CN110735001B - 香樟核基因组snp分子标记的多态性引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物及其应用，属于林业分子生物学技术领域。包括12对香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.24所示，将其应用在香樟品种鉴定、古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用中，通过提取不同品种香樟的基因组DNA、PCR扩增、HRM分析、收集数据，对18个古樟群体186个个体进行了遗传结构和遗传多样性研究，并根据香樟现有的遗传结构和遗传多样性格局，分析了可能形成的原因，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。本发明的SNP分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平。
Description
技术领域
本发明属于林业分子生物学技术领域，具体涉及香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物及其应用。
背景技术
香樟是亚洲东部亚热带常绿阔叶林代表树种，在我国长江以南地区广泛分布。香樟用途广泛，樟木材质优良，与楠、梓、桐合称为“江南四大名木”，此外樟油提取物也是重要的化工原料，广泛应用于医学、化妆和食品加工行业。香樟的栽培历史悠久，早在东周春秋时期就有香樟栽培利用的记载。近年来有关香樟分类学、生理学、化学成分与利用、良种选育和营林技术等方面的研究己有较多报道，然而关于遗传变异水平及亲缘地理关系却鲜有报道。
香樟在我国具有较早的栽培历史，地区间引种栽培情频繁，其延续至今，针对群体遗传分析的样品起源有较大出入。此外，在研究手段上，早期使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平。
SNP是基因组中单个核苷酸的突变而引起的DNA序列的多态性，它以单个碱基的颠换、转换、插入和缺失的方式存在。SNP作为第三代分子标记被广泛应用于生物、农学、医学等领域，在分子遗传学、药物遗传学、法医学和疾病的诊断治疗方面发挥着重要作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物，以解决现有技术中使用RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低的问题；本发明的另一目的是提供香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定、遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用，以解决现有技术存在的难以全面揭示香樟遗传多样性的真实水平的问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物，包括12对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：
SNP18上游引物如SEQ ID NO.1所示；
SNP18下游引物如SEQ ID NO.2所示；
SNP19上游引物如SEQ ID NO.3所示；
SNP19下游引物如SEQ ID NO.4所示；
SNP26上游引物如SEQ ID NO.5所示；
SNP26下游引物如SEQ ID NO.6所示；
SNP35上游引物如SEQ ID NO.7所示；
SNP35下游引物如SEQ ID NO.8所示；
SNP36上游引物如SEQ ID NO.9所示；
SNP36下游引物如SEQ ID NO.10所示；
SNP39上游引物如SEQ ID NO.11所示；
SNP39下游引物如SEQ ID NO.12所示；
SNP44上游引物如SEQ ID NO.13所示；
SNP44下游引物如SEQ ID NO.14所示；
SNP47上游引物如SEQ ID NO.15所示；
SNP47下游引物如SEQ ID NO.16所示；
SNP48上游引物如SEQ ID NO.17所示；
SNP48下游引物如SEQ ID NO.18所示；
SNP54上游引物如SEQ ID NO.19所示；
SNP54下游引物如SEQ ID NO.20所示；
SNP57上游引物如SEQ ID NO.21所示；
SNP57下游引物如SEQ ID NO.22所示；
SNP62上游引物如SEQ ID NO.23所示；
SNP62下游引物如SEQ ID NO.24所示。
香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定中的应用。
香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物在古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用。
上述应用，包括以下步骤：
1)提取不同品种香樟的基因组DNA；
2)用权利要求1SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示的引物对步骤1)提取的基因组DNA进行PCR扩增和HRM分析；
3)数据分析核基因组SNP位点多态性，进行品种鉴定、古樟群体遗传结构和遗传多样性分析。
进一步的，多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：上下游引物各10μM，1μL；2×Froget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，DNA模板30ng，1μL，体系的总体积为10μL。
进一步的，多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
有益效果：与现有技术相比，本发明基于核基因组测序结果，设计了60对SNP引物，筛选后共得到多对特异性较好且多态性较高的SNP引物，对18个古樟群体186个个体进行了遗传结构和遗传多样性研究，并根据香樟现有的遗传结构和遗传多样性格局，分析了可能形成的原因，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。本发明的SNP分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平。
附图说明
图1是核基因组SNP高分辨溶解曲线图；
图2是基于SNP的古樟群体UPGAM法聚类分析图；
图3是基于SNP的古樟群体空间遗传结构分析图；
图4是基于核基因组SNP标记的古樟群体结构分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
1)供试材料
供试材料来源于香樟自然分布区的18个群体，分别为四川泸州、江西靖安、江西宁都、四川宜宾、贵州道真、广西桂林、江西恩江、江西龙岗、安徽安庆、江西乐安、江西瑞洪、江西萍乡、广东广州、江西南昌、贵州贵阳、贵州荔波、福建武夷山和江苏南京。选择胸径大于60cm的古樟树，每个个体采集5-10片新鲜叶片干冰运输，经液氮速冻于-80℃冰箱保存。具体采集群体位置、经纬度、样本数等见表1。
表1 18个古樟群体采样信息
| 来源 | 样本量 | 群体 | 经度E° | 纬度N° |
| 四川泸州 | 11 | SCLZ | 105.26 | 28.58 |
| 四川宜宾 | 5 | SCYB | 104.25 | 28.25 |
| 江西靖安 | 7 | JXJA | 115.15 | 28.54 |
| 江西宁都 | 10 | JAND | 115.51 | 26.26 |
| 江西恩江 | 6 | JXEJ | 115.43 | 27.31 |
| 江西龙岗 | 5 | JXLG | 115.60 | 26.75 |
| 江西瑞洪 | 21 | JXRH | 116.43 | 28.88 |
| 江西萍乡 | 10 | JXPX | 114.06 | 27.64 |
| 江西南昌 | 31 | JXNC | 115.82 | 28.75 |
| 江西乐安 | 11 | JXLA | 115.73 | 27.28 |
| 贵州道真 | 5 | GZDZ | 107.43 | 28.45 |
| 贵州贵阳 | 15 | GZGY | 106.72 | 26.63 |
| 贵州荔波 | 5 | GZLB | 107.89 | 25.42 |
| 广西桂林 | 5 | GXGL | 110.30 | 25.17 |
| 安徽安庆 | 14 | AHAQ | 117.04 | 30.51 |
| 广东广州 | 5 | GDGZ | 113.36 | 23.19 |
| 福建武夷山 | 10 | FJWYS | 117.96 | 27.67 |
| 江苏南京 | 15 | JSNJ | 118.84 | 32.05 |
2)香樟总DNA提取与检测
采用改良后的CTAB法进行香樟总DNA的提取，具体操作步骤如下：
打开水浴锅，设置65℃预热；
取10mL离心管，加入4mLCTAB裂解液与80μL的β-巯基乙醇，放入水浴锅中进行预热；
取2g左右香樟叶片，放入预先准备好的研钵中，导入液氮研磨，直至样品呈均匀粉末状，加入上一步骤中的离心管中，放入水浴锅65℃水浴30min，期间每隔5min颠倒混匀；
取出离心管，置于冰上冷却三分钟后，加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后放入离心机中4℃、12000r离心10min；
准备新的10mL离心管，用移液器吸取上清液至新离心管中，再次加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后置于离心机中，4℃、12000r离心10min；
分别吸取500μL的上清液，分装入3个1.5mL离心管中并分别加入1mL的乙醇和50μL的醋酸钠溶液，颠倒混匀放入冰箱-20℃静置2h，等待絮状物析出；将剩余上清液移至2mL离心管，置于冰箱-20℃备用；
准备新的1.5mL离心管，分别加入1mL75％的乙醇溶液，将3个离心管中析出的絮状物挑入新离心管中，涡旋1min，10000r离心5min；
小心倒掉乙醇溶液，再加入新的1mL75％乙醇溶液，重复上一步骤；
再次倒掉乙醇溶液，利用真空干燥仪进行干燥；
加入200μL1×TE溶液，溶解3h，取出后进行离心，上清液即为所提取的DNA。
取少量提取好的香樟总DNA，利用NanoDrop 2000c(Thermo Fisher Scientific)进行DNA样品质量和浓度检测；同时利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，通过观察条带是否弥散来检测DNA有无降解。
将DNA稀释至30ng/μL，-20℃保存。
3)核基因组SNP引物扩增及筛选
基于测得的香樟核基因组测序结果，设计了60对SNP引物，筛选后共得到19对特异性较好且多态性较高的SNP引物，具体见表2。其中，SNP5、SNP7、SNP10、SNP32、SNP56、SNP59、SNP65的引物选自CN107099614B《一种用于对不同樟树进行基因分型的SNP引物及检测方法》。
表2核基因组SNP引物序列信息
注：F：上游引物；R：下游引物。
多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：DNA模板30ng，1μL；上下游引物各10μM，1μL；2×Froget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，体系的总体积为10μL。
多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
4)数据分析
利用软件popgen32进行MAF(最小等位基因频率)、h(Nei多样性指数)、I(shannon多样性指数)的估算并根据Nei’s 1972算法进行遗传距离的估算，并基于UPGMA法，利用软件MEGA6进行系统发生树的构建。
利用软件powermarker进行PIC(多态信息含量)值的估算。
为进一步研究古樟群体间遗传结构的差异，利用软件Genalex v6.5计算Fst(群体间遗传分化系数)。利用软件Structure根据贝叶斯聚类方法，采用混合祖先模型(admixture ancestry model)和等位基因频率关联模型(correlated allele frequencymodel)进行马尔科夫链的模拟算法(markov chain monte caril，MCMC)。length of burn-in period和MCMC均设为100000，对每个K值模拟重复计算10次，并使用Evanno的方法确定最佳K值。
利用软件Ntsys进行群体间遗传距离和群体间地理距离矩阵的相关性检验(Mantel检验)。
5)核基因组SNP位点多态性分析
利用19对SNP引物，通过高分辨熔解曲线对186个古樟个体进行了检测(图1)。19对引物的最小等位基因频率(MAF)为0.080～0.480，SNP59最低，SNP5和SNP47为最高，平均值为0.322，所有位点的最小等位基因频率均大于0.05。19对引物的观测杂合度为0.116～0.816，平均值为0.428；期望杂合度为0.148～0.501，平均值为0.409；观测杂合度略高于期望杂合度。Nei多样性指数(h)为0.147～0.499，平均值为0.409；shannon多样性指数(I)为0.279～0.692，平均值为0.592；PIC值为0.181～0.478，平均值为0.360。其中Nei多样性指数和shannon多样性指数最高的为SNP5、SNP47和SNP65，PIC值最高的为SNP19，三个多样性指标最低的均为SNP59(表3)。
表3 SNP位点多样性检测
| 位点 | MAF | Ho | He | h | I | PIC |
| SNP5 | 0.480 | 0.401 | 0.501 | 0.499 | 0.692 | 0.470 |
| SNP7 | 0.221 | 0.355 | 0.346 | 0.345 | 0.529 | 0.309 |
| SNP10 | 0.358 | 0.372 | 0.461 | 0.460 | 0.653 | 0.399 |
| SNP18 | 0.163 | 0.141 | 0.274 | 0.273 | 0.445 | 0.253 |
| SNP19 | 0.384 | 0.685 | 0.475 | 0.473 | 0.666 | 0.478 |
| SNP26 | 0.295 | 0.262 | 0.417 | 0.416 | 0.607 | 0.353 |
| SNP32 | 0.162 | 0.269 | 0.272 | 0.272 | 0.443 | 0.268 |
| SNP35 | 0.430 | 0.816 | 0.492 | 0.490 | 0.683 | 0.378 |
| SNP36 | 0.351 | 0.530 | 0.457 | 0.456 | 0.648 | 0.360 |
| SNP39 | 0.379 | 0.691 | 0.472 | 0.471 | 0.663 | 0.398 |
| SNP44 | 0.147 | 0.203 | 0.251 | 0.251 | 0.417 | 0.290 |
| SNP47 | 0.480 | 0.802 | 0.501 | 0.499 | 0.692 | 0.440 |
| SNP48 | 0.293 | 0.542 | 0.416 | 0.415 | 0.605 | 0.381 |
| SNP54 | 0.238 | 0.389 | 0.364 | 0.363 | 0.549 | 0.305 |
| SNP56 | 0.314 | 0.406 | 0.432 | 0.431 | 0.622 | 0.383 |
| SNP57 | 0.424 | 0.554 | 0.490 | 0.488 | 0.682 | 0.385 |
| SNP59 | 0.080 | 0.116 | 0.148 | 0.147 | 0.279 | 0.181 |
| SNP62 | 0.444 | 0.411 | 0.495 | 0.494 | 0.687 | 0.417 |
| SNP65 | 0.478 | 0.185 | 0.500 | 0.499 | 0.692 | 0.390 |
| Mean | 0.322 | 0.428 | 0.409 | 0.407 | 0.592 | 0.360 |
注：MAF：最小等位基因频率；Ho：观测杂合度；He：期望杂合度；h：Nei多样性指数；I：shannon多样性指数；PIC：多态信息含量。
6)基于核基因组的古樟群体遗传多样性分析
利用19对SNP标记对18个古樟群体遗传多样性进分析，得到的结果见表4，不同群体间遗传多样性存在较大差异。18个古樟群体的shannon指数(I)为0.276～0.603，平均值为0.520；Nei多样性指数(h)为0.183～0.423，平均值为0.355；其中遗传多样性最高的群体为江西宁都(JXND)，遗传多样性最低的群体为贵州道真(GZDZ)。
表4基于SNP的古樟各群体遗传多样性比较
| 群体 | 数量 | I | h |
| SCLZ | 11 | 0.558 | 0.385 |
| SCYB | 5 | 0.527 | 0.357 |
| JXJA | 7 | 0.542 | 0.375 |
| JXND | 10 | 0.603 | 0.423 |
| JXEJ | 6 | 0.521 | 0.364 |
| JXLG | 5 | 0.543 | 0.376 |
| JXRH | 21 | 0.563 | 0.386 |
| JXPX | 10 | 0.565 | 0.385 |
| JXNC | 31 | 0.583 | 0.403 |
| JXLA | 11 | 0.535 | 0.370 |
| GZDZ | 5 | 0.276 | 0.183 |
| GZGY | 10 | 0.474 | 0.318 |
| GZLB | 5 | 0.524 | 0.359 |
| GXGL | 5 | 0.488 | 0.340 |
| AHAQ | 14 | 0.519 | 0.351 |
| GDGZ | 5 | 0.489 | 0.339 |
| FJWYS | 10 | 0.548 | 0.339 |
| JSNJ | 15 | 0.503 | 0.338 |
| Mean | 0.520 | 0.355 |
注：I：shannon多样性指数；h：Nei多样性指数。
7)基于核基因组的古樟群体聚类分析
利用核基因组SNP标记，通过popgen32软件，基于Nei’s 1972算法计算18个群体间的遗传距离，18个群体间的遗传距离为0.017～0.168之间，平均值为0.078；遗传相似系数为0.853～0.983，平均值为0.93，18个群体间遗传距离非常小，各个群体间遗传相似度非常高。通过UPGMA法进行聚类分析(图2)，若以遗传距离为0.08为分界线，18个群体可以分为4类，贵州荔波(GZLB)和贵州道真(GZDZ)分别单独聚为一类，广西桂林(GXGL)、广州广东(GZGD)、福建武夷山(FJWYS)、安徽安庆(AHAQ)、江苏南京(JSNJ)、贵州贵阳(GZGY)和江西乐安(JXLA)聚为一类，江西群体(除江西乐安)与四川宜宾(SCYB)和四川泸州(SCLZ)聚为一类。利用ntsys软件对18个香樟群体的遗传距离和地理距离进行Mantel检验，见图3，结果显示香樟群体间遗传距离与地理空间距离之间并无显著相关性(r＝-0.14228，p＝0.1042)，表明香樟群体间变异主要并非由于地理距离引起的。
8)基于核基因组的古樟群体遗传结构分析
通过F统计量对古樟群体的遗传分化进行分析，基于核基因组SNP研究结果的Fst矩阵见表5，各群体间遗传分化系数较小，平均值为0.067，表明有6.7％的变异存在于群体之间，而有93.3％的变异存在于群体之内。其中贵州道真和其余群体的遗传分化系数相对较大，遗传分化系数最高的是贵州道真(GZDZ)和广东广州(GDGZ)两个群体之间，为0.163；遗传分化系数最低的是安徽安庆(AHAQ)和江苏南京(JSNJ)两个群体之间，为0.015。
利用Structure软件分析18个香樟群体的共祖关系，对群体的K值设置区间为2～19，每个K值重复运算10次，当K值为3时，ΔK值达到最大，见图4，故认为最佳K值为3，即18个香樟群体可以分为3个遗传组成上不同的组群。
当K值为2时，所有群体的遗传信息均表现为拥有两种祖先群体来源，其中江西宁都(JXND)、江西龙岗(JXLG)、贵州道真(GZDZ)和四川宜宾(SCYB)群体的大部分遗传信息来源较为单一，混合程度较低，其余群体的混合程度均较高。当K值为3时，所有群体的遗传信息均表现为拥有三种不同的祖先群体来源，群体内结构组成大致与K为2时相似。
当K值为4时，江西宁都(JXND)、江西龙岗(JXLG)和四川宜宾(SCYB)群体内出现一定程度的遗传分化，表现为大部分遗传信息来自两个不同祖先群体的混合，而贵州道真(GZDZ)群体内遗传信息大多仍然来自同一祖先。
随着K值的增加，各个群体的遗传信息组成越来越复杂，各个群体均有部分相似的组成部分，推测各个群体间存在一定的基因流导致群体内遗传组成较为复杂。
表5基于核基因组SNP的古樟群体间遗传分化(Fst)矩阵表
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西省科学院生物资源研究所；南京林业大学
<120> 香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物及其应用
<130> 1
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP18 primer F(Artificial)
<400> 1
gtcctcataa agatgcgtga a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> SNP18 primer R(Artificial)
<400> 2
cttcttgtca agcccatag 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP19 primer F(Artificial)
<400> 3
aaatatgatc tcctcccaca c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> SNP19 primer R(Artificial)
<400> 4
tacagcttac tgacggacct 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP26 primer F(Artificial)
<400> 5
ccaatagaag ggaacagaaa g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> SNP26 primer R(Artificial)
<400> 6
attaagttga gctctgaggc 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> SNP35 primer F(Artificial)
<400> 7
taaagatgat cggaataaac ctc 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> SNP35 primer R(Artificial)
<400> 8
ttcccttcta cgctttgcat 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP36 primer F(Artificial)
<400> 9
tgcttcaatt tctcagtctt c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP36 primer R(Artificial)
<400> 10
gctgaatggt tacatgaggt a 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP39 primer F(Artificial)
<400> 11
caagacaaga taaagcaaag c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> SNP39 primer R(Artificial)
<400> 12
tctagaggag gagttcaagc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> SNP44 primer F(Artificial)
<400> 13
agagagctgg aagaaggata 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP44 primer R(Artificial)
<400> 14
gaggaggatg cttgctagta t 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> SNP47 primer F(Artificial)
<400> 15
taaaagtggt agttcaagat gg 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> SNP47 primer R(Artificial)
<400> 16
ataaatatct tggagagcac aat 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> SNP48 primer F(Artificial)
<400> 17
cttgtcaacc aataacaaag att 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP48 primer R(Artificial)
<400> 18
tgtagatctt gggagagaca c 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP54 primer F(Artificial)
<400> 19
aagaagatgc aactgggatg t 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> SNP54 primer R(Artificial)
<400> 20
gcattttcta aggttctagc aaa 23
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP57 primer F(Artificial)
<400> 21
caagcactag ggtgaagtat t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP57 primer R(Artificial)
<400> 22
gatagtgaca atgcacacct t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP62 primer F(Artificial)
<400> 23
aagtaatcaa gtgtccacac g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> SNP62 primer R(Artificial)
<400> 24
ttacagtgtt tgaggtgatg c 21
Claims (6)
1.香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物，其特征在于，包括12对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：
SNP18上游引物如SEQ ID NO.1所示；
SNP18下游引物如SEQ ID NO.2所示；
SNP19上游引物如SEQ ID NO.3所示；
SNP19下游引物如SEQ ID NO.4所示；
SNP26上游引物如SEQ ID NO.5所示；
SNP26下游引物如SEQ ID NO.6所示；
SNP35上游引物如SEQ ID NO.7所示；
SNP35下游引物如SEQ ID NO.8所示；
SNP36上游引物如SEQ ID NO.9所示；
SNP36下游引物如SEQ ID NO.10所示；
SNP39上游引物如SEQ ID NO.11所示；
SNP39下游引物如SEQ ID NO.12所示；
SNP44上游引物如SEQ ID NO.13所示；
SNP44下游引物如SEQ ID NO.14所示；
SNP47上游引物如SEQ ID NO.15所示；
SNP47下游引物如SEQ ID NO.16所示；
SNP48上游引物如SEQ ID NO.17所示；
SNP48下游引物如SEQ ID NO.18所示；
SNP54上游引物如SEQ ID NO.19所示；
SNP54下游引物如SEQ ID NO.20所示；
SNP57上游引物如SEQ ID NO.21所示；
SNP57下游引物如SEQ ID NO.22所示；
SNP62上游引物如SEQ ID NO.23所示；
SNP62下游引物如SEQ ID NO.24所示。
2.权利要求1所述的香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物在香樟品种鉴定中的应用。
3.权利要求1所述的香樟核基因组SNP分子标记的多态性引物在古樟群体遗传结构和资源遗传多样性分析中的应用。
4.权利要求2或3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取不同品种香樟的基因组DNA；
2）用权利要求1 SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.24所示的引物对步骤1）提取的基因组DNA进行PCR-HRM扩增；
3）数据分析核基因组SNP位点多态性，进行品种鉴定、古樟群体遗传结构和遗传多样性分析。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：上下游引物各10μM，1μL；2×Froget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，DNA模板30ng，1μL，所述体系的总体积为10μL。
6.根据根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
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|---|---|---|---|---|
| CN107099614A (zh) * | 2017-07-04 | 2017-08-29 | 南京林业大学 | 一种用于对不同樟树进行基因分型的snp引物及检测方法 |
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| 香樟的分子生物学研究进展;钟永达等;《江西科学》;20150430;第33卷(第2期);第184-187页 * |
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