果：
使用本发明所述隐形眼镜清洗设备的电泳解离除蛋白功能对溶菌酶进行清除实验(以下实验内容和数据均由经过苏州生物纳米园百拓生物医药公共服务平台测试并提供)：
配制一定浓度的蛋白溶液，将0.9％Nacl溶液加入本发明所述隐形眼镜清洗器中进行电泳实验，过程中会产生次氯酸，其可以对蛋白进行降解。需要说明的是，下面描述中使用的主要设备中：3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪即为本申请的隐形眼镜清洗设备，为了便于描述，下面将隐形眼镜清洗设备称作为3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪。
主要设备：1、3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪；
2、微量紫外分光光度计：Nanodrop One/Onec。
主要试剂溶液：1、蛋白：溶菌酶，索莱宝(货号：L8120)，分子量为14KDa；
2、0.9％NaCl配制，测试浓度，取2毫升电泳30分钟，检测电泳后浓度。
电泳中产生的次氯酸根会影响A280的紫外吸收，加10％的亚硫酸钠能完全消除影响。为了使检测的蛋白在同一个背景下，在电泳蛋白时，设置一个不加蛋白的0.9％NaCl溶液最为平行对照，也电泳30分钟，加10％的亚硫酸钠，用此溶液进行背景扣除。
实验结果：蛋白浓度均测试3次，进行平均后作为最终浓度。
电泳前3次分别为：657.4μg/mL；651.2μg/mL；649.8μg/mL；平均浓度为652.8μg/mL；30分钟电泳后，取1毫升溶液，加1毫升20％的亚硫酸钠，测得平均浓度为99.9μg/mL；96.1μg/mL；98.9μg/mL，平均为 98.3μg/mL；因为此浓度为亚硫酸钠对倍稀释后的浓度，所以最终浓度要乘以2，为196.6μg/mL。
蛋白降解率：(原始浓度-剩余浓度)/原浓度 x100％＝(652.8μg/mL-196.6μg/mL)/652.8μg/mL＝70％。
30分钟电泳解后取清洗仓内15微升上样，蛋白上样量为9μg，通过SDS-PAGE(生物电泳跑胶)未检测到溶菌酶，蛋白被完全分解，即电泳30分钟后蛋白清除率可达100％。
因此，结合上述实验数据，可以发明本发明所述的电泳解离除蛋白方法可以对蛋白质进行全面清除，清除率可达到100％。
虽然上述检测方法确实可以验证清洗设备的去蛋白效果，但是其得到的实验数据还需要计算才得到结论，不能直接读取，在此基础上本发明提出另一种有效检测蛋白降解的方法，所述方法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法检测角膜接触镜清洗溶液中的蛋白含量，获得表征蛋白降解量的蛋白条带，其具体包括：
将被检测蛋白样本加入镜片洗护液中形成混合溶液，控制该混合溶液中被检测蛋白的理论浓度，自该混合溶液中定量取样液进行电泳解离，电泳解离完成后定量取所述样液的上样，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述上样中的蛋白上样量，获得表征蛋白降解量的蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量。
在一个进一步的实施例中，所述有效检测蛋白降解的方法包括：
提供被检测蛋白样本；
将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为3mg/mL，取3微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液进行电泳解离，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入B镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液进行电泳解离，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
进一步的，所述被检测蛋白样本为溶菌酶，所述溶菌酶的分子量为 14Kda，
进一步的，所述A镜片洗护液为0.9％NaCl溶液，
进一步的，所述B镜片洗护液为含0.9％NaCl的3N专用清洁液，
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中，溶液中被检测蛋白的理论浓度为3mg/mL，以使得被检测蛋白于0.9％NaCl溶液中浸泡跑胶，30分钟后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
进一步的，所述方法通过加入电泳缓冲液、蛋白电泳上样缓冲液、染色液、脱色液和凝胶配合所述被检测蛋白于0.9％NaCl溶液中浸泡跑胶。
在一个进一步的实施例中，所述有效检测蛋白降解的方法包括：
提供被检测蛋白样本；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入C镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
进一步的，将所述被检测蛋白样本加入D镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液，2小时后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
进一步的，所述被检测蛋白样本为溶菌酶，所述溶菌酶的分子量为 14Kda，
进一步的，所述C镜片洗护液为除蛋白组合液，
进一步的，所述D镜片洗护液为除蛋白双氧水。
在一个进一步的实施例中，将被检测蛋白样本加入镜片洗护液中形成混合溶液，控制该混合溶液中被检测蛋白的理论浓度，所述混合溶液中被检测蛋白的理论浓度大于等于0.001mg/mL。
通过本发明所述的检测蛋白降解的方法可以对隐形眼镜清洗设备的去蛋白效果进行验证，参见下述验证例。
验证例2：
验证不同护理液对蛋白的降解效果：
1、3N护理液对蛋白的降解：
在生理盐水条件下，3N护理液在电泳条件下，可以产生次氯酸，对蛋白进行降解。为了使检测结果直观可见，把人工泪液中溶菌酶的理论浓度由1.9mg/mL提高到3mg/mL。需要说明的是，下面描述中使用的隐形眼镜清洗设备中：3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪即为本申请的隐形眼镜清洗设备，为了便于描述，下面将隐形眼镜清洗设备称作为3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪。
主要设备：3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪；
电泳设备：Bio-Rad Mini；
主要试剂：
⑴、蛋白：溶菌酶，索莱宝(货号：L8120)，分子量为14KDa； 0.9％NaCl配制，3mg/mL；取3微升上样，蛋白上样量为9μg；
⑵、百拓配置的生理盐水；溶菌酶配制为0.6mg/mL，加2毫升电泳30分钟后，取15微升上样；蛋白上样量为9μg；
⑶、3N专用清洁液(0.9％NaCl溶液)，溶菌酶配制为0.6mg/mL，加2毫升电泳30分钟后，取15微升上样。蛋白上样量为9μg；
⑷、蛋白分子量标准：Thermo Fisher，货号：26619。
⑸、SDS-PAGE电泳缓冲液：上海生工，货号：C520001-0500。
⑹、SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液：上海生工：货号： C508320-0001。
⑺、SDS-PAGE染色液：上海生工，货号：C900300-0100。
⑻、SDS-PAGE脱色液：上海生工，货号：C900299-0300。
⑼、SDS-PAGE凝胶：上海生工，货号：C661102-0001。
①溶菌酶：0.9％NaCl配制，3mg/mL；取3微升上样，蛋白上样量为9μg；
②溶菌酶：0.9％NaCl配制，3mg/mL，生理盐水浸泡30分钟跑胶；蛋白上样量为9μg；
③生理盐水配制0.6mg/mL溶菌酶，加2毫升电泳30分钟后，取 15微升上样；蛋白上样量为9μg；
④3N专用清洁液(0.9％NaCl溶液)配制溶菌酶为0.6mg/mL，加 2毫升电泳30分钟后，取15微升上样。蛋白上样量为9μg；
⑤蛋白分子量标准。
实验结果：如图1所示，为12％SDS-PAGE检测3N护理液对溶菌酶的降解情况得到的电镜图，从图中可以发现0.9％NaCl配制的溶菌酶和3N专用清洁液(0.9％NaCl溶液)均降解了蛋白，未见蛋白条带。
以上说明本发明提供的一种有效检测蛋白降解的方法：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法(SDS-PAGE)检测不同护理液对蛋白的降解，为了使检测结果直观可见，把人工泪液中溶菌酶的理论浓度由1.9mg/mL提高到 3mg/mL，所述SDS-PAGE检测方法通过控制变量法检测不同护理液对蛋白的降解情况，并通过表征蛋白降解量的蛋白条带反映检测情况，通过所述蛋白条带可直接读出蛋白含量值，实现了定量定性检测。
2、市售其它护理液对蛋白的降解：
主要试剂：A护理液：某品牌30分钟除蛋白组合液；
B护理液：某2小时除蛋白双氧水。
⑴、蛋白：溶菌酶，索莱宝(货号：L8120)，分子量为14KDa；
⑵、A护理液的样品处理：溶菌酶配制为0.6mg/mL，加2毫升浸泡30分钟后，取15微升上样；蛋白上样量为9μg；
B护理液的样品处理：溶菌酶配制为0.6mg/mL，加2毫升浸泡2小时后，取15微升上样；蛋白上样量为9μg；
⑶、蛋白分子量标准：Thermo Fisher，货号：26619。
⑷、SDS-PAGE电泳缓冲液：上海生工，货号：C520001-0500。
⑸、SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液：上海生工：货号： C508320-0001。
⑹、SDS-PAGE染色液：上海生工，货号：C900300-0100。
⑺、SDS-PAGE脱色液：上海生工，货号：C900299-0300。
⑻、SDS-PAGE凝胶：上海生工，货号：C661103-0001。
①A护理液：溶菌酶配制为0.6mg/mL，加2毫升浸泡30分钟后，取15微升上样；蛋白上样量为9μg；
②B护理液：溶菌酶配制为0.6mg/mL，加2毫升浸泡2小时后，取15微升上样；蛋白上样量为9μg；
③B护理液配制0.6mg/mL溶菌酶，取15微升立即上样；蛋白上样量为9μg；
④蛋白分子量标准。
实验结果：如图2所示，为15％SDS-PAGE检测市场商用硬性角膜接触镜除蛋白液对溶菌酶的降解情况得到的电镜图，可见，A护理液溶菌酶配制为0.6mg/mL，浸泡处理30分钟后，蛋白大多被降解，仅剩微弱的条带；B护理液浸泡处理2小时后，蛋白条带和对照相比，几乎未见降解。
综上，对比3N护理液和其他商用硬性角膜接触镜除蛋白液对溶菌酶的降解情况，可以发现护理液或者说是用于除蛋白的电解质溶液对最终蛋白的降解情况是至关重要的，且利用3N护理液除蛋白的效果相较于其他护理液的效果确实更好。
以上说明本发明可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法(SDS-PAGE)检测市售其它护理液对蛋白的降解，同样通过控制变量法检测其他护理液对蛋白的降解情况，通过对照可验证不同护理液对蛋白的降解情况不同，同样可通过表征蛋白降解量的蛋白条带反映检测情况，通过所述蛋白条带可直接读出蛋白含量值，实现了定量定性检测。
在上述验证例2的基础上可进行另一种检测蛋白清除效果的方法，进一步的证明清洗设备的去蛋白效果，该检测蛋白清除效果的方法包括：标记修饰被检测蛋白，以使得所述被检测蛋白被显示；
使标记修饰后的被检测蛋白附着于镜片上，在显示设备下观测该被检测蛋白于镜片上的附着情况，获得原始蛋白含量对照图；
通过清洗设备配合电泳解离液清洗表面附着有被检测蛋白的镜片，在显示设备下观测清洗后的被检测蛋白于镜片上的附着情况，获得剩余蛋白含量检测图；
将所述原始蛋白含量对照图与所述剩余蛋白含量检测图进行对比，得到被检测蛋白被降解的结果。
在一个进一步的实施例中，还包括设置一组对照组，具体包括：
将该表面附着有被检测蛋白的镜片浸泡于所述电泳解离液中，浸泡时间与清洗时间一致，浸泡完成后在显示设备下观测被检测蛋白于镜片上的附着情况，获得浸泡剩余蛋白含量检测图；
进一步的，将浸泡剩余蛋白含量检测图与所述剩余蛋白含量检测图进行对比，得到被检测蛋白被降解的结果。
进一步的，所述被检测蛋白包括被标记修饰的荧光蛋白，通过荧光蛋白使得所述被检测蛋白通过荧光显示。
进一步的，使标记修饰后的被检测蛋白附着于镜片上，在显示设备下观测该被检测蛋白于镜片上的附着情况，获得原始蛋白含量对照图，具体包括：
取0.5mg/mL的荧光蛋白20μL，将所述荧光蛋白置于镜片上，且使得所述荧光蛋白附着在所述镜片表面，
将表面附着有所述荧光蛋白的镜片在紫外灯下观察，镜片表面有荧光显示，获得原始蛋白含量对照图；
进一步的，通过清洗设备配合电泳解离液清洗表面附着有被检测蛋白的镜片，以降解所述被检测蛋白，具体包括：
将表面附着有所述荧光蛋白的镜片置于清洗设备的清洗槽内，并配合电泳解离液进行清洗，以降解所述荧光蛋白，所述镜片上的荧光蛋白在所述清洗槽中被电泳解离，所述荧光蛋白降解；
进一步的，在显示设备下观测清洗后的被检测蛋白于镜片上的附着情况，获得剩余蛋白含量检测图，具体包括：
在紫外灯下观测所述镜片表面，镜片表面无荧光显示，获得所述剩余蛋白含量检测图。
进一步的，将所述荧光蛋白粘附于镜片表面后于25℃避光放置48小时，使得所述荧光蛋白附着在所述镜片表面。
进一步的，所述原始蛋白含量对照图中所述镜片表面有荧光显示，
进一步的，所述剩余蛋白含量检测图中所述镜片表面无荧光显示，或有荧光显示，且该荧光显示的范围比所述原始蛋白含量对照图中的荧光范围小，
进一步的，将所述原始蛋白含量对照图与所述剩余蛋白含量检测图中的荧光范围进行对比，可见所述荧光蛋白在清洗设备配合电泳解离液的清洗下被降解。
进一步的，所述浸泡剩余蛋白含量检测图中镜片表面有荧光，
进一步的，所述剩余蛋白含量检测图中所述镜片表面无荧光显示，或有荧光显示，且该荧光显示的范围比所述浸泡剩余蛋白含量检测图中的荧光范围小，
进一步的，将所述对照组获得的浸泡剩余蛋白含量检测图与所述实验组获得的剩余蛋白含量检测图进行对比，得到所述电泳解离液在配合清洗设备电泳解离的条件下才具有降解蛋白效果的结论。
上述检测蛋白降解的方法可通过验证例3实现。
验证例3：
验证利用本发明所述隐形眼镜清洗器除蛋白后镜片上的蛋白清除情况：
为了方便观察蛋白在镜片上的残留情况，用绿色荧光蛋白对3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪的电泳清除效果进行了检测。
主要设备：
3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪；
隐形眼镜镜片：爱博诺德货号：DS200114030/DS200114028；
主要试剂：
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP，GenBank: AAA27721.1)，来源于维多利亚水母(Aequorea victoria)，大肠杆菌重组表达，全长238个氨基酸，分子量27kDa。
电泳液为上海生工的SDS-PAGE 10X Tris-Glycine电泳缓冲液，货号： C520001-0500。
样品处理：取0.5mg/mL的GFP 20μL，置于镜片上，相当于镜片上的蛋白含量为10μg。25℃避光放置48小时，使蛋白充分吸附到镜片上。然后用3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪进行电泳，时间为10分钟。
设置两组添加蛋白的镜片，即将蛋白加到镜片上，25℃吸附48小时后紫外灯下观察，镜片可见强烈绿色荧光，如图3所示，图中左右两边的镜片相同，用以之后进行对比实验。
将图3中左边的镜片用3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪配合3N护理液(电泳液)进行电泳，将图3中右边的镜片置于3N护理液中浸泡，紫外灯下比较荧光情况，得到图4，图4中的镜片与图3中的对应，左边镜片电泳10分钟后，GFP蛋白绿色荧光消失，右边镜片浸泡10分钟后，仍然有很强的荧光，因此可以说明3N角膜接触镜电泳除蛋白灭菌仪在该体系下能通过电泳清除镜片上的绿色荧光蛋白。
通过以上实验数据可以证明，本发明提供的一种有效检测泪蛋白降解的方法，可以定量定性的得到蛋白含量的数值，实验结果更加直观，可信度更高，且配合所述验证1和3可以作为检测蛋白是否完全降解的系列实验。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改和变型。
Claims (7)
1.一种有效检测泪蛋白降解的方法，其特征在于，其具体包括：
将被检测蛋白样本加入镜片洗护液中形成混合溶液，控制该混合溶液中被检测蛋白的理论浓度，自该混合溶液中定量取样液进行电泳解离，电泳解离完成后定量取所述样液的上样，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述上样中的蛋白上样量，获得表征蛋白降解量的蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量。
2.根据权利要求1所述的检测泪蛋白降解的方法，其特征在于，所述方法具体包括：
提供被检测蛋白样本；
将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为3mg/mL，取3微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液进行电泳解离，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
将所述被检测蛋白样本加入B镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液进行电泳解离，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
3.根据权利要求2所述的检测泪蛋白降解的方法，其特征在于，
所述被检测蛋白样本为溶菌酶，所述溶菌酶的分子量为14Kda，
所述A镜片洗护液为0.9％NaCl溶液，
所述B镜片洗护液为含0.9％NaCl的3N专用清洁液，
将所述被检测蛋白样本加入A镜片洗护液中，溶液中被检测蛋白的理论浓度为3mg/mL，以使得被检测蛋白于0.9％NaCl溶液中浸泡跑胶，30分钟后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
4.根据权利要求3所述的检测泪蛋白降解的方法，其特征在于，
所述方法通过加入电泳缓冲液、蛋白电泳上样缓冲液、染色液、脱色液和凝胶配合所述被检测蛋白于0.9％NaCl溶液中浸泡跑胶。
5.根据权利要求1所述的检测泪蛋白降解的方法，其特征在于，所述方法具体包括：
提供被检测蛋白样本；
将所述被检测蛋白样本加入C镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液，30分钟后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg；
将所述被检测蛋白样本加入D镜片洗护液中形成混合溶液，溶液中被检测蛋白的理论浓度为0.6mg/mL，自该溶液中取2毫升样液，2小时后取15微升上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得蛋白条带，自所述蛋白条带读取蛋白上样量为9μg。
6.根据权利要求5所述的检测泪蛋白降解的方法，其特征在于，
所述被检测蛋白样本为溶菌酶，所述溶菌酶的分子量为14Kda，
所述C镜片洗护液为除蛋白组合液，
所述D镜片洗护液为除蛋白双氧水。
7.根据权利要求1所述的检测泪蛋白降解的方法，其特征在于，
将被检测蛋白样本加入镜片洗护液中形成混合溶液，控制该混合溶液中被检测蛋白的理论浓度，所述混合溶液中被检测蛋白的理论浓度大于等于0.001mg/mL。
Priority Applications (3)
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