CN111979341B - 一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用 - Google Patents

一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用，属于分子标记技术领域。本发明提供了用于罗氏沼虾遗传多样性分析的SSR分子标记引物组，包括8对引物；本发明还提供了所述SSR分子标记引物组的获取方法；本发明还提供了所述SSR分子标记引物组在罗氏沼虾遗传多样性分析中的应用，所述引物组能有效对罗氏沼虾种质资源进行遗传多样性分析及群体聚类分析。本发明所述的8对引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，丰富了罗氏沼虾种质资源遗传多样性分析的方法。

Description

一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及SSR引物组领域，特别是涉及一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用。
背景技术
罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii),又称大头虾、马来西亚大虾,隶属于节肢动物门,软甲纲,十足目,长臂虾科,沼虾属,原产于东南亚,是目前世界上重要的淡水养殖虾类之一,也是世界上最大的淡水虾。它在水生态系统中分布较广,在淡水区域(如江河、湖泊)和半咸水区域(如河口)均有分布,对水环境中的理化指标变化反应较敏感。它具有生长速度快、食性较广、生长周期短和抗病能力强等特点,自1976年该虾引入我国以来,已在浙江、江苏、上海、广东、广西、湖南、湖北等十多个省市自治区养殖推广。
SSR(simple sequence repeat,简单重复序列),由2-6个核苷酸为重复单元组成的DNA序列,同一类SSR可分布于基因组的不同位置上，由于其重复次数和重复程度不同而形成每个座位的多态性，在真核生物的基因组中分布广泛。这一序列具有共显性、多态性相对丰富、基因组覆盖高等优点。因此，开发共显性的SSR分子标记引物用于罗氏沼虾的遗传多样性及品种鉴定保护等相关研究是十分必要的。目前，对于罗氏沼虾的SSR引物开发及相关遗传研究报道相对较少，极大的限制了罗氏沼虾的遗传多样性分析等相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组，所述引物组由8对SSR引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～16所示。
进一步的，所述引物组通过以下步骤得到：
(1)获取罗氏沼虾转录组序列，具体为：随机选择的罗氏沼虾3个健康个体的卵巢组织，提取RNA并等量混和；纯化并回收RNA；构建文库并测序；
(2)使用MISA v1.0对步骤(1)获得的序列进行SSR位点的筛选；
(3)罗氏沼虾转录组的设计：依据步骤(2)筛选的SSR位点，进行SSR引物设计，得到罗氏沼虾SSR标记引物组。
进一步的，先对上述步骤(1)中得到的序列进行聚类去冗余，然后再进行SSR位点的筛选；筛选标准包括以双核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于6次；以三核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以四核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以五核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4；以六核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于4次。
本发明还提供了所述引物组合物在鉴评罗氏沼虾遗传多样性中的应用。
进一步的，利用罗氏沼虾转录组鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，包括如下步骤：
(1)取待分析罗氏沼虾的DNA；
(2)将SEQ NO.1～16所示引物组的5’端标记FAM；
(3)以步骤(1)待测样品DNA为模板，利用步骤(2)所述5’端标记FAM后的SEQ NO.1～16所示引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目，得到统计结果；
(5)记录每对引物的扩增峰型，对获得的数据进行分析处理，评价罗氏沼虾种质的遗传多样性。
进一步的，上述步骤(1)中提取分析罗氏沼虾的DNA时，以罗氏沼虾的腹部肌肉组织作为提取样本。
进一步的，所述PCR的扩增体系为DNA模板1μl、上游引物0.1μl、下游引物0.3μl、2*GoldStar Best MasterMix 5μl和水3.6μl。
进一步的，所述PCR的扩增程序为95℃ 5min，95℃ 30s、45-60℃ 30s、72℃ 30s共15个循环，95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 30s共20个循环，72℃ 7min。
本发明公开了以下技术效果：
本方法利用转录组数据开发微卫星标记比较简单有效，并且转录组数据均来源于基因的转录区，可直接反应基因的表达信息。以期为罗氏沼虾种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建和分子标记辅助育种等提供更丰富的标记来源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DNA提取后的毛细管电泳检测结果；
图2为不同类型重复基元SSR占总SSR的比例；
图3为引物在3号样毛细管电泳检测结果；
图4为引物在4号样毛细管电泳检测结果；
图5为引物在5号样毛细管电泳检测结果；
图6为引物在12号样毛细管电泳检测结果；
图7为罗氏沼虾遗传多样性的UPGMA聚类树状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1转录组测序
随机选择的罗氏沼虾3个健康个体的卵巢组织，使用
Figure GDA0003121007010000053
ReagentInvitrogen提取RNA。取等量RNA混和，构建基因组文库并测序，测序委托上海凌恩生物科技有限公司采用Illumina HiSeq 2500测序平台完成。
表1 罗氏沼虾转录组数据量统计
Figure GDA0003121007010000051
实施例2SSR序列的筛选与鉴定
使用MISA v1.0(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)对Unigene进行SSR检测，对应的各个Unit size的最少重复数分别为以单核苷酸为重复单位时，其重复数至少为12次才可被检测到；以双核苷酸为重复单位时，其最少重复数为6；以三核苷酸为重复单位时，其重复数至少为5；以四核苷酸为重复单位时，其重复数至少为5；以五核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4；以六核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4。
最终对SSR出现频率、重复基元类型、重复次数及其多态性进行统计分析，结果见表2。
表2 罗氏沼虾转录组中不同SSR重复基元出现的频率
Figure GDA0003121007010000052
Figure GDA0003121007010000061
由数据得，罗氏沼虾中共有48种重复基元。二、三、四、五、六碱基重复基元分别有4、10、19、7、6种。单核苷酸重复类型含量约占所有碱基重复类型的39.78％，比例最高，其中(A/T)n出现频率最高，占单核苷酸类型的97.91％；二碱基重复SSR含量约占总数的34.52％，其中出现的频率最多的是(AG/CT)n，占比约为51.38％；三碱基重复SSR占所有碱基重复类型的24.66％，四碱基重复SSR占比9.10％，五碱基、六碱基重复SSR所占比例较少。(AAT/ATT)n、(AAAT/ATTT)n、(AATAT/ATATT)n、(AACAAG/CTTGTT)n在三、四、五、六碱基重复基元类型出现频率最多，在各自类型中占比分别是19.84％、16.67％、25.00％、28.57％(表2)。
在所有的碱基重复模式中，各种重复基元中总SSR比例前五的依次为(AG/CT)n(17.74％)、(AT/AT)n(8.92％)、(AC/GT)n(7.80％)、(AAT/ATT)n(4.89％)、(AGG/CCT)n(3.80％)，其他不同类型重复基元SSR占总SSR的比例分布见图2。
实施例3SSR引物的设计及合成
根据实施例2中检测到的序列和位点，使用primer3(https://sourceforge.net/projects/primer3/)批量设计SSR引物。引物设计标准为：引物序列中没有SSR；序列在DNA保守序列区内；长度在15-30bp之间；上下游引物不存在互补序列；引物自身不存在互补序列；引物退火温度(Tm)在45-60℃之间；上下游引物的Tm值相差≤5℃；GC含量在40％-60％之间；产物大小为100-400bp。2-6核苷酸重复基序的引物由上海Sangon生物工程股份有限公司合成，用于SSR引物筛选。
实施例4引物的筛选
SSR-PCR反应体系包括DNA模板1μl、上游引物0.1μl、下游引物0.3μl、2*GoldStarBest MasterMix 5μl(购自康为世纪)和水3.6μl。
SSR-PCR反应程序包括：95℃，5min，95℃ 30s、45-60℃ 30s、72℃ 30s共15个循环，95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 30s共20个循环，72℃ 7min。
PCR反应结束后进行毛细管电泳，根据条带迁移情况统计目标范围内出现相异条带的引物。在本实施例中筛选得到了8对引物，引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16所示。
实施例5SSR引物在罗氏沼虾不同种群中的遗传多样性分析
选用罗氏沼虾“南太湖2号”核心群体(C)、缅甸群体(R)、孟加拉群体(B)、以色列群体(I)为试验材料，采集其腹部肌肉置于无水乙醇中固定，-20℃保存备用。其中“南太湖2号”为连续第10代选育的核心群体、缅甸群体为野生种经驯化养殖的第5代、孟加拉野生种经驯化养殖的第7代、以色列群体为基因型为WW的全雌个体，购自以色列，具体样本量见表3。
表3 罗氏沼虾各群体样本量
Figure GDA0003121007010000071
Figure GDA0003121007010000081
采集上述各群体样本腹部肌肉，利用美国Axygen核酸抽提DNA制备试剂盒，分别提取各样本基因组DNA，用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，结果见图1，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用。
以上述待测样品DNA为模板，用实施例4筛选得到的8对引物进行扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增反应优化体系DNA模板1μl、上游引物0.1μl、下游引物0.3μl、2*mix 5μl和水3.6μl。PCR扩增程序为：95℃，5min，95℃ 30s、45-60℃ 30s、72℃ 30s共15个循环，95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 30s共20个循环，72℃7min。
将上述PCR扩增产物采用毛细管电泳检测，直接读取出产物片段有无及大小，结果见图3-6。
利用上述统计结果进行罗氏沼虾遗传多样性分析、群体结构分析，所述罗氏沼虾遗传多样性分析的具体方法如下：利用POPGENE 3.2软件分析5个群体的观测杂合度(Ho)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)、期望杂合度(He)和群体间变异(Fst)等遗传参数,并测试各个位点的哈代-温伯格平衡(HWE)。根据遗传距离用Mega4.0软件构建5个地理群体的UPGMA聚类图，UPGMA聚类图见图7。
表4 SSR引物在4个群体中的遗传多样性
Figure GDA0003121007010000082
Figure GDA0003121007010000091
由上表可知，在罗氏沼虾群体中，等位基因数Na在各SSR位点之间变化范围为5-9，有效等位基因数变化范围为1.6118-6.4719。11、25标记扩增的等位基因最少(5个)；74扩增的等位基因最多(9个)。观察杂合度HO和期望杂合度HE的变化范围分别为0.159-0.6185和0.1534-0.8499，平均值分别为0.2497±0.1534和0.7503±0.1534。Shannon’s信息指数I和Nei氏多样性指数的变化范围分别为0.7603-1.9568和1.6118-6.4719平均值分别为1.6343±0.3996和4.6913±1.5343。Shannon’s信息指数I、期望杂合度HE、Nei氏多样性指数h呈现相似的变化趋势，最大值均出现在74处，最小值在位点25处。
表5 四个地理群体间的遗传距离
Figure GDA0003121007010000092
由上表可知，C群体与R群体遗传距离最大，B群体与R群体遗传距离最小。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaatttctgg ggctagccgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtgcaggac ggaaaactca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcaccagc tttcctacag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctccgtcgt gctatgagtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaaggcag cgatgacaac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctggctgtg catcagatca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgccttgatg agcaatgtgt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgaactgta gcatggcctt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcagctgctt ttccttctca c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcctttcc tcttgccgta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgctcggaaa gtgatctccg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcacccacaa ccaaaatgct 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggctagct acaaacgcct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgacagtaac tgggcagcaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acacacacag ccagaaagga 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttagaggggc acactcgtga 20

Claims (6)

1.一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组，其特征在于，所述引物组由8对SSR引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～16所示。
2.一种权利要求1所述的引物组合物在鉴评罗氏沼虾遗传多样性中的应用。
3.一种鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取待分析罗氏沼虾的DNA；
(2)将SEQ NO.1～16所示引物组的5’端标记FAM；
(3)以步骤(1)待测品DNA为模板，利用步骤(2)所述5’端标记FAM后的SEQ NO.1～16所示引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目，得到统计结果；
(5)记录每对引物的扩增峰型，对获得的数据进行分析处理，评价罗氏沼虾种质的遗传多样性。
4.根据权利要求3所述的鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，其特征在于：步骤(1)中，提取分析罗氏沼虾的DNA时，以罗氏沼虾的腹部肌肉组织作为提取样本。
5.根据权利要求3所述的鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，其特征在于，所述PCR的扩增体系为DNA模板1μl、上游引物0.1μl、下游引物0.3μl、2*GoldStar Best MasterMix 5μl和水3.6μl。
6.根据权利要求3所述的鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，其特征在于，所述PCR的扩增程序为95℃，5min，95℃30s、45-60℃30s、72℃30s共15个循环，95℃30s、50℃30s、72℃30s共20个循环，72℃7min。
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罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢发育不同时期转录组分析;陈雪峰;《海洋与湖沼》;20190331;第50卷(第2期);第399页第1.2节 *

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