CN112080567B - 三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用 - Google Patents
三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用，包括20对微卫星引物。本发明还提供了上述标记在三疣梭子蟹不同体重群体的遗传结构分析中的应用。本发明提供的微卫星标记具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传连锁图谱的构建、QTL定位、品种鉴定、分子标记辅助育种、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及三疣梭子蟹生物学遗传育种领域，具体地说是一种三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用。
背景技术
SSR(Simple sequence repeat)即简单序列重复，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，在真核生物基因组中，SSR仅由几个核苷酸(1-6个)组成重复单位，如((CT)n，(AC)n，(ACT)n(其中n为重复次数)等。同一类微卫星DNA可分布在整个基因组不同位置上，由于重复次数的不同，或重复程度的不完全，而形成每个座位的多态性。每类微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据两端序列设计一对特异引物，扩增每个标记微卫星序列。
目前，SSR也是发展最快、应用最广的一类标记。SSR标记具有以下特点：①在真核生物基因组中广泛分布，大约每隔10-15kb就存在一个微卫星标记；②数量多，具有丰富的多态性；③具有多等位基因的特性，信息含量大；④呈共显性遗传，即能区分纯合子和杂合子；⑤等位基因的分离遵循孟德尔规律；⑥实验操作简单、结果稳定可靠；⑦基于PCR技术，可实现自动化检测；⑧具有连锁不平衡现象；⑨重复性较好。因此，微卫星标记技术目前已广泛地应用于生物遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、QTL定位、分子标记辅助选择育种、种质资源的鉴定等方面。
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济蟹类，北起中国辽东半岛、南至广东沿海，以及日本、朝鲜、马来群岛、红海等海域均有分布。近年来由于过度捕捞和环境污染造成三疣梭子蟹野生资源减少，抗逆性、抗病性下降，同一群体内大小规格参差不齐。因此，开发针对分析三疣梭子蟹不同体重群体遗传多样性的微卫星标记，采用分子遗传标记的手段分析三疣梭子蟹种质资源现状，研究其种群遗传学以及利用分子标记进行育种，这对了解三疣梭子蟹的遗传多样性和种群结构、有效保护三疣梭子蟹野生资源、开发良种以及保育原种，对生物多样性的保护和生物资源的可持续利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是提供一种三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用，以提供一套三疣梭子蟹遗传结构分析的微卫星标记，为三疣梭子蟹遗传多样性、种质资源现状的调查研究以及分子生物学育种提供依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记，包括：
微卫星标记DX01，其序列如SEQ ID NO.1所示；
微卫星标记DX02，其序列如SEQ ID NO.2所示；
微卫星标记DX03，其序列如SEQ ID NO.3所示；
微卫星标记DX04，其序列如SEQ ID NO.4所示；
微卫星标记DX05，其序列如SEQ ID NO.5所示；
微卫星标记DX06，其序列如SEQ ID NO.6所示；
微卫星标记DX07，其序列如SEQ ID NO.7所示；
微卫星标记DX08，其序列如SEQ ID NO.8所示；
微卫星标记DX09，其序列如SEQ ID NO.9所示；
微卫星标记DX10，其序列如SEQ ID NO.10所示；
微卫星标记DX11，其序列如SEQ ID NO.11所示；
微卫星标记DX12，其序列如SEQ ID NO.12所示；
微卫星标记DX13，其序列如SEQ ID NO.13所示；
微卫星标记DX14，其序列如SEQ ID NO.14所示；
微卫星标记DX15，其序列如SEQ ID NO.15所示；
微卫星标记DX16，其序列如SEQ ID NO.16所示；
微卫星标记DX17，其序列如SEQ ID NO.17所示；
微卫星标记DX18，其序列如SEQ ID NO.18所示；
微卫星标记DX19，其序列如SEQ ID NO.19所示；
微卫星标记DX20，其序列如SEQ ID NO.20所示。
一种三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记的引物，包括20对微卫星引物，分别是：
DX01F：序列如SEQ ID NO.21所示，DX01R：序列如SEQ ID NO.22所示；
DX02F：序列如SEQ ID NO.23所示，DX02R：序列如SEQ ID NO.24所示；
DX03F：序列如SEQ ID NO.25所示，DX03R：序列如SEQ ID NO.26所示；
DX04F：序列如SEQ ID NO.27所示，DX04R：序列如SEQ ID NO.28所示；
DX05F：序列如SEQ ID NO.29所示，DX05R：序列如SEQ ID NO.30所示；
DX06F：序列如SEQ ID NO.31所示，DX06R：序列如SEQ ID NO.32所示；
DX07F：序列如SEQ ID NO.33所示，DX07R：序列如SEQ ID NO.34所示；
DX08F：序列如SEQ ID NO.35所示，DX08R：序列如SEQ ID NO.36所示；
DX09F：序列如SEQ ID NO.37所示，DX09R：序列如SEQ ID NO.38所示；
DX10F：序列如SEQ ID NO.39所示，DX10R：序列如SEQ ID NO.40所示；
DX11F：序列如SEQ ID NO.41所示，DX11R：序列如SEQ ID NO.42所示；
DX12F：序列如SEQ ID NO.43所示，DX12R：序列如SEQ ID NO.44所示；
DX13F：序列如SEQ ID NO.45所示，DX13R：序列如SEQ ID NO.46所示；
DX14F：序列如SEQ ID NO.47所示，DX14R：序列如SEQ ID NO.48所示；
DX15F：序列如SEQ ID NO.49所示，DX15R：序列如SEQ ID NO.50所示；
DX16F：序列如SEQ ID NO.51所示，DX16R：序列如SEQ ID NO.52所示；
DX17F：序列如SEQ ID NO.53所示，DX17R：序列如SEQ ID NO.54所示；
DX18F：序列如SEQ ID NO.55所示，DX18R：序列如SEQ ID NO.56所示；
DX19F：序列如SEQ ID NO.57所示，DX19R：序列如SEQ ID NO.58所示；
DX20F：序列如SEQ ID NO.59所示，DX20R：序列如SEQ ID NO.60所示。
上述微卫星标记或引物在三疣梭子蟹不同体重群体的遗传多样性分析中的应用。
本发明所提供的所述的微卫星标记可以用于三疣梭子蟹不同体重群体的遗传多样性分析，而且其具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，可以在三疣梭子蟹不同体重群体的遗传结构分析中得到应用。
本发明还提供了所述的微卫星标记在三疣梭子蟹不同体重群体的遗传结构分析中所采用的技术方案，以体重划分大小个体，然后进行遗传结构分析，具体步骤包括：
(a)提取待分析群体基因组DNA；
(b)以所述DNA为模板，采用所述的微卫星标记的引物进行分子标记检测；
(c)进行遗传多样性分析。
分析方法中：所述的分子标记检测是指采用20个微卫星标记的引物对DNA模板进行PCR扩增，其扩增体系为：
PCR扩增体系如下：
扩增程序为：
其中60℃退火具体是指：20个微卫星标记的引物退火温度均为60℃。
PCR扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果。
分析方法中：所述进行遗传多样性分析是指利用Popgene32对PCR检测的结果进行群体遗传分析，计算等位基因数(Number of Alleles,Na)、有效等位基因数(EffectiveNumber of Alleles,Ne),香农信息指数(Shannon's Diversity Index,I)，观测杂合度(Observed Heterozygosity,Ho)和期望杂合度(Expected Heterozygosity,He)，并计算各群体间Nei's遗传距离(Genetic distance，D)，基于D构建系统发育树。用PIC-CALC软件对各微卫星标记的多态信息含量(PIC)进行计算。
本发明提供的微卫星标记具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传连锁图谱的构建、QTL定位、品种鉴定、分子标记辅助育种、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有很好的应用价值。
附图说明
图1是实施例3中4个大小个体组遗传聚类分析结果。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1微卫星标记的获得
三疣梭子蟹购自黄骅三疣梭子蟹原种场，在无菌条件下取其肌肉组织，提取肌肉组织总RNA，送生物公司进行转录组测序，获得转录组数据；利用MISA软件对组装得到的长度在1kb以上的unigenes进行SSR的鉴定，识别标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的精确SSR标记的最小重复数分别为7、6、5、4次，利用SSRHunterl.3进行SSR标记的筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物。以筛选到的SSR使用Primer Permier 6进行引物设计；设计的主要参数设置为：引物长度18-25bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-60℃；GC含量一般在40-60％之间，尽量避免二级结构出现。最终筛选出的20对引物，序列信息如表1所示。
表1三疣梭子蟹微卫星标记的序列信息
实施例2利用微卫星标记对三疣梭子蟹不同体重群体遗传多样性的分析方法
(1)基因组DNA的提取：参照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提供的方法提取基因组总DNA。DNA的质量检测：取2μL基因组总DNA用质量比浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解以及是否有蛋白质残留；另外，将提取的DNA样品用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定其浓度，并以测得的DNA浓度为参考，将基因组总DNA样品统一稀释为100ng/μl。
(2)采用所述的微卫星标记进行分子标记检测：以步骤(1)得到的统一稀释后的基因组总DNA为模板，采用实施例1获得的20对引物对其进行PCR分型检测，其扩增体系和扩增条件如下所示，PCR扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酸胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果；通过与pBR322DNA/MspⅠmarker分子量标准对比估算扩增片段大小范围。
PCR反应程序如下：
(3)根据步骤(2)PCR分型检测结果及其位置确定基因型，利用Popgene32进行群体遗传分析，计算等位基因数(Number of Alleles,Na)、有效等位基因数(Effective Numberof Alleles,Ne),香农信息指数(Shannon's Diversity Index,I)，观测杂合度(ObservedHeterozygosity,Ho)和期望杂合度(Expected Heterozygosity,He)，并计算群体间Nei's遗传距离(Genetic distance，D)，基于D构建系统遗传树。用PIC-CALC软件对各微卫星标记的多态信息含量进行计算。
实施例3对三疣梭子蟹不同体重群体的遗传多样性分析的应用
分析群体分别是河北黄骅野生大个体组35只(YSD，体重：251.5-466.5g)，野生小个体组35只(YSX，体重：81-122.6g)；河北黄骅养殖大个体组35只(YZD，体重：120-192g)，养殖小个体组35只(YZX，体重：75.7-118.6g)。所有大个体组成大个群体(DQ，70只)，所有小个体组成小个群体(XQ，70只)。三疣梭子蟹样品共140只，按照实施例2中的第(1)提取各样品的基因组总DNA，以基因组总DNA为扩增模板，以实施例1获得的20对微卫星引物进行PCR分型检测，扩增体系、扩增条件和具体扩增步骤同实施例2的第(2)步，得到扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酞胺凝胶分离，经银染染色，记录扩增结果，并检测扩增产物的片段大小。其中部分扩增片段分别如SEQ ID N0：41(采用DX01引物扩增)，SEQ ID N0：42(采用DX02引物扩增)，SEQ ID N0：43(采用DX03引物扩增)，SEQ ID N0：44(采用DX04引物扩增)，SEQID N0：45(采用DX05引物扩增)，SEQ ID N0：46(采用DX06引物扩增)，SEQ ID N0：47(采用DX07引物扩增)，SEQ ID N0：48(采用DX08引物扩增)，SEQ ID N0：49(采用DX09引物扩增)，SEQ ID N0：50(采用DX10引物扩增)，SEQ ID N0：51(采用DX11引物扩增)，SEQ ID N0：52(采用DX12引物扩增)，SEQ ID N0：53(采用DX13引物扩增)，SEQ ID N0：54(采用DX14引物扩增)，SEQ ID N0：55(采用DX15引物扩增)，SEQ ID N0：56(采用DX16引物扩增)，SEQ ID N0：57(采用DX17引物扩增)，SEQ ID N0：58(采用DX18引物扩增)，SEQ ID N0：59(采用DX19引物扩增)，SEQ ID N0：60(采用DX20引物扩增)。
用20个微卫星标记对不同体重群体的三疣梭子蟹进行了遗传多样性分析，所有的微卫星标记都显示足够的多态性，扩增后各个标记等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)，香农信息指数(I)，观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)，如表2，表3所示。在表2中，20个三疣梭子蟹的微卫星标记扩增获得275个等位基因，5≤Na≤36，平均每个标记的等位基因数是13.75。Ne在2.1157-19.8783之间，平均值为7.2647；Ho在0.3623-0.9286之间，平均为0.7303；He在0.5311-0.9565之间，平均值为0.8067；I在0.9813-3.2302之间，平均值为2.0214。20个标记的多态信息含量PIC值介于0.4712-0.9474之间，平均值为0.7774，表明20个标记多态性高，能够为遗传多样性分析提供丰富的信息。以上数据显示，三疣梭子蟹大个群体的遗传多样性水平较高。
表2三疣梭子蟹大个群体20个微卫星标记的遗传参数
| Locus | Na | Ne | Ho | He | I | PIC |
| DX01 | 19 | 12.2961 | 0.5143 | 0.9253 | 2.6843 | 0.9130 |
| DX02 | 19 | 10.4034 | 0.9 | 0.9104 | 2.5562 | 0.8963 |
| DX03 | 36 | 19.8783 | 0.8 | 0.9565 | 3.2302 | 0.9474 |
| DX04 | 25 | 8.3333 | 0.9286 | 0.8863 | 2.5332 | 0.8696 |
| DX05 | 8 | 5.6322 | 0.8571 | 0.8284 | 1.8724 | 0.8003 |
| DX06 | 18 | 11.2514 | 0.5429 | 0.9177 | 2.6002 | 0.9045 |
| DX07 | 6 | 3.3243 | 0.8 | 0.7042 | 1.3638 | 0.6482 |
| DX08 | 18 | 10.3704 | 0.8714 | 0.9101 | 2.5358 | 0.8958 |
| DX09 | 15 | 8.3333 | 0.8571 | 0.8863 | 2.365 | 0.8693 |
| DX10 | 8 | 4.018 | 0.7429 | 0.7565 | 1.5822 | 0.7133 |
| DX11 | 5 | 2.287 | 0.5571 | 0.5668 | 1.066 | 0.5157 |
| DX12 | 29 | 14.0858 | 0.3623 | 0.9358 | 2.9475 | 0.9248 |
| DX13 | 11 | 5.481 | 0.7714 | 0.8234 | 1.9575 | 0.7959 |
| DX14 | 5 | 2.1157 | 0.4286 | 0.5311 | 0.9813 | 0.4712 |
| DX15 | 11 | 7.3851 | 0.4143 | 0.8708 | 2.1125 | 0.8495 |
| DX16 | 7 | 3.775 | 0.8429 | 0.7404 | 1.4803 | 0.6885 |
| DX17 | 7 | 2.7715 | 0.7857 | 0.6438 | 1.3825 | 0.6109 |
| DX18 | 8 | 4.4505 | 0.9286 | 0.7809 | 1.7119 | 0.7463 |
| DX19 | 12 | 5.3002 | 0.8429 | 0.8172 | 1.9119 | 0.7875 |
| DX20 | 8 | 3.8014 | 0.8571 | 0.7422 | 1.553 | 0.7003 |
| Mean | 13.75 | 7.2647 | 0.7303 | 0.8067 | 2.0214 | 0.7774 |
在表3中，20个三疣梭子蟹的微卫星标记扩增获得265个等位基因，4≤Na≤32；平均每个标记的等位基因数是13.25。Ne在1.9148-16.5541之间，平均值为6.6601；Ho在0.4571-0.9857之间，平均为0.7343；He在0.4812-0.9464之间，平均值为0.7973；I在1.0404-3.0186之间，平均值为1.964。20个标记的多态信息含量PIC值介于0.4553-0.9364之间，平均值为0.7665，表明20个标记多态性高，能够为遗传多样性分析提供丰富的信息。以上数据显示，三疣梭子蟹小个群体的遗传多样性水平较高。
对比大小个群体遗传参数可知，大个群体的遗传多样性略高于小个群体，即三疣梭子蟹大个体的遗传多样性高于小个体，说明大个体可从形态学上为三疣梭子蟹良种选育提供参考。
表3三疣梭子蟹小个群体20个微卫星标记的遗传参数
| Locus | Na | Ne | Ho | He | I | PIC |
| DX01 | 18 | 11.4352 | 0.6286 | 0.9191 | 2.6316 | 0.9062 |
| DX02 | 17 | 9.561 | 0.9429 | 0.9018 | 2.4618 | 0.8864 |
| DX03 | 27 | 16.5541 | 0.9286 | 0.9464 | 3.0186 | 0.9364 |
| DX04 | 24 | 5.8091 | 0.8429 | 0.8338 | 2.2439 | 0.8106 |
| DX05 | 9 | 4.8467 | 0.7571 | 0.7994 | 1.8324 | 0.7713 |
| DX06 | 18 | 9.3156 | 0.6143 | 0.8991 | 2.4772 | 0.8836 |
| DX07 | 6 | 3.0425 | 0.7143 | 0.6762 | 1.3018 | 0.6194 |
| DX08 | 17 | 7.974 | 0.8286 | 0.8809 | 2.3222 | 0.8622 |
| DX09 | 15 | 7.7287 | 0.7714 | 0.8769 | 2.286 | 0.8583 |
| DX10 | 9 | 4.3115 | 0.8286 | 0.7736 | 1.6135 | 0.7308 |
| DX11 | 4 | 2.5135 | 0.5857 | 0.6065 | 1.1008 | 0.5486 |
| DX12 | 32 | 14.4118 | 0.4571 | 0.9373 | 2.989 | 0.9267 |
| DX13 | 8 | 4.1368 | 0.7143 | 0.7637 | 1.6376 | 0.7224 |
| DX14 | 5 | 2.5974 | 0.4857 | 0.6194 | 1.1421 | 0.5456 |
| DX15 | 11 | 7.7963 | 0.4571 | 0.878 | 2.1742 | 0.8583 |
| DX16 | 7 | 3.8628 | 0.8286 | 0.7465 | 1.4981 | 0.6956 |
| DX17 | 7 | 1.9148 | 0.5571 | 0.4812 | 1.0404 | 0.4553 |
| DX18 | 9 | 5.4841 | 0.9857 | 0.8235 | 1.8687 | 0.7947 |
| DX19 | 14 | 6.1404 | 0.9 | 0.8432 | 2.0924 | 0.8184 |
| DX20 | 8 | 3.7663 | 0.8571 | 0.7398 | 1.548 | 0.6983 |
| Mean | 13.25 | 6.6601 | 0.7343 | 0.7973 | 1.964 | 0.7665 |
4个大小个体组间的UPGMA聚类结果如图1所示，黄骅野生大个体(YSD)和黄骅野生小个体(YSX)聚为一类；黄骅养殖大个体(YZD)和黄骅养殖小个体(YZX)聚为一类；这与各样品组所属类群一致(即养殖和野生分别聚类)。4个大小个体组间的Nei氏遗传距离和遗传分化指数(Fst)如表4所示：遗传分化指数Fst值介于0.001-0.032，均小于0.05；Nei's遗传距离D值位于0.0694-0.1875之间，平均值为0.1382；表明4个大小个体组间无遗传分化，未表现出遗传差异。
大小个群体间的Nei氏遗传距离和遗传分化指数(Fst)如表5所示：两群体间的遗传分化指数Fst＝0.02，小于0.05；Nei's遗传距离D＝0.0468；表明大小个群体间也没有出现遗传分化的现象。
表4 4个大小个体组间的Fst值(对角线下)和Nei's遗传距离D值(对角线上)矩阵
表5大小个群体间的Fst值(对角线下)和Nei's遗传距离D值(对角线上)矩阵
由此以上分析结果可以说明，本发明提供的微卫星标记可以用于三疣梭子蟹大小个体遗传多样性以及遗传结构的分析，而且本发明提供的微卫星标记具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，具有很好的应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的仟何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河北大学
<120> 三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 147
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 1
ccggcaacac tggtaaacac tctccaaaca catccagaac atgcttatac acacacacac 60
acacacacac acacacacac acacagtgaa gtgttatatt attaacagtt ttcagcagca 120
ccaagcaaca agcggaagtc ggcttta 147
<210> 2
<211> 124
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 2
cgtttgtaag cctgtgagcg tctagaagcg taaatacgta cgtacacaca cacacacaca 60
cacacacaca cacacacaag cattcatatg tagaaaagtg tgtgtgtaat tcacctcggt 120
cgcc 124
<210> 3
<211> 202
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 3
cgctgcacgt tttgagaagt caaggaaacg tcgaaaggtc gtctggcgaa ttgttatcac 60
cacggccctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttacc 120
tagttctaat atacaggcac ttccctccat tcacatcttc ctcttctggt ttctattagc 180
ctgtgtcagt gagccgggtt ta 202
<210> 4
<211> 194
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 4
agggtgctct gataacagct gatatcatga agccatctgc cactgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtaa ggtaggtgat gcatgtataa 120
gcaggtacta tagttagccc tgtactagac gcttaatgaa tgtttacaag actgccggga 180
tgactgctga gttt 194
<210> 5
<211> 146
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 5
gtgggccgcc aatatcacta tttcaccctg ccaaatgatg acgagaatgt tacctatatg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtaaaggaa caaagggtat ggtagaaagc atagaggatt 120
agatacttgg gtgcaagtgg tggatt 146
<210> 6
<211> 188
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 6
gcggcagcaa gactagtagt agtaacagta gaagcaacga acgatatctt aattggcaac 60
aacaaagtaa attatgtggt ggagctacac acacacacac acacacacac acacacacac 120
acacggatgc acgcacgaac acacgcaaca cagagccgcc ggtcgttacg gacatcctcg 180
tgaaccaa 188
<210> 7
<211> 123
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 7
cgtgcatccg tgtgtttgtt tatcagagag caggactgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtcag 60
ctgggagagg cgaggttgct cagtccgccg ctcgctctca caccaactcg gcgaaaagat 120
ggc 123
<210> 8
<211> 164
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 8
cacgaagttt cttgggcgtc catcttggca ctcctcacac acacacacac acacacacac 60
acacacacac acacacacac acacacacac agcgtggtag tgtcagcggt gggcgtggtg 120
ggcgtggtgt tccctgaggg tgtggagggt ggtggtgagt tgag 164
<210> 9
<211> 150
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 9
taggcatggg atgggtgaga aacaaagtta gacaccaata caaatctctc tctcacacac 60
acacacacac acacacacac acacacaaag cctcttttcc agtcaaattc agatacctca 120
ttcagaacaa ctcaacaaca ctccttcccg 150
<210> 10
<211> 125
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 10
aatcacaacc cagccgcata tcaccagcag gccagcagct gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtaaacaa acagtaccct cgggcctcga cattcttcct cgtgcccgca tctctccttc 120
gttgt 125
<210> 11
<211> 110
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 11
tgtgagccaa gccttgtgat ggtgtgtggt aacccttcct cctccctgct gctgctgctg 60
ctgctggtga ctggagagtg tgtgtggcaa ggcttccagc agtggttagt 110
<210> 12
<211> 178
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 12
tgtgagtgtg tagacgtctc cttgaaataa gtaaataagt gcaatatagg aaaaaagaaa 60
aaaagatgat ttgataactg cattagacaa atattacaca cacacacaca cacacacaca 120
cacacacaca cacagaaata cagtttttca tatagaattg tcgaagctcg gaatacgt 178
<210> 13
<211> 169
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 13
ttgtttgctg gtcaccaagc cagccttcct cattaaagag cgagctcaga gctgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtctc ggggcggcgt cgggcagtca gtcagctgtt gtgtacaaag 120
aaaaaatcga tataggtcgt agcgttcacc caggataggc ctacacgtg 169
<210> 14
<211> 154
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 14
cccgctaccc cataactcac tgcacaaagg ggagggcgcc aggaatccgc cggtggacaa 60
cgtaccaggc gtgaggtgcg gaggtgttag acgtggtggt ggtggtggtg gtgggaagat 120
atgtacagat tggatatggc tgtggggagg aaga 154
<210> 15
<211> 209
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 15
cgtcccatca tctgacaaag gaaaggagga caaggagaag aaagagagag ggaaagagaa 60
agagagatgg aagaagaggg tgaaagataa gaggaggagg aggaggagga agaagaagaa 120
gatgaatagg atgaagtaaa agaaatacaa gagaatgaga tgtaagaatt ggaggaggaa 180
aacaaaagaa aagaggaaga ggtgaagga 209
<210> 16
<211> 119
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 16
gaggcaagca agttaaccat taggccacga ggttctggga agacggggct gtctatagga 60
ggagaggctg taggtctgtg cgtgtgtgtg tgtgttggta ggatgaggta accaggaag 119
<210> 17
<211> 147
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 17
gctgtgtgtg tgtggatctg tatatatgga ataaaaacct atacagacac acacagagaa 60
ccttaagagt tatcatacac ccaatacaca cacacacaca cactacaccc ttacaagcat 120
agaacattcc aatacaccca cctagtc 147
<210> 18
<211> 122
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 18
gcccttaagt ccacataaac tccacctgta ctctctctct ctctctctct ctcgctctca 60
tttctctcac ccttcagaaa gtttccatca cctgggaagg aaatcagtta cgccactttc 120
ac 122
<210> 19
<211> 160
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 19
cacactcgtt gcagacacta cttcatttaa actgttccac gtctcaatac atctttgagg 60
gaaactatat cttttaacat ctctcagact tcttcctgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt 120
ttagcaggat tcattgtcca aagcaccgag taagtaacag 160
<210> 20
<211> 143
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 20
ccgaagattg gtctttaagc tctgagctcg ctccgtaatg gggaaggctg gctcggtgac 60
cagcatgcga ctgaagtgaa ttacacacac acacacacac acctgttagt gttgccagca 120
gcgtcattga tagggagaga ata 143
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccggcaacac tggtaaacac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taaagccgac ttccgcttgt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgtttgtaag cctgtgagcg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggcgaccgag gtgaattaca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgctgcacgt tttgagaagt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taaacccggc tcactgacac 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agggtgctct gataacagct g 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaactcagca gtcatcccgg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtgggccgcc aatatcacta 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aatccaccac ttgcacccaa 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcggcagcaa gactagtagt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttggttcacg aggatgtccg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgtgcatccg tgtgtttgtt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gccatctttt cgccgagttg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cacgaagttt cttgggcgtc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctcaactcac caccaccctc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
taggcatggg atgggtgaga 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgggaaggag tgttgttgag t 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aatcacaacc cagccgcata 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acaacgaagg agagatgcgg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgtgagccaa gccttgtgat 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
actaaccact gctggaagcc 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tgtgagtgtg tagacgtctc c 21
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acgtattccg agcttcgaca 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ttgtttgctg gtcaccaagc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cacgtgtagg cctatcctgg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cccgctaccc cataactcac 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tcttcctccc cacagccata 20
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cgtcccatca tctgacaaag g 21
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tccttcacct cttcctcttt tct 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gaggcaagca agttaaccat tag 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cttcctggtt acctcatcct acc 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gctgtgtgtg tgtggatctg tat 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gactaggtgg gtgtattgga atg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gcccttaagt ccacataaac tcc 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gtgaaagtgg cgtaactgat ttc 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cacactcgtt gcagacacta ctt 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctgttactta ctcggtgctt tgg 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ccgaagattg gtctttaagc tct 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tattctctcc ctatcaatga cgc 23
Claims (6)
1.一种三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记，其特征在于，包括：
微卫星标记DX01，其序列如SEQ ID NO.1所示；
微卫星标记DX02，其序列如SEQ ID NO.2所示；
微卫星标记DX03，其序列如SEQ ID NO.3所示；
微卫星标记DX04，其序列如SEQ ID NO.4所示；
微卫星标记DX05，其序列如SEQ ID NO.5所示；
微卫星标记DX06，其序列如SEQ ID NO.6所示；
微卫星标记DX07，其序列如SEQ ID NO.7所示；
微卫星标记DX08，其序列如SEQ ID NO.8所示；
微卫星标记DX09，其序列如SEQ ID NO.9所示；
微卫星标记DX10，其序列如SEQ ID NO.10所示；
微卫星标记DX11，其序列如SEQ ID NO.11所示；
微卫星标记DX12，其序列如SEQ ID NO.12所示；
微卫星标记DX13，其序列如SEQ ID NO.13所示；
微卫星标记DX14，其序列如SEQ ID NO.14所示；
微卫星标记DX15，其序列如SEQ ID NO.15所示；
微卫星标记DX16，其序列如SEQ ID NO.16所示；
微卫星标记DX17，其序列如SEQ ID NO.17所示；
微卫星标记DX18，其序列如SEQ ID NO.18所示；
微卫星标记DX19，其序列如SEQ ID NO.19所示；
微卫星标记DX20，其序列如SEQ ID NO.20所示。
2.一种三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记的引物，其特征在于，包括20对微卫星引物，分别是：
DX01F：序列如SEQ ID NO.21所示，DX01R：序列如SEQ ID NO.22所示；
DX02F：序列如SEQ ID NO.23所示，DX02R：序列如SEQ ID NO.24所示；
DX03F：序列如SEQ ID NO.25所示，DX03R：序列如SEQ ID NO.26所示；
DX04F：序列如SEQ ID NO.27所示，DX04R：序列如SEQ ID NO.28所示；
DX05F：序列如SEQ ID NO.29所示，DX05R：序列如SEQ ID NO.30所示；
DX06F：序列如SEQ ID NO.31所示，DX06R：序列如SEQ ID NO.32所示；
DX07F：序列如SEQ ID NO.33所示，DX07R：序列如SEQ ID NO.34所示；
DX08F：序列如SEQ ID NO.35所示，DX08R：序列如SEQ ID NO.36所示；
DX09F：序列如SEQ ID NO.37所示，DX09R：序列如SEQ ID NO.38所示；
DX10F：序列如SEQ ID NO.39所示，DX10R：序列如SEQ ID NO.40所示；
DX11F：序列如SEQ ID NO.41所示，DX11R：序列如SEQ ID NO.42所示；
DX12F：序列如SEQ ID NO.43所示，DX12R：序列如SEQ ID NO.44所示；
DX13F：序列如SEQ ID NO.45所示，DX13R：序列如SEQ ID NO.46所示；
DX14F：序列如SEQ ID NO.47所示，DX14R：序列如SEQ ID NO.48所示；
DX15F：序列如SEQ ID NO.49所示，DX15R：序列如SEQ ID NO.50所示；
DX16F：序列如SEQ ID NO.51所示，DX16R：序列如SEQ ID NO.52所示；
DX17F：序列如SEQ ID NO.53所示，DX17R：序列如SEQ ID NO.54所示；
DX18F：序列如SEQ ID NO.55所示，DX18R：序列如SEQ ID NO.56所示；
DX19F：序列如SEQ ID NO.57所示，DX19R：序列如SEQ ID NO.58所示；
DX20F：序列如SEQ ID NO.59所示，DX20R：序列如SEQ ID NO.60所示。
3.一种权利要求1所述微卫星标记或权利要求2所述的引物在三疣梭子蟹不同体重群体的遗传多样性分析中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下方法分析，具体步骤包括：
(a)提取待分析群体基因组DNA；
(b)以所述基因组DNA为模板，采用权利要求2所述的微卫星标记的引物进行PCR分子标记检测；
(c)进行遗传结构分析。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR的反应体系为20μL，包括：10μL 2× Es Taq Master Mix，2μL浓度为100 ng/μL的DNA模板、2 μL浓度为2.5 μmol/L的上游引物、2 μL浓度为2.5μmo1/L的下游引物，其余用RNase-Free Water补齐。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述PCR分子标记检测的扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃终延伸10min。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202010862579.8A CN112080567B (zh) | 2020-08-25 | 2020-08-25 | 三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用 |
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| JP2009207486A (ja) * | 2008-02-04 | 2009-09-17 | House Foods Corp | カニ検出用プライマーセット |
| CN107937395A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-04-20 | 汕头大学 | 一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记及鉴定方法与应用 |
-
2020
- 2020-08-25 CN CN202010862579.8A patent/CN112080567B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112080567A (zh) | 2020-12-15 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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