CN112029894B - 蝶叶侧柏ssr标记的指纹图谱及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蝶叶侧柏SSR标记的指纹图谱及其构建方法与应用。本发明提供了成套引物，其由引物对1至引物对8组成；所述引物对1至引物对8的核苷酸序列分别为序列表中序列1至序列16。本发明基于侧柏转录组测序开发出适合侧柏的SSR标记，并建立了‘蝶叶侧柏’SSR标记指纹图谱的构建方法与应用，该技术与形态学检测相比，鉴定结果不受气候、环境、人为因素和树龄大小的影响，可有效在苗期进行鉴定区分，鉴定时间短、鉴定准确率高，检测效率高、稳定性好，对‘蝶叶侧柏’及其他侧柏种质遗传特异性鉴定具有重要意义和良好的应用效果。

Description

蝶叶侧柏SSR标记的指纹图谱及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于侧柏的种质资源检测领域，具体涉及一种蝶叶侧柏SSR标记的指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术
侧柏(Platycladus orientalis(L.)Franco)为柏科侧柏亚科侧柏属常绿乔木，是我国特有树种。侧柏属于广分布树种，在全国大部分地区均有分布，是良好的造林绿化树种，具有保持水土、防风固沙、园林绿化等作用。而且侧柏寿命长，抗寒抗旱，其种子极具有药用价值，也是鸟类的食源之一，因此也是主要的乡土树种、长寿树种、抗逆树种、食源树种，具有重要的生态、经济、社会效益。侧柏早在1987年就与国槐一同被确定为北京市市树。
我国侧柏种质资源非常丰富，以侧柏天然分布区为区划范围，共划分为4个种子区7个种子亚区(GB 8822.11-88，中国林木种子区侧柏种子区)，分布范围包括内蒙古南部、吉林、辽宁、河北、山西、山东、江苏、浙江、福建、安徽、江西、河南、陕西、甘肃、四川、云南、贵州、湖北、湖南、广东北部及广西北部等省区，西藏部分地区有分布(中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志2004：322-323)。然而，由于侧柏苗期表型差异较小，区分难度较大，仅仅依靠表型难以做出准确的鉴定，迫切需要构建一种不受环境和表型影响的技术与方法准确的对不同侧柏种质资源(包括新品种、遗传材料等)进行有效分类鉴定。DNA指纹图谱具有高效、准确、经济、便捷且不受季节和环境影响等优点，成为林木种质鉴定的有效手段，主要包括SSR、RAPD、SCAR、AFLP等分子标记技术。其中SSR标记以其在真核生物基因组的分布广泛、呈共显性遗传、稳定性好、多态性高等特性，成为构建DNA指纹图谱的重要标记，已经成功应用于杨树、刺槐、银杏等林木树种的品种鉴定和指纹图谱构建(贾会霞，姬慧娟，胡建军等，杨树新品种的SSR指纹图谱构建和倍性检测，林业科学，2015,51(2)：69-79；王星星，周琦，陶园园等，48个果用银杏品种SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析，分子植物育种，2017,15(5)：1963-1970；毛秀红，郑勇奇，孙百友等，基于SSR的刺槐无性系遗传多样性分析和指纹图谱构建，林业科学，2018,53(10)：80-89)，并逐渐成为品种分类鉴定的主要技术，在种质鉴定、亲缘关系分析等方面发挥着重要的作用。目前，侧柏植物材料中也开发了一些SSR引物，并已在遗传多样性和谱系重建分析中得以应用，但利用SSR标记构建侧柏品种指纹图谱还未见报道。
‘蝶叶侧柏’是北京市林业果树科学研究院选育出的侧柏良种。树体为圆锥形，树形优美，小枝扁平，肥壮，叶色深绿。北京地区3月下旬-4月上旬芽开始萌动。树冠浓密，透光系数为0.06。枝条褐绿色，鳞状叶组成的叶片因之肥厚，形成略带扭曲的扇形，类似无数蝴蝶附着在树冠表面。由于该品种苗期与其他侧柏表型差异较小，很难通过表型特征将在进行有效区分和鉴定，因此，迫切需要建立一种可以有效区分侧柏品种资源的鉴定技术与方法，为蝶叶侧柏的品种鉴定和良种化运用提供技术支持。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种侧柏良种‘蝶叶侧柏’的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
本发明的一个目的是提供一种成套引物。
本发明提供的成套引物，其由引物对1至引物对8组成；
所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成。
上述成套引物中，所述各个引物对中一条引物荧光标记。
含有上述成套引物的PCR试剂也是本发明保护的范围；
或，含有上述成套引物的试剂盒或含有所述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。
上述PCR试剂由PCR试剂1至PCR试剂8组成；每个PCR试剂中含有一种引物对，所述引物对中引物在其所在PCR试剂中等摩尔混合。
上述试剂盒还包括记载如下判断标准的可读载体；
所述判断标准为如下：
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为蝶叶侧柏；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，，则待测侧柏不为或候选不为蝶叶侧柏；
所述条件为所述引物对1扩增产物为127bp和156bp；且所述引物对2扩增产物为233bp和241bp；且所述引物对3扩增产物为107bp和109bp；且所述引物对4扩增产物为153bp和169bp；且所述引物对5扩增产物为235bp和246bp；且所述引物对6扩增产物为104bp；且所述引物对7扩增产物为257bp和265bp；且所述引物对8扩增产物为184bp和192bp。
上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在如下1)和/或2)中的应用也是本发明保护的范围：
1)鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏；
2)区分或辅助区分蝶叶侧柏与其他非蝶叶侧柏。
上述待测植物为原株或其无性繁殖后代。
本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)用上述成套引物扩增待测侧柏的基因组DNA，得到PCR扩增产物；
2)将所述PCR扩增产物进行检测；
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为蝶叶侧柏；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，则待测侧柏不为或候选不为蝶叶侧柏；
所述条件为所述引物对1扩增产物为127bp和156bp；且所述引物对2扩增产物为233bp和241bp；且所述引物对3扩增产物为107bp和109bp；且所述引物对4扩增产物为153bp和169bp；且所述引物对5扩增产物为235bp和246bp；且所述引物对6扩增产物为104bp；且所述引物对7扩增产物为257bp和265bp；且所述引物对8扩增产物为184bp和192bp。
上述成套引物和记载如下判断标准的可读载体在制备记载蝶叶侧柏SSR标记指纹图谱的产品中的应用也是本发明保护的范围；
所述判断标准为如下：
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为蝶叶侧柏；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，则待测侧柏不为或候选不为蝶叶侧柏；
所述条件为所述引物对1扩增产物为127bp和156bp；且所述引物对2扩增产物为233bp和241bp；且所述引物对3扩增产物为107bp和109bp；且所述引物对4扩增产物为153bp和169bp；且所述引物对5扩增产物为235bp和246bp；且所述引物对6扩增产物为104bp；且所述引物对7扩增产物为257bp和265bp；且所述引物对8扩增产物为184bp和192bp。
上述成套引物和记载如下判断标准的可读载体在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
所述判断标准为如下：
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为蝶叶侧柏；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，，则待测侧柏不为或候选不为蝶叶侧柏；
所述条件为所述引物对1扩增产物为127bp和156bp；且所述引物对2扩增产物为233bp和241bp；且所述引物对3扩增产物为107bp和109bp；且所述引物对4扩增产物为153bp和169bp；且所述引物对5扩增产物为235bp和246bp；且所述引物对6扩增产物为104bp；且所述引物对7扩增产物为257bp和265bp；且所述引物对8扩增产物为184bp和192bp；
1)鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏；
2)区分或辅助区分蝶叶侧柏与其他非蝶叶侧柏；
3)制备鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏产品；
4)制备区分或辅助区分蝶叶侧柏与其他非蝶叶侧柏产品。
本发明还提供了一种记载蝶叶侧柏SSR标记指纹图谱的产品，为上述试剂盒。
本发明基于侧柏转录组测序开发出适合侧柏的SSR标记，并建立了‘蝶叶侧柏’SSR标记指纹图谱的构建方法与应用，该技术与形态学检测相比，鉴定结果不受气候、环境、人为因素和树龄大小的影响，可有效在苗期进行鉴定区分，鉴定时间短、鉴定准确率高，检测效率高、稳定性好，对‘蝶叶侧柏’及其他侧柏种质遗传特异性鉴定具有重要意义和良好的应用效果。
附图说明
图1为引物P9在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图2为引物P64在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图3为引物P74在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图4为引物P84在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图5为引物P89在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图6为引物P97在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图7为引物P133在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图8为引物P139在‘蝶叶侧柏’(DY-1#和DY-2#)中的扩增结果。
图9为引物P9在QLS-1#中的扩增结果。
图10为引物P64在QLS-1#中的扩增结果。
图11为引物P74在QLS-1#中的扩增结果。
图12为引物P84在QLS-1#中的扩增结果。
图13为引物P89在QLS-1#中的扩增结果。
图14为引物P97在QLS-1#中的扩增结果。
图15为引物P133在QLS-1#中的扩增结果。
图16为引物P139在QLS-1#中的扩增结果。
图17为8对引物对81份侧柏无性系(品种)的聚类分析结果；其中DY-1#为‘蝶叶侧柏’继代扦插苗，DY-2#为‘蝶叶侧柏’实生原株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中侧柏基因组DNA的提取方法如下：
采用改良的CTAB法提取81份侧柏无性系(品种)的基因组DNA，具体如下：
1)在65℃水浴锅中预热CTAB提取液(100mmol NaCl，20mmol EDTA(pH＝8.0)，2％CTAB(W/V)，100mmol Tris-HCl)；
2)称取约0.5g侧柏叶片，放入研钵，在液氮中迅速研磨样品，将研磨获得的粉末状材料转入2mL离心管中，加入预热的CTAB提取液(每g样品加入3～5ml的提取液)，然后放入65℃水浴锅中保温水浴30–60min，每隔10min轻轻颠倒混匀。
3)水浴后将离心管在11000rpm条件下离心5min，取上清液转入新的离心管中。
4)然后加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，充分混合均匀后，室温11000rpm离心10min，吸取上清液再次转入新离心管。
5)加入等体积氯仿，充分混匀后11000rpm离心10min，取上清转入新离心管。
6)重复步骤4,5；
7)吸取上清液转入新的离心管后，加入2/3体积经-20℃预冷的异丙醇，充分混匀后室温放置，沉淀15min。
8)然后11000rpm条件下离心6min，弃上清。
9)将沉淀用70％的乙醇漂洗一次，室温条件下11000rpm离心2min，弃上清，重复洗一次。
10)将沉淀用30μLTE溶解；
11)提取产物取3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于-20℃保存备用。
下述实施例中，81份侧柏无性系(品种)来源于北京市林业果树科学研究院柏树种质资源圃，来源如下：
QLS-1#-QLS-12#(平台资源号1111C0003115000885～1111C0003115000896)：京平柏系列青龙山1号侧柏-青龙山12号侧柏(又名京平柏1～12号)，经实生选优获得优良无性系，来自北京市林业果树科学研究院；
XS-1#-XS-12#：西山1号-西山12号，经实生选优获得优良无性系，来自北京市林业果树科学研究院；
JX-1733#-JX-1777#(资源库编号1733～1777)：优良种源，来自河南郏县国家侧柏良种基地；
FHS-1#-FHS-3#(平台资源号1111C0003115000897～1111C0003115000899)：法海寺1号-法海寺3号(又名京海柏1号～3号)，经实生选优获得优良无性系，来自北京市林业果树科学研究院；
LG-1001#-LG-1875#：自选选育的优良无性系，来自北京市林业果树科学研究院；
ZFS-4#：锥峰山1号，经实生选优获得优良无性系，来自北京市林业果树科学研究院；
WLS-1#：实生选优，来自北京市林业果树科学研究院。
DY-1#：‘蝶叶侧柏’继代扦插苗；
DY-2#(平台资源号1111C0003115000707)：‘蝶叶侧柏’实生原株。
实施例1、鉴定‘蝶叶侧柏’SSR引物的筛选及PCR检测方法的建立
一、鉴定‘蝶叶侧柏’SSR引物的筛选
基于侧柏转录组测序开发的简单重复序列片段(SSR)的扩增产物，经过对不同侧柏种质资源进行PCR扩增后获得的扩增带型好、多态性丰富、稳定性和鉴别率高的SSR引物。利用已建立的侧柏SSR反应技术体系、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，选取4个表型差异较大的侧柏材料，对182对引物进行初筛，第一次将扩增出条带的引物保留，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对第一次扩增出来的引物进行多态性复筛，第二次扩增后将多态性好的引物保留，根据前后两次筛选确定出8对条带清晰、多态性丰富、稳定性好的SSR引物，并对这8对引物进行荧光标记。根据81份侧柏样品的扩增结果来看，引物P9、P64、P74、P84、P89、P97、P133、P139的观察等位基因数与有效等位基因数较高，且有特异性扩增条带，因此选择这8对引物。
这8对SSR标记引物序列的相关信息见表1。
表1为筛选的8对SSR引物序列
Figure BDA0002700599710000061
Figure BDA0002700599710000071
上述表中，第3列从上到下的序列依次为序列1至序列16。
二、‘蝶叶侧柏’SSR标记指纹图谱的构建方法
(1)基因组DNA提取：采用改良的CTAB法提取81份侧柏的基因组DNA；
(2)SSR标记的PCR扩增：用上述一8对筛选出来的SSR引物分别对上述提取的DNA进行PCR扩增，1对引物一个体系；
上述PCR扩增的SSR引物体系(共20μl)：ddH2O 14.8μl，dNTP 0.4μl，Buffer(Takara，Takara R001A TaKaRa TaqTM)2μl，F 0.3μl(20μM)，R0.3μl(20μM)，DNA模板2μl，Taq 0.2μl。
上述PCR扩增的反应采用如下循环参数：
94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。
(3)毛细管电泳检测：
将甲酰胺(Ambion Cat.Am9344，北京博友顺生物技术有限公司)与分子量内标(ROX 500，北京博友顺生物技术有限公司)按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的各个PCR产物，混匀，离心，变性，4℃冷却后离心，然后用ABI 3730XLDNA测序仪进行毛细管电泳，利用Gene marker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，记录每个片段大小。
结果如表2所示，
表2为8对引物对侧柏的扩增结果
Figure BDA0002700599710000081
基于侧柏转录组测序结果，筛选出8对多态性丰富、扩增稳定的引物，通过对收集保存的81份侧柏种质的遗传分析，8对引物可完全将蝶叶侧柏及其扦插后代从81份材料区分开(图17)，确定了8对SSR引物在‘蝶叶侧柏’扩增出的基因位点数、等位片段数量及等位片段大小，通过不同SSR标记获得的等位片段组合可有效鉴别‘蝶叶侧柏’原株及其无性繁殖后代，通过分子量内标rox 500可确定8对引物扩增的等位基因位点的相对分子量，存在于‘蝶叶侧柏’特异SSR位点的等位片段组合的种质即为‘蝶叶侧柏’或‘蝶叶侧柏’无性繁殖后代。
‘蝶叶侧柏’品种的P9、P64、P74、P84、P89、P97、P133、P139引物对对应的SSR等位片段大小(bp)组合为：(127/156)、(233/241)、(107/109)、(153/169)、(235/246)、(104/104)、(257/265)和(184/192)；其中/表示和的关系，是同源染色2个等位基因的结果。
因此，可以通过8对SSR引物P9、P64、P74、P84、P89、P97、P133、P139引物对及其对应的扩增产物片段大小组合(127/156)、(233/241)、(107/109)、(153/169)、(235/246)、(104/104)、(257/265)和(184/192)作为‘蝶叶侧柏’SSR标记指纹图谱，用于鉴定待测侧柏原株或其无性繁殖后代是否为‘蝶叶侧柏’，具体方法如下：
1)、基因组DNA提取：
提取待测侧柏叶片样品的基因组DNA；
2)SSR标记的PCR扩增：
以基因组DNA为模板，分别用表1所示的8对SSR引物进行PCR扩增；
上述PCR扩增的SSR引物体系(共20μl)：ddH2O 14.8μl，dNTP 0.4μl，Buffer 2μl，引物F 0.3μl(20μM)，引物R0.3μl(20μM)，DNA模板2μl，Taq 0.2μl。
上述PCR扩增的反应采用如下循环参数：
94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。
(3)毛细管电泳检测：
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物，混匀，离心，变性，4℃冷却后离心，然后用ABI 3730XL DNA测序仪进行毛细管电泳，利用Gene marker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将泳道内分子量内标的位置与样品峰值的位置做比较分析，记录每个片段大小。
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为‘蝶叶侧柏’；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，则待测侧柏不为或候选不为‘蝶叶侧柏’；
所述条件如下：
P9引物对扩增产物为127bp和156bp；且P64引物对扩增产物为233bp和241bp；且P74引物对扩增产物为107bp和109bp；且P84引物对扩增产物为153bp和169bp；且P89引物对扩增产物为235bp和246bp；且P97引物对扩增产物为104bp；且P133引物对扩增产物为257bp和265bp；且P139引物对扩增产物为184bp和192bp。
上述待测侧柏可以为原株也可以为其无性繁殖后代。
实施例2、鉴定待测侧柏原株或其无性繁殖后代是否为蝶叶侧柏的应用
1、基因组DNA提取：
分别提取81份侧柏叶片的基因组DNA；其中DY-1#为‘蝶叶侧柏’继代扦插苗，DY-2#为‘蝶叶侧柏’实生原株；
2、SSR标记的PCR扩增：
以上述基因组DNA为模板，分别用表1所示的8对SSR引物进行PCR扩增；
上述PCR扩增的SSR引物体系(共20μl)：ddH2O 14.8μl，dNTP 0.4μl，Buffer 2μl，引物F 0.3μl(20μM)，引物R0.3μl(20μM)，DNA模板2μl，Taq 0.2μl。
上述PCR扩增的反应采用如下循环参数：
94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。
3、毛细管电泳检测：
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物，混匀，离心，变性，4℃冷却后离心，然后用ABI 3730XL DNA测序仪进行毛细管电泳，利用Gene marker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将泳道内分子量内标的位置与样品峰值的位置做比较分析，记录每个片段大小。
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为蝶叶侧柏；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，则待测侧柏不为或候选不为蝶叶侧柏；
所述条件如下：
P9引物对扩增产物为127bp和156bp；且P64引物对扩增产物为233bp和241bp；且P74引物对扩增产物为107bp和109bp；且P84引物对扩增产物为153bp和169bp；且P89引物对扩增产物为235bp和246bp；且P97引物对扩增产物为104bp；且P133引物对扩增产物为257bp和265bp；且P139引物对扩增产物为184bp和192bp。
蝶叶侧柏原株DY-2#的8对引物扩增结果如图1-图8所示，可以看出，P9引物对扩增产物为127bp和156bp；且P64引物对扩增产物为233bp和241bp；且P74引物对扩增产物为107bp和109bp；且P84引物对扩增产物为153bp和169bp；且P89引物对扩增产物为235bp和246bp；且P97引物对扩增产物为104bp；且P133引物对扩增产物为257bp和265bp；且P139引物对扩增产物为184bp和192bp；得到目标产物，证明本发明的方法正确。
其他样品QLS-1#的8对引物扩增结果如图9-图16所示，引物对P9在样品QLS-1#的扩增产物大小为127bp和150bp；引物对P64扩增产物大小为241bp；引物对P74扩增产物大小为113bp；引物对P84扩增产物大小为151bp和165bp；引物对P89扩增产物大小为231bp和240bp；引物对P97扩增产物大小为104bp；引物对P133扩增产物大小为265bp；引物对P139扩增产物大小为192bp；可以看出，8对引物扩增结果不符合蝶叶侧柏鉴定标准，证明其不为蝶叶侧柏。
将8对引物对81份侧柏用NTSYSpc2.10e软件聚类分析，结果如图17所示，结果；其中DY-1#为‘蝶叶侧柏’继代扦插苗，DY-2#为‘蝶叶侧柏’原株；可以看出，在亲缘关系聚类分析中DY-1#和DY-2#聚在一起，二者遗传一致度为1，一方面说明蝶叶侧柏基因型在继代扦插过程中稳定性强，另一方面也说明本发明选择的8对引物可高效用于‘蝶叶侧柏’及其无性繁殖后代的鉴定分析。
SEQUENCE LISTING
<110>北京市林业果树科学研究院
<120>蝶叶侧柏SSR标记的指纹图谱及其构建方法与应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
caaaagggaa ggaagcctct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
aagttccatg tgctccttgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ccagaagatg tggggaaaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gcttgttttc agcccaagtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cgacattctg aaattcgggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
aggatgcggg aattttcttt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
aaacatttcc tgcaaatccg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ggaccccaaa aagttccatc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
aatactgacg cggcttcaac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
cgccatggtt gttgacttta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gctgcttggt tcagatgaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
tagtaacgcc gataccctgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
gcctgatgac ctgaactgct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
ccaagttcca gccaacagat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ccactgaagc tgaatcacca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
agaaagaagg attggtcggc 20

Claims (6)

1.成套引物在如下1）和/或2）中的应用：
1）鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏；
2）区分或辅助区分蝶叶侧柏与其他非蝶叶侧柏；
所述成套引物，其由引物对1至引物对8组成；
所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
若待测植物的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测植物为或候选为蝶叶侧柏；
若待测植物的8对引物扩增结果不满足如下条件，则待测植物不为或候选不为蝶叶侧柏；
所述条件为所述引物对1扩增产物为127bp和156bp；且所述引物对2扩增产物为233 bp和241 bp；且所述引物对3扩增产物为107 bp和109 bp；且所述引物对4扩增产物为153 bp和169bp；且所述引物对5扩增产物为235 bp和246 bp；且所述引物对6扩增产物为104 bp；且所述引物对7扩增产物为257 bp和265 bp；且所述引物对8扩增产物为184 bp和192 bp。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述成套引物的各个引物对中一条引物荧光标记。
3.一种鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏的方法，包括如下步骤：
1）用成套引物扩增待测侧柏的基因组DNA，得到PCR扩增产物；
所述成套引物，其由引物对1至引物对8组成；
所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
2）将所述PCR扩增产物进行检测；
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为蝶叶侧柏；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，则待测侧柏不为或候选不为蝶叶侧柏；所述条件为所述引物对1扩增产物为127bp和156bp；且所述引物对2扩增产物为233 bp和241 bp；且所述引物对3扩增产物为107 bp和109 bp；且所述引物对4扩增产物为153 bp和169bp；且所述引物对5扩增产物为235 bp和246 bp；且所述引物对6扩增产物为104 bp；且所述引物对7扩增产物为257 bp和265 bp；且所述引物对8扩增产物为184 bp和192 bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述成套引物的各个引物对中一条引物荧光标记。
5.成套引物和记载如下判断标准的可读载体在如下1）-4）中至少一种中的应用：
所述成套引物，其由引物对1至引物对8组成；
所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述判断标准为如下：
若待测侧柏的8对引物扩增结果满足如下条件，则待测侧柏为或候选为蝶叶侧柏；
若待测侧柏的8对引物扩增结果不满足如下条件，则待测侧柏不为或候选不为蝶叶侧柏；
所述条件为所述引物对1扩增产物为127bp和156bp；且所述引物对2扩增产物为233 bp和241 bp；且所述引物对3扩增产物为107 bp和109 bp；且所述引物对4扩增产物为153 bp和169bp；且所述引物对5扩增产物为235 bp和246 bp；且所述引物对6扩增产物为104 bp；且所述引物对7扩增产物为257 bp和265 bp；且所述引物对8扩增产物为184 bp和192 bp；
1）鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏；
2）区分或辅助区分蝶叶侧柏与其他非蝶叶侧柏；
3）制备鉴定或辅助鉴定待测植物是否为蝶叶侧柏产品；
4）制备区分或辅助区分蝶叶侧柏与其他非蝶叶侧柏产品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述成套引物的各个引物对中一条引物荧光标记。
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