CN107937395B

CN107937395B - 一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记及鉴定方法与应用

Info

Publication number: CN107937395B
Application number: CN201711267397.0A
Authority: CN
Inventors: 马洪雨; 吴清洋; 苗贵东; 郑怀平; 李升康; 游翠红; 王树启
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN107937395A

Abstract

本发明涉及一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记及鉴定方法与应用，鉴定方法包括：远海梭子蟹基因组DNA提取、简化基因组文库构建及高通量测序、序列分析及微卫星引物设计、微卫星标记多态性评价。本发明鉴定出17983个微卫星位点，筛选出16个具有分子多态性的微卫星标记。本发明具有操作简单、安全、准确率高、结果真实可靠等优点，可快速、大批量获得远海梭子蟹微卫星标记，而且本发明的技术方法不需要预先知道基因组信息，可应用于众多的无参考基因组的物种，具有广泛的推广应用潜力；另外，本发明获得的16对多态性微卫星标记引物可为远海梭子蟹的种群遗传多样性评估、亲缘关系鉴定以及遗传连锁图谱构建提供候选工具。

Description

一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记及鉴定方法与应用

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的海洋蟹类微卫星标记筛选与种群遗传多样性研究技术；特别涉及一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法。

背景技术

远海梭子蟹(Portunus pelagicus)，又称远洋梭子蟹，俗称蓝蟹、沙蟹、外海蟹或花蟹，隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、软甲亚纲(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、爬行亚目(Reptantia)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(Portunus)。远海梭子蟹为暖水性蟹类，主要分布在我国的海南、广西、广东、台湾、福建和浙江等省份海域，也是西太平洋-印度洋四大重要经济蟹类之一。远海梭子蟹肉质鲜美、营养丰富、个体体型大，具有极高的经济价值和营养价值。自20年代90世纪开始，国内外学者先后对其开展了人工育苗(蒲利云等，2013)、胚胎发育(廖永岩等，2011)及食物组成(宁加佳等，2016)等研究，但在种群遗传多样性和群体遗传结构方面的研究还较少。近年来由于捕捞强度的增大及种质资源的退化，商品蟹的规格及捕捞量逐年减少，目前商品蟹的头胸甲宽大都小于8厘米。因此急需改良提高远海梭子蟹种质，培育抗逆性强、成长快的新品种。

在传统的遗传选育基础上，利用分子标记研究选育种群的遗传多样性、辅助亲本选择能够有效地提高选育效率,尤其是对于如生长性状和抗病性状等难以进行表型测定的性状。微卫星标记是一种新型分子遗传标记，它具有在基因组中分布广、数量大、易于检测、多态性丰富、呈孟德尔共显性遗传等特点。自20世纪90年代以来，微卫星标记已经广泛应用于一些重要动植物和人类连锁群的构建和物理图谱的绘制。目前，在远海梭子蟹中只开发了8个微卫星标记，这还远不能满足开展种群遗传多样性和遗传育种研究的需要。传统的微卫星标记的开发大都依赖于全基因组文库的构建、5’锚定PCR、FIASCO、转录组测序，或通过NCBI数据库搜索等途径，但这些开发技术存在成本昂贵，效率不高，且大都不适合非模式动物的等问题。近年来，简化基因组及高通量测序技术的出现弥补了传统方法的不足，它具有低成本、高通量、高分辨率及高准确度等优点，而且对于大多数生物而言，它并不需要对整个基因组序列，在模式和非模式生物中均可广泛使用。由于该技术的性价比日益突出，它将是未来微卫星标记开发的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，弥补现有技术存在的不足。

一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记，包含16对多态性微卫星标记，所述16对多态性微卫星标记引物表如下：

一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，主要包括以下步骤：

(1)提取远海梭子蟹基因组DNA；

(2)构建简化基因组文库，进行高通量测序；

(3)序列分析，微卫星标记筛选及引物设计；

(4)采用大样本对微卫星标记引物进行验证。

进一步的，步骤(1)所述提取远海梭子蟹基因组DNA，主要包括以下步骤：取远海梭子蟹肌肉组织，放入盛有组织裂解液的离心管中，匀浆；之后加入RNA酶混匀，室温孵育；随后加入蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴锅中消化至澄清；随后采用Tris-饱和酚和氯仿连续抽提多次；吸取上清液至新的离心管中，加入预冷的无水乙醇沉淀DNA，离心收集沉淀，清洗；最后，室温干燥DNA，并溶解于无菌双蒸水中，-20℃低温保存。

进一步的，步骤(2)所述构建简化基因组文库，主要包括以下步骤：采用EcoRI-HF内切酶对基因组DNA样品酶切，37℃水浴锅内孵育；然后采用AmPureBeads磁珠吸附方法纯化酶切产物，并连接带有特异条形码的专用接头P1，室温静置；采用AmPure Beads磁珠吸附方法纯化连接产物，并用Bioruoter超声法将连接产物打碎得到350bp左右片段，之后加入具有3′dT的专用接头P2，室温静置；下一步采用割胶回收方法回收300-500bp大小的产物，并采用PCR方法富集回收产物。

进一步的，步骤(3)所述序列分析，微卫星标记筛选及引物设计，主要包括以下步骤：第一，采用CD-HIT-EST对获得的序列进行聚类、过滤，获得了适合组装的reads；第二，采用Spades对每类中的reads进行局部组装，并剔除长度小于150bp的序列，获得contigs；第三，使用软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列；然后利用生物学软件PrimerPremier 5.0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行特异引物设计。

进一步的，步骤(4)所述采用大样本对微卫星标记引物进行验证，主要包括以下步骤：第一，利用上述微卫星特异引物对远海梭子蟹野生群体进行PCR扩增；第二，向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂，于95℃变性5分钟，快速冷却；然后上样约3μl于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳1-1.5小时；第三，电泳完成后进行染色和显色，获得远海梭子蟹遗传变异的多态性图谱；第四，利用POPGENE3.2分析软件对远海梭子蟹多态性图谱进行多样性分析。

进一步的，步骤(2)所述高通量测序主要包括采用Illumina测序平台对回收产物进行高通量测序。

进一步的，所述软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列的查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次；所述特异引物设计时，引物应符合以下标准：①特异引物长度在18–25bp，②GC含量在40-60％，③退火温度在48-60℃，④PCR产物的预期长度在130-350bp。

进一步的，所述染色和显色的操作过程为：首先用70％乙醇固定10分钟，蒸馏水洗5分钟；然后用1.5‰硝酸银染色10分钟，蒸馏水洗8秒钟；最后用2％的NaOH+4‰的甲醛显色液显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净。

上述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的应用，可为远海梭子蟹的种群遗传多样性评估、亲缘关系鉴定以及遗传连锁图谱构建提供候选工具。

与现有技术相比，本发明首次运用简化基因组及高通量测序技术来鉴定远海梭子蟹的微卫星分子标记，建立一种有效筛选微卫星分子标记的生物学技术；并且通过分子多态性评估，获得远海梭子蟹多态性微卫星标记及其扩增引物。本发明的技术方法具有操作简单、安全、准确、灵敏、可靠等优点，可快速、大批量、高效鉴定出多态性的微卫星标记；而且本发明的技术方法不需要预先知道基因组信息，可应用于众多的无参考基因组的物种，具有广泛的推广应用潜力；另外，本发明获得的16对多态性微卫星标记引物可为远海梭子蟹的种群遗传多样性评估、亲缘关系鉴定以及遗传连锁图谱构建提供候选工具。

附图说明

图1为筛选到的远海梭子蟹多态性微卫星标记电泳图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例

1、远海梭子蟹基因组DNA的提取

采集远海梭子蟹成蟹33只，取肌肉组织约10g并用95％酒精保存。取肌肉组织100mg左右，放入盛有300μL组织裂解液的1.5mL的离心管中，匀浆；依次向离心管内加入10μL RNA酶(20mg/mL)，混匀，室温孵育2min；加入5μl蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，55℃水浴锅中消化至澄清，其中可多次进行摇动混匀，加速其溶解；随后采用Tris-饱和酚和氯仿连续抽提2次；吸取上清液约300-350μL至新的离心管中，加入1ml预冷的无水乙醇沉淀DNA，12000rpm离心收集沉淀，并用预冷的70％乙醇再清洗一次；最后，室温干燥DNA(沉淀)，并溶解于40μL无菌双蒸水中，-20℃低温保存待用。

2、简化基因组文库的构建与高通量测序

本研究构建了10只远海梭子蟹的简化基因组文库并进行了高通量测序。首先，取10个个体的基因组DNA样品，分别采用EcoRI-HF内切酶对其酶切，构建反应体系40μL，其中包括：EcoRI-HF酶5U、10x Buffer 4μL、DNA1μg，37℃水浴锅内孵育3小时。然后采用AmPureBeads磁珠吸附方法纯化酶切产物，并连接带有特异条形码的专用接头P1，构建30μL连接反应体系，其中包括：Adapter P1接头0.5μL、Ligation Buffer 3μL、Ligase 200U、酶切产物1μg，室温静置2小时。再一次采用AmPure Beads磁珠吸附方法纯化连接产物，并采用Bioruoter超声法将连接产物打碎至350bp左右片段，之后加入具有3′dT的专用接头P2，并构建30μL连接反应体系，包括：Adapter P2接头0.5μL、LigationBuffer 3μL、Ligase 200U、破碎的连接产物1μg，室温静置2小时。下一步采用割胶回收方法回收300-500bp大小的产物，并采用PCR方法富集回收产物，PCR反应体系30μL，包括：P1和P2引物各0.2μL、2x Mix 15μL、回收产物10μL。PCR反应条件为：98℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，循环15次，72℃延伸7min，10℃保存。再一次然后回收长度在300-500bp的PCR产物。最后，采用Illumina测序平台(上海BIO-TECHNOLOGY有限公司)对回收产物进行高通量测序。

3、序列分析，微卫星标记筛选及引物设计

采用CD-HIT-EST对获得的序列进行聚类、过滤，获得了适合组装的reads共6,311,356个(0.82G bp)。第二，采用Spades对每类中的reads进行局部组装，并剔除长度小于150bp的序列，获得了85,796个contigs，平均长度为339bp，N50为361bp，GC含量为40.34％。第三，使用软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次。最终鉴定到17983个微卫星标记，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、思核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复分别有3221、7458、3263、595、164和24个。然后利用生物学软件Primer Premier 5.0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行引物设计。引物应符合以下标准：(1)引物长度在18–25bp之间；(2)GC含量在40-60％之间；(3)退火温度在48-60℃之间；(4)PCR产物的预期长度在130-350bp之间。最终成功设计16对微卫星标记引物(下表)。

4、微卫星标记的大样本验证

利用上述微卫星引物对远海梭子蟹群体进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、上、下游引物终浓度各0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度(上表)退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸7分钟，4℃保存PCR产物。

向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂(98.0％甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯氰)，于95℃变性5分钟，快速冷却；然后上样约3μl于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。分子量标准为pBR322/MspI,电泳液为1×TBE，恒压35-40V/cm，电泳约1-1.5小时。电泳完成后进行染色和显色，其操作过程为：首先用70％乙醇固定10分钟，蒸馏水洗5分钟；然后用1.5‰硝酸银染色10分钟，蒸馏水洗8秒钟；最后用显色液(2％的NaOH+4‰的甲醛)显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净，便获得了远海梭子蟹遗传变异的多态性图谱，如图1所示。

利用POPGENE3.2分析软件对远海梭子蟹多态性图谱进行多样性分析，结果显示：共检测到75个等位基因，各基因座的平均等位基因数为4.7；其观测等位基因和有效等位基因数分别为2-11和1.1-7.3，观测杂合度和期望杂合度分别为0.06-1.00和0.06-0.87；16个多态位点内，9个位点表现为高多态信息含量(PIC>0.5)，5个位点为中度多态信息含量(0.25<PIC<0.5),2个位点为低多态信息含量(PIC<0.25)；16个多态位点中，有5个位点显著偏离Hardy–Weinberg平衡(p<0.05)。

以上所公开的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 汕头大学

<120> 一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记及鉴定方法与应用

<130> 2017

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(1)

<400> 1

tggttctcct gaaatactgt tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2)

<400> 2

ctcccctctc tcaattagtt cc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(3)

<400> 3

gtcaactatt cctcgcatct cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(4)

<400> 4

tccatcaatt attcaagaac cg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(5)

<400> 5

gtaagtgttg ctaacgacca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(6)

<400> 6

atcacttcca aaaaagacaa 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(7)

<400> 7

gaggcaagtc caggtagtaa aa 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(8)

<400> 8

cacactcaaa catacttcca cc 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(9)

<400> 9

ttgttcttgt gtgtttttct c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(10)

<400> 10

tgctttctta tacatgggta g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(11)

<400> 11

ccctccccgt gtacattttc a 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(12)

<400> 12

ggggggacat taaaacaatg aa 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(13)

<400> 13

cccttcatcg tccccactac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(14)

<400> 14

atgctaaccg agaatcccag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(15)

<400> 15

gatgttcgta aggctcggtc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(16)

<400> 16

attccgaagc ctgaagattt 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(17)

<400> 17

cgttgtgtaa ggtgacggtt gc 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(18)

<400> 18

actggacgca ggcagataga ag 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(19)

<400> 19

cttgcttgtg tctgcctgtc tc 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(20)

<400> 20

cgctgaagtg aactggaatg ac 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(21)

<400> 21

tgaagatgat tgattgaaag ag 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(22)

<400> 22

gtcaataaaa tggtctaatc gt 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(23)

<400> 23

tagcacccga gtgtccattg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(24)

<400> 24

atttctggga cgagagcgag 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(25)

<400> 25

gaacacagtg aagcaaggaa 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(26)

<400> 26

cgtaaaaatg tgcctcttgt 20

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(27)

<400> 27

ttttcaatca cgaacaaaga ac 22

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(28)

<400> 28

agatggtaca cccaaagaaa tg 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(29)

<400> 29

ctcatcctcc agttttttcc aa 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(30)

<400> 30

aacagccaaa gcaagagaag tg 22

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(31)

<400> 31

caacagacag gtctggaagt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(32)

<400> 32

gattgtggaa aacgaggtag 20

Claims

1.一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记，其特征在于，包含16对多态性微卫星标记，所述16对多态性微卫星标记的引物表如下：

2.根据权利要求1所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)提取远海梭子蟹基因组DNA；

(2)构建简化基因组文库，进行高通量测序；

(3)序列分析，微卫星标记筛选及引物设计；

(4)采用大样本对微卫星标记引物进行验证。

3.根据权利要求2所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述提取远海梭子蟹基因组DNA，主要包括以下步骤：取远海梭子蟹肌肉组织，放入盛有组织裂解液的离心管中，匀浆；之后加入RNA酶混匀，室温孵育；随后加入蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴锅中消化至澄清；随后采用Tris-饱和酚和氯仿连续抽提多次；吸取上清液至新的离心管中，加入预冷的无水乙醇沉淀DNA，离心收集沉淀，清洗；最后，室温干燥DNA，并溶解于无菌双蒸水中，-20℃低温保存。

4.根据权利要求2所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述构建简化基因组文库，主要包括以下步骤：采用EcoRI-HF内切酶对基因组DNA样品酶切，37℃水浴锅内孵育；然后采用AmPure Beads磁珠吸附方法纯化酶切产物，并连接带有特异条形码的专用接头P1，室温静置；采用AmPure Beads磁珠吸附方法纯化连接产物，并用Bioruoter超声法将连接产物打碎得到350 bp左右片段，之后加入具有3′dT的专用接头P2，室温静置；下一步采用割胶回收方法回收300-500 bp大小的产物，并采用PCR方法富集回收产物。

5.根据权利要求2所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述序列分析，微卫星标记筛选及引物设计，主要包括以下步骤：第一，采用CD-HIT-EST对获得的序列进行聚类、过滤，获得了适合组装的reads；第二，采用Spades对每类中的reads进行局部组装，并剔除长度小于150bp的序列，获得contigs；第三，使用软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列；然后利用生物学软件Primer Premier5.0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行特异引物设计。

6.根据权利要求2所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤(4)所述采用大样本对微卫星标记引物进行验证，主要包括以下步骤：第一，利用上述微卫星特异引物对远海梭子蟹野生群体进行PCR扩增；第二，向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂，于95℃变性5分钟，快速冷却；然后上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳1-1.5小时；第三，电泳完成后进行染色和显色，获得远海梭子蟹遗传变异的多态性图谱；第四，利用POPGENE3.2分析软件对远海梭子蟹多态性图谱进行多样性分析。

7.根据权利要求5所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述高通量测序主要包括采用Illumina测序平台对回收产物进行高通量测序。

8.根据权利要求5所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，所述软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列的查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次；所述特异引物设计时，引物应符合以下标准：①特异引物长度在18–25bp，②GC含量在40-60％，③退火温度在48-60℃，④PCR产物的预期长度在130-350bp。

9.根据权利要求6所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的鉴定方法，其特征在于，所述染色和显色的操作过程为：首先用70％乙醇固定10分钟，蒸馏水洗5分钟；然后用1.5‰硝酸银染色10分钟，蒸馏水洗8秒钟；最后用2％的NaOH+4‰的甲醛显色液显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净。

10.根据权利要求1所述远海梭子蟹多态性微卫星分子标记的应用，其特征在于，可为远海梭子蟹的种群遗传多样性评估、亲缘关系鉴定以及遗传连锁图谱构建提供候选工具。