CN105112557B - 快速鉴定兰属植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种快速鉴定兰属植物的方法，属于植物鉴定技术领域，其特征在于通过植物基因组DNA的CTAB法提取兰属植物基因组DNA，通过兰属植物的随机引物BS‑5的RAPD扩增反应，以及SCAR标记引物的PCR扩增反应，通过电泳检测观测扩增后的PCR产物条带，兰属植物样品都具有约1070bp的特异性条带。兰属植物快速鉴定方法可用于快速检测大量品种，对兰花品种的整理、分类研究、澄清品种、种子资源的保护、分子鉴定以及推动兰花品种国际登录体系的建立等都有积极作用。

Description

快速鉴定兰属植物的方法
技术领域
本发明具体涉及一种快速鉴定兰属植物的方法，属于植物鉴定技术领域。
背景技术
20世纪末，兰花业发展迅速。栽培群体迅速扩大，新品种层出不穷。品种分类方面仍以传统瓣型分类为主，现代新兴技术和手段也有所尝试。运用数量分类方法对中兰花品种分类的研究，R分析初步得出了兰花花种级分类的特征性状和品种分类特征性状，Q分析得出了兰花花种级分类界线和类型分级界线。这是兰花品种分类运用现代技术取得的最大成果，也对经典形态分类提供了有力的佐证。国际上，有关兰花品种分类的工作非常少，仅限于日本和韩国方面。其现有兰花品种中有多数均为中国原有品种；品种分类也是对中国传统瓣型分类的延续。同时，随80年代后中国南方多省对兰花叶艺观赏的兴起，日本、韩兰花花界人士对兰花叶艺类别的说明多见，但作为非主流分类方法，并未有相关系统分类出现。目前，尚无系统全面的对莲瓣兰品种分类研究的相关报道。
自二十世纪90年代以来，植物分子系统学蓬勃发展，其理论和方法已日益成熟和完善，相对于形态性状，特别是数量性状，分子标记和DNA测序有许多无可比拟的优点。生物大分子本身就是遗传进化信息的载体和进化历史的累积，信息量大，其变异一般不易受环境影响而相对稳定，趋同效应弱，所提供的系统进化信息更接近客观自然，所揭示系统发育关系也更具客观性和可比性。基于基因和DNA片段变异或者序列碱基变异位点检测值为基因组的遗传变异，并根据所提供的信息进行系统发育分析已成为目前植物系统学研究的主要手段，广泛地应用于植物系统的各级分类单元上，并取得了重要的研究成果。
SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定植物不同品种的新方法。SCAR标记是以品种的特异序列为基础，通过对特异序列设计引物，其PCR 结果是一种显性标记，在电泳图谱上一般表现为特异片断的有无。SCAR标记应用于品种鉴别时仅需从标准样品中选择阳性和阴性两个品种作为对照即可。
发明内容
本发明目的在于提供一种通过SCAR标记，得到兰属植物DNA特异条带，用以快速鉴定兰属植物的方法。
一种快速鉴定兰属植物的方法，其特征在于通过植物基因组DNA的CTAB法提取兰属植物基因组DNA，通过兰属植物的随机引物BS-5的RAPD扩增反应，以及SCAR标记引物的PCR扩增反应，通过电泳检测观测扩增后的PCR产物条带，兰属植物样品都具有约1070bp的特异性条带。
所述的随机引物BS-5的RAPD扩增反应引物序列为：
BS-5：5'-TGCGCCCTTC-3'。
所述的SCAR标记引物的PCR扩增反应引物序列为：
SF: 5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3'
SW: 5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3'。
本发明快速鉴定兰属植物的方法，具体通过下列步骤实现：
一.提取兰属植物基因组DNA
1）提取DNA所用的提取液，吸头，离心管等需要在高压灭菌锅中121℃(约1.1㎏/cm）高压灭菌20min；
2）取50㎎新鲜的叶片用液氮研磨，磨碎后置于1.5ml离心管中，加入预热的600μL2×CTAB缓冲液（100mMTris-Hcl, pH=8.0；20mM EDTA, PH=8.0；1.4M NaCl；2%CTAB；2%β-巯基乙醇；5%PVP）；
3）65℃温浴1h，每隔10min轻缓颠倒离心管，使其混匀；
4）12,000rpm/min离心10min，上清液转入另一干净离心管中；
5）分别用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），氯仿：异戊醇（24:1）各抽提一次。12,000rpm/min离心10min；
6）上清液转管，加入等体积的冷的异丙醇，-20℃沉淀2h；
7）12,000 rpm/min离心10min，弃上清液；
8）沉淀分别用70%乙醇，无水乙醇各洗涤一次；
9）将沉淀置于超净工作台上吹干，加入50μL 1 x TE（10mM Tris-Hcl, pH=8.0；
1mM EDTA）溶解，放在-20℃备用。
二．SCAR标记的兰属特异片段的扩增
1） 随机引物BS-5的RAPD扩增反应
引物序列：
BS-5：5'-TGCGCCCTTC-3'
PCR反应体系25μL：
DNA模板 1.0μL
TaqDNA聚合酶(5U/μL，Takara) 0.25μL
2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL
10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5μL
BS5 (10mM/μL) 1.5μL
ddH2O 17.75μL
总体积 25μL
PCR的扩增程序：
预变性 94℃ 4min
变性 94℃ 40s
退火 37℃ 40s
延伸 72℃ 1min（变性、退火、延伸包括35个循环）
延伸 72℃ 10min
保存 16℃。
2）随机引物BS-5扩增产物的电泳检测
取10μL的PCR产物和5μL Trans 2K Plus DNA Marker分别与2μL的6×上样缓冲液（25μL/L花青素）混合均匀后上样，在1×TAE缓冲液体系中，经1.5%琼脂糖凝胶，100V电泳1h；然后将胶放入IQuant capture凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，观察PCR产物条带。
3）特异片段的回收
生工生物工程（上海）有限公司Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒进行特异性片段的割胶回收。
（1）用1％(w/v)琼脂糖凝胶，于新配制的TAE缓冲液中电泳分离PCR扩增产物；
（2）紫外灯下切下目的DNA片段，应尽量减少DNA暴露在短波紫外灯的时间以降低对DNA的损伤；
（3）将切割的含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶收集于1.5ml的离心管中，称重，并按照1g/1ml的比例换算出胶的体积；
（4）向离心管中加入Binding BufferⅡ,加入的量为胶体积的3-4倍；
（5）将离心管置于55℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
（6）将溶化好的溶液全部移入吸附柱，室温放置2min,8,000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
（7）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，室温放置2min，10,000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，重复该过程一次；
（8）将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000离心2min，除去吸附柱上残留的乙醇；
（9）将离心后的吸附柱自然晾干10min，使乙醇挥发完全；
（10）将吸附柱置于一新1.5ml离心管中，加入30-50μL Elution Buffer，室温静置1-2min，12,000离心1min；
（11）所提DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳，取1μL DNA和30ng未经酶解的λDNA 标准分别与2μL的6×上样缓冲液(25μL/L花青素)混匀后上样，在1×TAE缓冲液体系中，120V电泳1h；然后将胶放入IQuant capture凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，比较样品DNA条带与λDNA标准条带的亮度和宽度即可对样品DNA含量进行估计；
4）PCR产物的连接
将PCR产物连接到pMD18-T载体上（购自上海生工生物工程有限公司）
反应体系10μL：
pMD18-T vecter 0.5μL
Soloution I 1μL
纯化后的PCR产物 5μL
ddH2O 3.5μL
16℃连接过夜。
5）大肠杆菌感受态细胞的制备
采用CaCl2法，制备感受态细胞的大肠杆菌宿主菌株为DH5α。方法如下：
（1）挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于50mL的 LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
（2）取该菌液以1:100接种于10mL新鲜LB培养液中，37℃剧烈振荡培养至OD600=0.4～0.6（或菌液成轻微云雾状）；
（3）将菌液移到灭菌的1.5mL的离心管中，1mL/管，8000rpm，离心5min，弃上清液；
（4）加入预冷的0.1M CaCl2 500μL / 管，洗 涤2次 ，悬 浮，12000 rpm，离心5min，弃上 清液 ；
（5）加入预冷的0.1M CaCl2 100μL，悬浮，30min后使用。
6）转化
（1）取10μl的连接产物加入到装有100μl感受态细胞的离心管中，轻轻转动以混匀内容物，冰浴30min；
（2）将离心管放入42℃的水浴锅中热激90秒，快速转至冰浴中10min；
（3）加入500μl LB液体培养基，于37℃，170rpm震荡培养1h；
（4）取100mL涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯固体培养基（北京奥博星生物技术有限公司）上，于室温下至涂布的菌液被培养基吸干，倒置培养皿，于37℃培养18～24h；
（5）挑取白斑。
7）重组克隆的PCR鉴定
挑取PCR阳性菌落分别接种于含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃下剧烈震荡培养过夜，利用引物 P1、P2对重组克隆进行菌液PCR检测。
PCR反应体系10μL：
菌液 1.0μL
5U/μL TaqDNA聚合酶 0.15μL
2.5mM dNTP 1.0μL
10 ×PCR Buffer 1.0μL
P1 1.0μL
P2 1.0μL
ddH2O 4.85μL
总体积 10μL
PCR的扩增程序：
预变性 94℃ 4min
变性 94℃ 40s
退火 58℃ 40s
延伸 72℃ 1min（变性、退火、延伸包括30个循环）
延伸 72℃ 10min
保存 16℃
8）克隆后目的片段的测序
克隆得到的特异片段经电泳检测确定为目的片段后，上海生物工程有限公司完成测序。
9) SCAR标记引物的设计
根据测序结果的两端序列结合BS-5引物序列，在遵循引物设计原则的前提下，利用Primer 5软件设计引物。退火温度（Tm）约为60℃，以确保其可靠性。引物设计的主要原则为：
(1）引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
(2）引物长度一般在15～25碱基之间。
(3）G+C含量在40%～60%之间。
(4）引物自身最好不要有连续4个碱基的互补。
(5）引物之间不能有连续4个碱基的互补。
10）SCAR标记引物的PCR扩增反应
（1）引物序列：
SF: 5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3'
SW: 5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3'
PCR反应体系25μL：
DNA模板 1.0μL
TaqDNA聚合酶(5U/μL，Takara) 0.25μL
2.5 mmol/L dNTPs 1.5μL
10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5μL
SF(10mM/μL) 1.0μL
SW(10mM/μL) 1.0μL
ddH2O 17.75μL
总体积 25μL
PCR的扩增程序：
预变性 94℃ 4min
变性 94℃ 40s
退火 55℃ 40s
延伸 72℃ 1min（变性、退火、延伸包括35个循环）
延伸 72℃ 10min
保存 16℃。
（2）扩增产物的电泳检测
取5μL的PCR产物和5μL Trans 2K Plus DNA Marker分别与2μL的6×上样缓冲液（25μL/L花青素）混合均匀后上样，在1×TAE缓冲液体系中，经1%琼脂糖凝胶，120V电泳1h；然后将胶放入凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，观察PCR产物条带；
（3）特异片段的回收
方法同上。
（4）PCR产物的连接
方法同上。
（5）大肠杆菌感受态细胞的制备
方法同上。
（6）转化
方法同上。
（7）重组克隆的PCR鉴定
方法同上。
（8）克隆后目的片段的测序
克隆得到的片段经电泳检测确定为目的片段，序列用软件BioEdit的CLUSTAL W程序进行对位排列后，再进行手工校正。在软件MEGA 4.0中，用Neighbor-joining method方法构建SCAR系统树。Bootstrap分析(自展分析)重复1000次。在所有的分析中，序列比对形成的空位（gaps）作缺失处理。
三．鉴定兰属植物方法
1 ）随机引物BS-5的RAPD扩增结果
经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可得到所有兰属样品都具有约为1070bp 的特异性条带，非兰属样品不具有此特异性条带。
2 ）SCAR标记引物的PCR扩增结果
SCAR标记的引物PCR扩增结果可得到兰属样本中能够清晰地扩增出约为1070bp的特异性条带。
兰属植物快速鉴定方法可用于快速检测大量品种，对兰花品种的整理、分类研究、澄清品种、种子资源的保护、分子鉴定以及推动兰花品种国际登录体系的建立等都有积极作用。
附图说明
图1和图7为BS-5引物的扩增结果图；
图2和图8为SCAR标记的引物PCR扩增结果图；
图3和图9为重组克隆的PCR扩增结果图；
图4、图5为兰属植物系统进化树状图；
图6为不同样本基因序列的对比图。
具体实施方式
实施例1：
1试验材料
供试的31个样品均为云南省野生兰花,所有材料被引种栽培于云南农业大学园林园艺学院花卉所温室兰花圃中，选取了包括:石斛兰属、兜兰属、蝴蝶兰属、文心兰属等在内的非兰属样本9个，兰属样本22个，共31个样本作为供试样本(见表1)。
表1 花名称及采集地点
。
2 试验方法
2.1兰花基因组DNA 提取
DNA提取方法根据植物基因组DNA的CTAB法。
1）提取DAN所用的提取液，吸头，离心管等需要在高压灭菌锅中121℃(约1.1㎏/cm）高压灭菌20min。
2）取50㎎新鲜的叶片用液氮研磨，磨碎后置于1.5ml离心管中，加入预热的
600μL 2×CTAB缓冲液（100mMTris-Hcl, pH=8.0；20mM EDTA, PH=8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；2%β-巯基乙醇；5%PVP）。
3）65℃温浴1h。每隔10min轻缓颠倒离心管，使其混匀。
4）12,000rpm/min离心10min，上清液转入另一干净离心管中。
5）分别用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），氯仿：异戊醇（24:1）各抽
提一次。12,000rpm/min离心10min。
6）上清液转管，加入等体积的冷的异丙醇，-20℃沉淀2h。
7）12,000 rpm/min离心10min，弃上清液。
8）沉淀分别用70%乙醇，无水乙醇各洗涤一次。
9）将沉淀置于超净工作台上吹干，加入50μL 1 x TE（10mM Tris-Hcl, pH=8.0；
1mM EDTA）溶解，放在-20℃备用。
2.2 SCAR标记的兰属特异片段的扩增
2.2.1 随机引物BS-5的RAPD扩增反应
1）引物序列：
BS-5：5'-TGCGCCCTTC-3'
2）PCR反应体系25μL：
DNA模板 1.0μL
TaqDNA聚合酶(5U/μL，Takara) 0.25μL
2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL
10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5μL
BS5 (10mM/μL) 1.5μL
ddH2O 17.75μL
总体积 25μL
3）PCR的扩增程序：
预变性 94℃ 4min
变性 94℃ 40s
退火 37℃ 40s
延伸 72℃ 1min（变性、退火、延伸包括35个循环）
延伸 72℃ 10min
保存 16℃。
2.2.2 随机引物BS-5扩增结果的电泳检测
取10μL的PCR产物和5μL Trans 2K Plus DNA Marker分别与2μL的6×上样缓冲液（25μL/L花青素）混合均匀后上样，在1×TAE缓冲液体系中，经1.5%琼脂糖凝胶，100V电泳1h；然后将胶放入IQuant capture凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，观察PCR产物条带。
2.2.3特异片段的回收
生工生物工程（上海）有限公司Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒进行特异性片段的割胶回收。
1）用1％(w/v)琼脂糖凝胶，于新配制的TAE缓冲液中电泳分离PCR扩增产物；
2）紫外灯下切下目的DNA片段，应尽量减少DNA暴露在短波紫外灯的时间以降低对DNA的损伤；
3）将切割的含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶收集于1.5ml的离心管中，称重，并按照1g/1ml的比例换算出胶的体积；
4）向离心管中加入Binding BufferⅡ,加入的量为胶体积的3-4倍；
5）将离心管置于55℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
6）将溶化好的溶液全部移入吸附柱，室温放置2min,8,000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
7）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，室温放置2min，10,000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，重复该过程一次；
8）将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000离心2min，除去吸附柱上残留的乙醇；
9）将离心后的吸附柱自然晾干10min，使乙醇挥发完全；
10）将吸附柱置于一新1.5ml离心管中，加入30-50μL Elution Buffer，室温静置1-2min，12,000离心1min；
11）所提DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳，取1μL DNA和30ng未经酶解的λDNA 标准分别与2μL的6×上样缓冲液(25μL/L花青素)混匀后上样，在1×TAE缓冲液体系中，120V电泳1h；然后将胶放入IQuant capture凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，比较样品DNA条带与λDNA标准条带的亮度和宽度即可对样品DNA含量进行估计。
2.2.4 PCR产物的连接
将PCR产物连接到pMD18-T载体上（购自上海生工生物工程有限公司）
反应体系10μL：
pMD18-T vecter 0.5μL
Soloution I 1μL
纯化后的PCR产物 5μL
ddH2O 3.5μL
16℃连接过夜。
2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备
采用CaCl2法，制备感受态细胞的大肠杆菌宿主菌株为DH5α。方法如下：
1）挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于50mL的 LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
2）取该菌液以1:100接种于10mL新鲜LB培养液中，37℃剧烈振荡培养至OD600=0.4～0.6（或菌液成轻微云雾状）；
3）将菌液移到灭菌的1.5mL的离心管中，1mL/管，8000rpm，离心5min，弃上清液；
4）加入预冷的0.1M CaCl2 500μL / 管，洗 涤2次 ，悬 浮，12000 rpm，离心5min，弃上 清液 ；
5）加入预冷的0.1M CaCl2 100μL，悬浮，30min后使用。
2.2.6 转化
1）取10μl的连接产物加入到装有100μl感受态细胞的离心管中，轻轻转动以混匀内容物，冰浴30min；
2）将离心管放入42℃的水浴锅中热激90秒，快速转至冰浴中10min；
3）加入500μl LB液体培养基，于37℃，170rpm震荡培养1h；
4）取100mL涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯固体培养基（北京奥博星生物技术有限公司）上，于室温下至涂布的菌液被培养基吸干，倒置培养皿，于37℃培养18～24h；
5）挑取白斑。
2.2.7重组克隆的PCR鉴定
挑取PCR阳性菌落分别接种于含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃下剧烈震荡培养过夜，利用引物 P1、P2对重组克隆进行菌液PCR检测。
PCR反应体系10μL：
菌液 1.0μL
5U/μL TaqDNA聚合酶 0.15μL
2.5mM dNTP 1.0μL
10 ×PCR Buffer 1.0μL
P1 1.0μL
P2 1.0μL
ddH2O 4.85μL
总体积 10μL
PCR的扩增程序：
预变性 94℃ 4min
变性 94℃ 40s
退火 58℃ 40s
延伸 72℃ 1min （变性、退火、延伸包括30个循环）
延伸 72℃ 10min
保存 16℃
2.2.8克隆后目的片段的测序
克隆得到的特异片段经电泳检测确定为目的片段后，上海生物工程有限公司完成测序。
2.2.9 SCAR标记引物的设计
根据测序结果的两端序列结合BS-5引物序列，在遵循引物设计原则的前提下，利用Primer 5软件设计引物。退火温度（Tm）约为60℃，以确保其可靠性。引物设计的主要原则为：
1）引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2）引物长度一般在15～25碱基之间。
3）G+C含量在40%～60%之间。
4）引物自身最好不要有连续4个碱基的互补。
5）引物之间不能有连续4个碱基的互补。
2.2.10 SCAR标记引物的PCR扩增反应
1）引物序列：
SF: 5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3'
SW: 5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3'
2）PCR反应体系25μL：
DNA模板 1.0μL
TaqDNA聚合酶(5U/μL，Takara) 0.25μL
2.5 mmol/L dNTPs 1.5μL
10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5μL
SF(10mM/μL) 1.0μL
SW(10mM/μL) 1.0μL
ddH2O 17.75μL
总体积 25μL
3）PCR的扩增程序：
预变性 94℃ 4min
变性 94℃ 40s
退火 55℃ 40s
延伸 72℃ 1min（变性、退火、延伸包括30个循环）
延伸 72℃ 10min
保存 16℃
2.2.11扩增产物的电泳检测
取5μL的PCR产物和5μL Trans 2K Plus DNA Marker分别与2μL的6×上样缓冲液（25μL/L花青素）混合均匀后上样，在1×TAE缓冲液体系中，经1%琼脂糖凝胶，120V电泳1h；然后将胶放入IQuant capture凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，观察PCR产物条带。
2.2.12 特异片段的回收
方法同上。
2.2.13 PCR产物的连接
方法同上。
2.2.14 大肠杆菌感受态细胞的制备
方法同上。
2.2.15 转化
方法同上。
2.2.16重组克隆的PCR鉴定
方法同上。
2.2.17 克隆后目的片段的测序
克隆得到的片段经电泳检测确定为目的片段后，菌液送上海生物工程有限公司完成测序。
2.2.18 序列同源性分析
用统计软件DNAMAN分析，得到各样品的序列比对图和同源关系树状图
3 结果与分析
3.1 BS-5引物的RAPD扩增结果
引物BS-5的琼脂糖电泳检测的结果如图（图1）所示：图片中2～23泳道的为兰属样品,24-31泳道为非兰属样品,可以看出在非兰属的样品不具有约为1070bp的特异性条带。
3.2 克隆后特异片段的测序
依图4的扩增条带，选择101号样品1100bp左右的片段回收、克隆、测序。最终样品101测序结果如下：
TGCGCCCTTCCATCACCTTCAGCATCGAAGATCTTAACTTTCGATATGAAAGAATACCTCAAAAAGCTTCCCCTGTAGAAGATTTACTCTCAATAACATTATCAGATGATCAACCATTACGAACAGTGCAAGTGGGATCTTTACTCTCAGAAGAACAAAGGGAAAAATATACAGATTTCTTGTGCAGAAATCAAGACATATTTGCTTGGAGTCCAGCAGATATGCCGGGGGTCGACCCCAATGTAATCATGCACTCCCTCAAGATTAATCCAACGTTCAAACCAATCATCCAAAAGAAGCGGAGTTTTGCGCCTGATCGTCTTCAGGCTATTGAACAAGAAGTTAACAAGCTCATAGAAGCGGGATTCATACGAGAAGTGCATTACCCAACGTGGCTAGCAAATGTTGTCATGGTTAAAAAGACAAATGGAACATGGAGGATGTGTGTTGATTACACTGACCTTAATAAGGCCTGCCCAAAGGATAGTTTTCCTCTTCCTCGAATCGATCAATTGGTGGACTCTACGTCCGGACATCAAATGCTTAGTTTTTTGGATGCTTATTCTGGTTACAATCAAATAAAGATGAACCCAACGGATGAAGAGGCTACAGCGTTTCAAACATATAAAGGTTTATATTGTTACCAAGTCATGCTATTTGGATTAAAAAATGCTGGTGCTACTTATCAACGCCTCATGAATAAGGTTTTTAAAGACCTACTAGGCCACACAATGGAGGTGTATGTGGATGACATGTTAGTAAAAAGCTTAGAAAAGTCACAACATATTTCAGACTTAGAAGCATGCTTTGACCTCCTTCGACGCTATAACATACGACTTAACCCAACCAAGTGTGCTTTTGGGGTTGCGTCTGGAAAATTTCTTGGATTTATGGTAACTCACCGTGGGATAGAGGCTAACCCTGAAAAAATCAAAGCTCTCCAAGATATGATTCCTCCGTAGAATATCAAAGACGTTCAACGTTTGAATGGTCGAATTGCTGCATTATCCCGTTTCCTAGCCCGTTCTGGGGACAAATACTTGCCATTCTTTAAAATATTGAAGGGCGCA
3.3 SCAR标记引物的设计
用于SCAR标记的引物序列为：
SF:TGCGCCCTTCCATCACCTT
SW:TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA
3.4 SCAR标记引物的PCR扩增结果
SCAR标记得引物PCR扩增结果如图（图2）所示，2～5泳道，7～12泳道，18～23泳道均为兰属样本，5，13～17，24～25泳道均为非兰属样本，可以看出在非兰属的样品不具有约为1070bp的特异性条带。
3.5 PCR产物克隆后质粒检测结果
PCR产物克隆后质粒检测结果如图（图3），1，4，9，13，16泳道均为蓝斑质粒，2，3，6～8，11，12，14，15泳道均为白斑质粒，5，10泳道为空。
SCAR标记序列同源性分析
如图4可以得出：所选的样品序列同源率是在42%～98%之间，其中兔耳兰（样品40）和墨兰（101）最高，达98%，莎草兰（200）和大雪兰（7）为95%，但与其他样品的同源率只有42%。除莎草兰（200）和大雪兰（7）以外，所有的样品的同源率为92%～98%。没有任何两个样品的序列是相同的，但因部分样品间的序列差异较少，导致未能将所有样品区分开来。
标记序列系统进化分析
系统进化树状图（图5）可以看出：从整个群体上看，兰属植物在其染色体上SCAR标记处，碱基变异程度较大，明显地分为两个分支， 其中一支（As支）由莎草兰（200）和大雪兰（7）组成；另一支（Bs支）由其他样品组成。Bs支又以微弱的区别分为两支。
SCAR标记的引物PCR扩增结果可得到兰属样本中能够清晰地扩增出约为1070bp的特异性条带，不同样本基因序列见图6。
实施例2：
1试验材料
供试的37个样品均为云南省野生兰花,其中14个样品为建兰亚属种类，5个样品为兰亚属种类，11个样品为大花亚属种类，7个样品为兰科非兰属种类(具体实验材料见图、表编号)。所有材料被引种栽培于云南农业大学园林园艺学院花卉所温室兰花圃中。样品的中文学名和拉丁学名参照陈心启 (1999) 在«中国植物志»和陈心启等（2003）在《植物分类学报》“兰属中若干分类群的订正”中的命名，见表2。
表2 兰属(Cymbidium)种及部分兰科其它属采集资源统计表
编号 名 称 学 名 状态 产地 采集地
1 纹瓣兰 C .aloifolium 有 海南 海南
2 硬叶兰 C. bicolor 有 思茅 云南思茅
3 冬凤兰 C. dayanum 有 勐海、海南 云南勐海
4 多花兰（蜜蜂兰) C. floribundumm 有 龙陵 云南龙陵
5 果香兰 C. suavissimum 有 云南西部 云南保山
6 沉香虎头兰 C. tracyanum 有 新坪 云南新坪
7 黄蝉兰 C. iridioides 有 马关 云南马关
8 长叶兰 C. erythraeum 有 马关 云南马关
9 虎头兰 C. hookerianum 有 保山 云南保山
10 滇南虎头兰 C. wilsonii 有 蒙自、建水等 云南保山
11 碧玉兰 C. lowianum 有 保山 云南保山
12 美花兰 C. insigne 有 海南 海 南
13 文山红柱兰 C. wenshanense 有 文山 云南文山
14 独占春 C. eburneum 有 保山 云南保山
15 大雪兰 C. mastersii 有 保山 云南保山
16 莎草兰 C. elegans 有 文山 云南文山
17 垂花兰 C. cochleare 有 台湾高雄 云南保山
18 斑舌兰 C. tigrinum 有 云南西部 云南保山
19 建 兰 C. ensifolium 有 浙江、云南 浙 江
19-1 朱砂兰 C. ensifolium var.zhu sha lan 有 保山 云南保山
20 墨 兰 C. sinense 有 普洱 云南普洱
21 落叶兰 C. defoliatum 有 盈江、腾冲 云南保山
22 珍珠矮 C. nanulum 有 普洱 云南普洱
23 寒 兰 C. kanran 有 新坪 云南玉溪
24 莎叶兰 C. cyperifolium 有 文山 云南文山
25 蕙 兰 C. faberi 有 昆明 云南昆明
25-1 送春（春绿兰） C. faberi var.szechuanicum 有 景东 云南景东
26 春 兰(朵香) C. goeringii 有 昆明 云南昆明
26-1 线叶春兰(豆瓣兰) C. goeringii var.serratum 有 昆明 云南昆明
26-2 春剑 C .goeringii.var.longibracteatum 有 昆明 云南昆明
26-3 通海剑兰 C .goeringii var. tonghaienie 有 通海 云南通海
27 莲瓣兰 C. lianpan 有 大理 云南大理
27-1 大雪素 C .lianpan cv.‘Da　xue su’ 有 大理 云南大理
27-2 小雪素 C. lianpan cv. ‘ Xiao　xue su’ 有 大理 云南大理
28 邱北东蕙兰 C. qiubeiense 有 邱北 云南邱北
29 兔耳兰 C. lancifolium 有 普洱 云南普洱
30 大根兰 C. macrorhizon 有 云南 云南怒江
贡山凤兰 C. gonashanense 无 贡山 ？
31 球花石斛 Dendrobium thyrsiflorum 有 云南新坪
35 杏黄兜兰 Paphiopedilum armeniacum 有 云南 云南怒江
36 紫纹兜兰 Paphiopedilum purpuratum 有 云南 云南文山
39 虾脊兰 Calanthe 有 云南 云南普洱
73 鹤顶兰 Phaius 有 云南 云南孟海
120 硬叶兜兰 Paphiopedi1um micranthum 有 云南 云南文山
125 紫毛兜兰 Paphiopedilum villosum 有 云南南部 云南文山
2 试验方法
实验方法与实施例1相同。
3 结果与分析
1随机引物BS-5的RAPD扩增结果
经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图（图7）所示：图中1～30泳道为兰属样品，31～37泳道为非兰属样品，可以看出所有兰属样品都具有约为1070bp 的特异性条带，非兰属样品不具有此特异性条带。
2 SCAR标记引物的PCR扩增结果
SCAR标记的引物PCR扩增结果如图（图8）所示，兰属样本中能够清晰地扩增出约为1070bp的特异性条带。
3 重组克隆的PCR鉴定结果
重组克隆的菌液PCR扩增结果如图（图9）所示，6，11，16号泳道所对应的样品为假阳性克隆，其他样品均为阳性克隆。
4 SCAR标记序列系统进化分析
通过邻接法分析产生的兰属植物系统进化树表明：从整个群体上看，所有样本明显的聚为3支，第一支由春剑、珍珠矮、送春、建兰、莎叶兰、大根兰、兔耳兰、蕙兰、墨兰、莲瓣兰、春兰、寒兰、邱北东蕙兰、落叶兰和文山红柱兰组成；第二支由多花兰、果香兰、纹瓣兰和硬叶兰组成；第三支由冬凤兰、碧玉兰、垂花兰、莎草兰、美花兰、长叶兰、滇南虎头兰、大雪兰、独占春、斑舌兰和黄蝉兰组成。
以上结果表明建立的特异SCAR标记技术，可区分出兰属不同品种（系）。

Claims (1)

1.一种快速鉴定兰属植物的方法，其特征在于通过植物基因组DNA的CTAB法提取兰属植物基因组DNA，通过兰属植物的随机引物BS-5的RAPD扩增反应，以及SCAR标记引物的PCR扩增反应，通过电泳检测观测扩增后的PCR产物条带，兰属植物样品都具有约1070bp的特异性条带；所述的随机引物BS-5的RAPD扩增反应引物序列为：
BS-5：5'-TGCGCCCTTC-3'
所述的SCAR标记引物的PCR扩增反应引物序列为：
SF: 5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3'
SW: 5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3'。
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