CN105039545A - 半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，属于分子生物技术领域。本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。

Description

半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法。

背景技术

蛋白质的数量和质量是影响小麦面粉品质的重要因素。小麦种子储藏蛋白主要由麦醇溶蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白(Glutenin)组成，麦谷蛋白又分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚(LMW-GS)，亚基间通过二硫键结合形成谷蛋白大聚合体，赋予面团独特的粘弹性和延展性[PaynePI，LawCN，MuddEE.Controlbyhomologousgroup1chromosomesofthehigh-molecular-weightsubunitsofglutenin，amajorproteinofwheatendosperm.TheorApplGenet，1980，58：113-120；WrigleyCW.Giantproteinswithflourpower.Nature，1996，381：738-739；GianibelliMC，LarroqueOR，MacRitchieF.Biochemical，genetic，molecularcharacterizationofwheatgluteninanditscomponentsubunits.CerealChem，2001，78：635-646]，可以加工成面包、面条和糕点等多种食品。遗传和生化研究表明，高分子量谷蛋白的组成和数量与小麦面包加工品质密切相关[PaynePI，LawCN，MuddEE.Controlbyhomologousgroup1chromosomesofthehigh-molecular-weightsubunitsofglutenin，amajorproteinofwheatendosperm.TheorApplGenet，1980，58：113-120；PaynePI，Geneticsofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlantPhysiol，1987，38：141-153；RadovanovicN，CloutierS，BrownD，etal.Geneticvarianceforglutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem.2002，79：843-849]。高分子麦谷蛋白基因位点Glu-1位于第1同源群染色体长臂，在A、B、D组染色体上含有相应的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1同源基因复合位点，每个Glu-1位点又包含分别编码x-和y-型高分子麦谷蛋白亚基的2个紧密连锁基因[PaynePI，LawrenceGJ.Catalogueofallelesforthecomplexloci，Glu-A1，Glu-B1andGlu-D1，hichcodeforhigh-molecular-weightsubunitsofglutenininhexaploidwheat.CerealResComm，1983，11：29-35；ShewryPR，HalfordNGandTathamAS.Thehigh-molecular-weightsubunitsofwheatglutenin.JournalofCerealScience，1992，15(2)：105-120]。Payne首先建立了小麦高分子量谷蛋白亚基(对)对面筋品质贡献的评分系统，如Ax1/Ax2*和Dx5是目前公认的面包小麦优质亚基[PaynePI，Geneticsofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlantPhysiol，1987，38：141-153]。研究表明，等位基因Glu-Blal编码的超表达Bx7亚基(Bx7OE)能显著提高面筋强度[ButowBJ，MaW，GaleKR，etal.MoleculardiscriminationofBx7allelesdemonstratesthatahighlyexpressedhigh-molecular-weightgluteninallelehasamajorimpactonwheatflourdoughstrength.TheorApplGenet，2003，107：31524-1532]，含有Bx7OE的小麦育成品种或地方品种通常都具有更好的面筋强度[VawserMJ，CornishGB.OverexpressionofHMWgluteninsubunitGlu-B17xinhexaploidwheatvarieties(Triticumaestivum).AustralJAgricRes，2004，55：577-588；LukowOM，ForsythSA，PaynePI.Over-productionofHMWgluteninsubunitscodedonchromosome1Bincommonwheat，Triticumaestivum.JGenetBreed，1992，46：187-192；RadovanovicN，CloutierS，BrownD，HumphreysDG，LukowOM.Geneticvarianceforglutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem，2002，79：843-849]。发掘和利用Bx7OE已成为进一步改良小麦品质的重要途径，目前发达国家优质小麦育种计划正加强利用这一基因。

普通小麦中的Bx7OE亚基来自南美的一个地方品种，中国小麦品种几乎不含有这一亚基。通过杂交聚合育种引入Bx7OE、Dx5等优质亚基，是快速改良我国小麦品质的有效途径。SDS-PAGE是分离和鉴定HMW-GS的传统方法，但不能有效鉴别分子量大小和迁移率十分接近的亚基[ShewryPR，HalfordNGandTathamAS.Thehigh-molecular-weightsubunitsofwheatglutenin.JournalofCerealScience，1992，15(2)：105-120]，且费工费时。近年来，随着大量的HMW-GS基因被克隆，主要等位基因的DNA分子标记也相应被建立[AhmadM.Molecularmarker-assistedselectionofHMWgluteninallelesrelatedtowheatbreadqualitybyPCR-generatedDNAmarkers.TheorApplGenet，2000，101：892-896；DeBustosA，RubioP，JouveN.MolecularcharacterisationoftheinactivealleleofthegeneGlu-A1andthedevelopmentofasetofAS-PCRmarkersforHMWgluteninsofwheat.TheorApplGenet，2000，100：1085-1094]，利用连锁分子标记鉴定亚基组成更加方便、准确、可靠。然而在我国现有育种条件下，相对表型鉴定而言，分子标记辅助选择技术因成本较高未能真正用于育种实践。与单个基因分子标记的PCR鉴定方法相比，多重PCR(multiplexPCR)技术体系含有多个基因标记引物，通过一次反应能够对多个性状基因进行鉴定，实验成本明显降低，工作效率显著提高[MoczulskiM，SalmanowiczBP(2003)MultiplexPCRidentificationofwheatHMWgluteninsubunitgenesbyallele-specificmarkers.Theor.Appl.Genet.44(4)：459-471]。

目前，小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法有多种。其中，SDS-PAGE电泳是经常采用的方法，该方法简单易学，并可以对每一样品所有亚基及其表达量进行鉴定。但该方法比较耗时，而且容易对分子量不同而迁移率相近的亚基造成误判。用于小麦研究的多重PCR技术主要涉及与品质相关的高(低)分子谷蛋白亚基基因、籽粒硬度基因和淀粉酶基因等，分子标记法是根据不同高分子量谷蛋白亚基序列的差异设计特定的引物，对小麦基因组DNA进行PCR扩增，该方法高效快捷，克服了SDS-PAGE电泳的一些缺点。然而，该方法有时不能区分杂交后代的某一基因位点是否纯合，而且如果操作不当，还会出现假阳性或假阴性。另外，由于分子标记一次只能鉴定1-2个高分子量谷蛋白亚基等位基因，虽然有的学者采用多重PCR一次鉴定多个亚基，但不是所有高分子量谷蛋白亚基都可用多重PCR进行鉴定。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，解决现有的小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法的鉴定速度慢，检测准确率低的问题，本发明提供了一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，本方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，包含如下步骤：

步骤一：小麦籽粒DNA的提取

a.切取1/3～1/2粒小麦种子，研磨，加入DNA提取缓冲液，水浴，每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，离心；

b.取上清液加入醋酸铵和乙醇，上下充分颠倒，离心；

c.弃上清液，加入乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，离心；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加双蒸水溶解DNA；

步骤二：高分子量谷蛋白亚基的PCR反应

P₁5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P₂5′-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3′；

10亚基的引物序列为：

P₃5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，P₄5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；

PCR反应体系为25μL，含1μL提取的DNA，1×Buffer，2mmol/LMgCl₂，每种dNTP各为0.8mmol/L，每种引物各为0.2μmol/L，Taq酶1.5U；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s～1min，35个循环，最后72℃再延伸5min；

步骤三：高分子量谷蛋白亚基的SDS‐PAGE电泳及检测

选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，10000rpm离心2min，弃上清液，加入300μL蛋白质提取液，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液；

高分子量谷蛋白亚基的检测：采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3％，分离胶浓度为8％，交联度为3.33％。

进一步的，所述步骤一具体为：

a.用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入1粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700μLDNA提取缓冲液，65℃水浴约30min，其间每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，13000rpm离心15min；

b.取500μL上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50μL10mol/L醋酸铵和1mL95％乙醇，上下充分颠倒，13000rpm离心10min；

c.弃上清液，加入1mL70％乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，13000rpm离心2min；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加30μL双蒸水溶解DNA。

进一步的，所述DNA提取缓冲液为：100mmol/L，Tris-HClpH8.0，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl。

进一步的，所述蛋白质提取液为：70mmol/LTris-HCl，2％(V/V)β-巯基乙醇，2％(W/V)SDS，20％(V/V)甘油，0.005％(W/V)溴酚兰。

进一步的，所述步骤二中退火后72℃条件下5亚基延伸45s，10亚基延伸1min。

进一步的，所述步骤二中：1×Buffer为10mmol/LTris-HCl，pH＝8.3，50mmol/LKCl。

本发明的有益效果在于：本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是本发明的具体实施例的PCR检测结果；

图2是本发明具体实施例高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE电泳检测结果；

图3是本发明具体实施例分离群体5亚基PCR检测结果；

图4是本发明具体实施例分离群体10亚基PCR检测结果；

图5是本发明具体实施例初选种子SDS-PAGE电泳检测结果。

具体实施方式

下文将结合附图详细描述本发明的实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

本方法所用的实验材料为中国春、宁春4号、扬麦19号以及宁春4号×扬麦19号F2分离群体种子。宁春4号(1,17+18,5+10)为我国西北春麦区的主推品种，是优质面条专用粉—雪花粉的主要原料；扬麦19号为我国长江中下游冬麦区的主推品种；中国春(Null,7+8,2+12)用作分析扬麦19号高分子量谷蛋白亚基组成的参照品种。

1、小麦籽粒DNA的提取

a.用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入1粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700μLDNA提取缓冲液(100mmol/LTris-HClpH8.0，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl)，65℃水浴约30min，其间每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，13000rpm离心15min；

b.取500μL上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50μL10mol/L醋酸铵和1mL95％乙醇，上下充分颠倒，13000rpm离心10min；

c.弃上清液，加入1mL70％乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，13000rpm离心2min；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加30μL双蒸水溶解DNA。

2、高分子量谷蛋白亚基的PCR检测

考虑到5+10亚基对食品加工品质的影响较大，本方法对其进行PCR检查。

5亚基的引物序列为：

P₁5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P₂5′-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3′；

10亚基的引物序列为：

P₃5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，P₄5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；

PCR反应体系均为25μL，其中含1μL提取的DNA，1×Buffer(10mmol/LTris-HClpH＝8.3，50mmol/LKCl)，2mmol/LMgCl₂，每种dNTP各0.8mmol/L，每种引物各0.2μmol/L，Taq酶1.5U；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s(5亚基)或1min(10亚基)，35个循环，最后72℃再延伸5min。

扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)进行电泳检测。

3、高分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE电泳

小麦籽粒提取DNA后，还剩下沉淀物。为全面了解小麦籽粒高分子量谷蛋白亚基组合，选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，10000rpm离心2min，弃上清液，加入300μL蛋白质提取液(70mmol/LTris-HCl，2％(V/V)β-巯基乙醇，2％(W/V)SDS，20％(V/V)甘油，0.005％(W/V)溴酚兰)，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液上样。同时，以用蛋白质提取液直接从中国春、宁春4号和扬麦19号的1/3～1/2粒种子提取的上清液作为对照(直接提取)。高分子量谷蛋白亚基的检测采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3％，分离胶浓度为8％，二者交联度均为3.33％，考马斯亮蓝染色。

4、宁春4号和扬麦19号5+10亚基的PCR检测结果

由图1所示，用5亚基特异性引物P1和P2进行PCR扩增，宁春4号扩增出450bp条带，而扬麦19号未扩增出该条带，说明宁春4号含有5亚基；用10亚基特异性引物P3和P4进行PCR扩增，宁春4号扩增出576bp特异性条带，而扬麦19号扩增出612bp特异性条带，说明宁春4号含有10亚基，而扬麦19号含有12亚基。同时，也说明本方法提取的小麦籽粒DNA可满足5+10亚基PCR检测的需要。

5、宁春4号和扬麦19号SDS-PAGE电泳检测结果

由图2所示，直接提取和提取DNA后再提取高分子量谷蛋白亚基，其SDS-PAGE电泳结果一致，说明小麦籽粒DNA的提取对SDS-PAGE电泳结果影响不大。同时，根据Payne等的命名标准，确定扬麦19号高分子量谷蛋白亚基组成为Null,7+9,2+12。

6、宁春4号和扬麦19号F2分离群体PCR检测结果

由图3所示，24粒种子中有15粒可扩增出明亮的450bp条带，说明约占总数3/4的种子可能含有5亚基。由图4所示，泳道2、9、11、15、19、21、22、23、24可扩增出576bp特异性条带，说明这9粒种子可能含有10亚基。考虑到约占总数3/4的种子含有5亚基，这9粒种子10亚基基因位点很可能为纯合型，即为本研究的初选种子。

7、宁春4号和扬麦19号F2分离群体初选种子SDS-PAGE电泳检测结果

为进一步了解初选种子高分子量谷蛋白亚基的组合，对其进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图5所示，泳道3含Null,7+9,5+10亚基，泳道4、5、6含1,7+9,17+18,5+10亚基，泳道7可能含1,7+9,17+18,2+10亚基，泳道8含1,7+9,17+18,5+10亚基，泳道9可能含1,7+9,17+18,2+12,5+10亚基，泳道10含1,17+18,5+10亚基，泳道11含Null,17+18,5+10亚基。

本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本权利范围的限定。

Claims (6)

1.一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，包含如下步骤：

步骤一：小麦籽粒DNA的提取

a.切取1/3～1/2粒小麦种子，研磨，加入DNA提取缓冲液，水浴，每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，离心；

b.取上清液加入醋酸铵和乙醇，上下充分颠倒，离心；

c.弃上清液，加入乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，离心；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加双蒸水溶解DNA；

步骤二：高分子量谷蛋白亚基的PCR反应

5亚基的引物序列为：

P₁5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P₂5′-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3′；

10亚基的引物序列为：

P₃5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，P₄5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；

PCR反应体系为25μL，含1μL提取的DNA，1×Buffer，2mmol/LMgCl₂，每种dNTP各为0.8mmol/L，每种引物各为0.2μmol/L，Taq酶1.5U；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s～1min，35个循环，最后72℃再延伸5min；

步骤三：高分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE电泳及检测

选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，10000rpm离心2min，弃上清液，加入300μL蛋白质提取液，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液；

高分子量谷蛋白亚基的检测：采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为8%，交联度为3.33%。

2.如权利要求1所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述步骤一具体为：

a.用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入1粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700μLDNA提取缓冲液，65℃水浴约30min，其间每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，13000rpm离心15min；

b.取500μL上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50μL10mol/L醋酸铵和1mL95%乙醇，上下充分颠倒，13000rpm离心10min；

c.弃上清液，加入1mL70%乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，13000rpm离心2min；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加30μL双蒸水溶解DNA。

3.如权利要求2所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述DNA提取缓冲液为：100mmol/LTris-HClpH8.0，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl。

4.如权利要求3所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述蛋白质提取液为：70mmol/LTris-HCl，2%(V/V)β-巯基乙醇，2%(W/V)SDS，20%(V/V)甘油，0.005%(W/V)溴酚兰。

5.如权利要求4所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述步骤二中退火后，72℃条件下，5亚基延伸45s，10亚基延伸1min。

6.如权利要求4所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述步骤二中：1×Buffer为10mmol/LTris-HCl，pH=8.3，50mmol/LKCl。