CN112029868A - 三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用，微卫星标记包括DX05，DX07，DX09，DX10，DX14，DX15，DX16，DX19；本发明提供的微卫星标记多态性高，PCR扩增稳定，可用于三疣梭子蟹生长性状的关联分析，并辅助三疣梭子蟹分子标记育种。

Description

三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用
技术领域
本发明涉及三疣梭子蟹生物学遗传育种领域，具体地说是一种三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用。
背景技术
SSR(Simple sequence repeat)即简单序列重复，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，广泛分布于真核生物基因组中，它以少数几个(1-6bp)短核苷酸为基本单位，首尾相连组成串联重复的DNA序列，即核心序列。核心序列重复次数越多，其等位基因数量就越多，多态性也就越丰富。位于核心序列两端的侧翼序列是相对保守的单拷贝序列，可根据其特性设计特异性引物，用于扩增微卫星序列。
与其他分子标记如扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性(RAPD)等分子标记技术相比较，SSR标记具有以下特点：①广泛分布于真核生物基因组中，大约每隔10-15kb就存在一个微卫星位点；②数量多，多态性丰富；③具有多等位基因的特性，信息含量大；④呈共显性遗传，即能区分纯合子和杂合子；⑤等位基因的分离遵循孟德尔规律；⑥实验操作简单、结果稳定可靠；⑦基于PCR技术，可实现自动化检测；⑧具有连锁不平衡现象；⑨重复性较好。微卫星标记技术已广泛地应用于生物遗传连锁图谱构建、遗传多样性分析，QTL定位、分子标记辅助育种和种质资源鉴定等方面。
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国水产养殖的重要经济蟹类，主要分布在中国的辽宁、河北、山东、江苏、福建，日本以及韩国等海域。其生长迅速、肉味鲜美、营养丰富，具有较高的商业价值。近年来，过度捕捞和环境污染使三疣梭子蟹野生资源减少，而且养殖过程中病害频发。三疣梭子蟹野生资源的减少使可选育的优质亲本数量下降，养殖规模缩小。因此，开发针对三疣梭子蟹生长性状关联分析的微卫星标记，采用分子遗传标记的手段分析三疣梭子蟹种质资源现状，筛选与生长性状关联的微卫星标记并利用这些标记进行育种，这对了解三疣梭子蟹的遗传多样性、保护和开发利用其野生资源、选育良种以及保育原种非常重要，对生物多样性的保护和生物资源的可持续利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是提供一种三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用，以提供一套与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记，为三疣梭子蟹种质资源现状的调查研究以及分子生物学育种提供依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种三疣梭子蟹微卫星标记，包括微卫星标记DX05、DX07、DX09、DX10、DX14、DX15、DX16和DX19；
所述微卫星标记DX05与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.1所示；
所述微卫星标记DX07与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.2所示；
所述微卫星标记DX09与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.3所示；
所述微卫星标记DX10与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.4所示；
所述微卫星标记DX14与三疣梭子蟹的体高和体重性状相关联，其序列如SEQ IDNO.5所示；
所述微卫星标记DX15与三疣梭子蟹的背甲宽和体高性状相关联，其序列如SEQ IDNO.6所示；
所述微卫星标记DX16与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.7所示；
所述微卫星标记DX19与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.8所示。
一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物，包括8对微卫星引物，分别为：
DX05F：序列如SEQ ID NO.9所示，DX05R：序列如SEQ ID NO.10所示；
DX07F：序列如SEQ ID NO.11所示，DX07R：序列如SEQ ID NO.12所示；
DX09F：序列如SEQ ID NO.13所示，DX09R：序列如SEQ ID NO.14所示；
DX10F：序列如SEQ ID NO.15所示，DX10R：序列如SEQ ID NO.16所示；
DX14F：序列如SEQ ID NO.17所示，DX14R：序列如SEQ ID NO.18所示；
DX15F：序列如SEQ ID NO.19所示，DX15R：序列如SEQ ID NO.20所示；
DX16F：序列如SEQ ID NO.21所示，DX16R：序列如SEQ ID NO.22所示；
DX19F：序列如SEQ ID NO.23所示，DX19R：序列如SEQ ID NO.24所示。
一种上述的微卫星标记或引物在三疣梭子蟹生长性状关联分析以及三疣梭子蟹分子育种中的应用。其采用的分析方法具体步骤包括：(a)提取待分析群体基因组DNA；(b)以所述DNA为模板，采用所述的微卫星标记引物进行微卫星标记检测：(c)进行生长性状关联分析。
在扩增待测样品时，若采用微卫星标记DX05引物能够扩增AB(146bp，152bp)、AC(146bp，174bp)、BB(152bp，152bp)、BC(152bp，174bp)和CD(174bp，188bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC和CD相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX07引物能够扩增AA(122bp，122bp)、AB(122bp，126bp)、AC(122bp，130bp)、BB(126bp，126bp)和BC(126bp、130bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB和BC相关联的背甲宽、背甲长和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX09引物能够扩增出AB(141bp，149bp)、AC(141bp，155bp)、BB(149bp，149bp)、BC(149bp，155bp)和CC(155bp，155bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX10引物能够扩增出AB(118bp，124bp)和BB(124bp，124bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB和AC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX14引物能够扩增出AB(148bp，154bp)、BB(154bp，154bp)、BD(154bp，169bp)、CD(157bp，169bp)和DD(169bp，169bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、BB、BD、CD和DD相关联的体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX15引物能够扩增出AA(203bp，203bp)、AB(203bp，215bp)、AC(203bp，221bp)、BB(215bp，215bp)、BC(215bp，221bp)和CC(221bp，221bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX16引物能够扩增出AA(112bp，112bp)、AB(112bp，118bp)、AC(112bp，120bp)、BB(118bp，118bp)、BC(118bp，120bp)和CC(120bp，120bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX19引物能够扩增出AC(169bp，181bp)、BB(175bp，175bp)、BC(175bp，181bp)和CC(181bp，181bp)基因型，表明待测样品为与基因型AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
以体重划分大小个体，并进行生长性状关联分析，其中，在与三疣梭子蟹大个群体关联分析中，微卫星标记DX05，DX09，DX10，DX15，DX16和DX19均与背甲宽、背甲长、体高和体重生长性状关联；DX07与背甲宽、背甲长和体重生长性状关联；DX14与体高和体重生长性状关联。
在与三疣梭子蟹小个群体关联分析中，微卫星标记DX15与背甲宽和体高生长性状关联；DX19与背甲宽、背甲长和体重生长性状关联。
本发明提供的微卫星标记具有PCR扩增结果稳定的特点，可用于三疣梭子蟹生长性状关联分析，并可以辅助三疣梭子蟹分子标记育种。
附图说明
图1是本发明三疣梭子蟹形态参数测量部位示意图。
图2是DX05标记对养殖小个体三疣梭子蟹样本DNA扩增后的电泳图。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1三疣梭子蟹大小个体样本的来源以及生长性状表型值的测量
采集河北黄骅三疣梭子蟹野生大个体组35只(YSD，体重：251.5-466.5g)，野生小个体组35只(YSX，体重：81-122.6g)；河北黄骅养殖大个体组35只(YZD，体重：120-192g)，养殖小个体组35只(YZX，体重：75.7-118.6g)。所有大个体组成大个群体(DQ，70只)，所有小个体组成小个群体(XQ，70只)。对每个三疣梭子蟹样本进行生长性状的测量，测量指标包括背甲宽(BJK)、背甲底宽(BDK)、背甲长(BJC)、第一侧棘宽(1CJ)、大鳌不动指节长(BZC)、鳌肢掌节长(AZC)、鳌肢长节长(ACC)、第一侧棘宽(1CJ)、第二侧棘宽(2CJ)、体高(TH)和体重(TZ)11个可量性状。三疣梭子蟹形态参数测量部位示意图如图1所示。
实施例2三疣梭子蟹样本肌肉总DNA的提取
采用海洋动物基因组提取试剂盒提取肌肉总DNA，具体步骤如下：
(1)切取不多于30mg的组织材料，放入装有200μL GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15s。
(2)加入20μL Proteinase K(20mg/mL)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置l0min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤7。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
(11)DNA的质量检测：取2μL基因组总DNA用质量比浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解以及是否有蛋白质残留；另外，将提取的DNA样品用Nano Drop 2000分光光度计测定其浓度，并以测得的DNA浓度为参考，将基因组总DNA样品统一稀释为100ng/μl。
实施例3微卫星引物的开发
(1)三疣梭子蟹购自黄骅三疣梭子蟹原种场，在无菌条件下取其肌肉组织，提取肌肉组织总RNA，送生物公司进行转录组测序，获得转录组数据；利用MISA软件对组装得到的长度在l kb以上的unigenes进行SSR的鉴定，识别标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的精确SSR标记的最小重复数分别为7、6、5、4次，利用SSR Hunter l.3进行SSR标记的筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物。以筛选到的SSR使用Primer Permier6进行引物设计；设计的主要参数设置为：引物长度18-25bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度为55-60℃；GC含量一般在40-60％之间，尽量避免二级结构出现。
(2)对所合成引物进行梯度PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳初步筛选，并确定每对引物的最适返火温度，选取能扩增出单一清晰条带的引物。
实施例4SSR分子标记多态性的筛选
(1)随机选取实施例2得到的35个样本统一稀释后的基因组总DNA为模板，采用实施例3筛选出的引物对其进行PCR分型检测，其扩增体系和扩增条件如下所示，PCR扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果；通过与pBR322DNA/Msp I marker分子量标准对比估算扩增片段大小范围。
PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002648477240000061
PCR反应程序如下：
Figure BDA0002648477240000062
(2)根据步骤(1)PCR分型检测结果及其位置确定基因型，各标记的序列信息见表1。
表1三疣梭子蟹微卫星标记的序列信息
Figure BDA0002648477240000063
Figure BDA0002648477240000071
实施例5三疣梭子蟹生长性状显著相关的SSR分子标记在分子育种中的应用
(1)采集河北黄骅三疣梭子蟹野生大个体组35只(YSD，体重：251.5-466.5g)，野生小个体组35只(YSX，体重：81-122.6g)；河北黄骅养殖大个体组35只(YZD，体重：120-192g)，养殖小个体组35只(YZX，体重：75.7-118.6g)。所有大个体组成大个群体(DQ，70只)，所有小个体组成小个群体(XQ，70只)。
对每个三疣梭子蟹样品进行生长性状的测量，测量指标包括背甲宽(BJK)、背甲底宽(BDK)、背甲长(BJC)、第1步足长节长(1CC)、大鳌不动指节长(BZC)、鳌肢掌节长(AZC)、鳌肢长节长(ACC)、第一侧棘宽(1CJ)、第二侧棘宽(2CJ)、体高(TH)和体重(TZ)11个可量生长性状。
(2)基因组DNA的提取：具体步骤同实施例2；
(3)利用分子标记DX05，DX07，DX09，DX10，DX14，DX15，DX16和DX19对所有三疣梭子蟹个体进行基因分型，部分结果如图2所示，图2是DX05标记对养殖小个体三疣梭子蟹样本DNA扩增后的电泳图。
(4)逐个分析标记时，剔除该位点基因型信息不全的样本，样本数少于3的基因型缺少统计意义，一并去除。应用SPSS22软件，采用一般线性模型(General Linear Model，GLM)，以微卫星标记DX05，DX07，DX09，DX10，DX14，DX15，DX16和DX19在三疣梭子蟹中的基因分型为自变量，生长性状背甲宽、背甲底宽、背甲长、第1步足长节长、大鳌不动指节长、鳌肢掌节长、鳌肢长节长、第一侧棘宽、第二侧棘宽、体高和体重为因变量，利用Duncan法进行标记不同基因型间的多重比较，结果如表2，表3所示。
在三疣梭子蟹大个群体多重比较中(表2)，位点DX05的AB、AC、BB和BC基因型个体的各性状均值与CD基因型个体的差异显著；其中AC与CD基因型个体性状差异最大，各性状分别相差41.179mm(背甲宽)、18.125mm(背甲长)、10.297(体高)mm、166.243g(体重)，说明等位基因A优于等位基因D，对背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状具有正向效应(即促进性状生长)。
在标记DX07中，就背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状而言，AB基因型与AC基因型个体差异显著，与AA基因型和BB基因型个体无显著差异；BC基因型与AC基因型个体性状差异显著；AC基因型个体各性状的均值大于AB基因型和BC基因型，推测等位基因A和C对背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状的正向效应优于等位基因B。但由于标记DX07与体高关联性不显著(表4)，所以标记DX07可作为以背甲宽，背甲长和体重3个生长性状为选育目标的分子标记。
在标记DX09中，AB基因型个体的背甲宽，体高和体重3个生长性状与CC基因型个体差异极显著，且AB基因型个体各性状均值与CC基因型个体各性状均值之间的差值最大，分别相差28.892mm(背甲长)，8.046mm(体高)，132.293g(体重)；就背甲长而言，AB基因型与AC基因型个体差异显著，BC基因型与CC基因型个体差异显著；而且性状均值存在：AB>AC，BC>CC；推测等位基因B对背甲长的正向效应优于等位基因C。
在标记DX10中只有两种基因型AB和BB，两基因型之间个体各性状差异显著，BB基因型各性状的均值大于AB基因型；推测等位基因B对背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状具有正向效应，也可能是等位基因A对4个生长性状具有抑制作用。
在标记DX14中，BD基因型与DD基因型个体各性状差异极显著，而且BD基因型个体各性状均值均大于DD基因型，推测等位基因B对背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状的正向效应优于等位基因D。但由于标记DX14与背甲长和背甲长关联性不显著，所以标记DX14可作为以体高和体重3个生长性状为选育目标的分子标记。
在标记DX15中，就背甲宽和背甲长而言，AA基因型与CC基因型个体差异极显著，AB基因型与BC基因型个体差异显著，各性状均值存在：AA>CC，AB>BC；推测等位基因A对背甲宽和背甲长具有正向效应。
在标记DX16中，AB基因型和AC基因型个体各性状差异极显著，其中AC基因型个体各性状均值均大于AB基因型；BC基因型个体的背甲宽和背甲长性状与BB基因型个体差异显著，而且BC基因型个体背甲宽和背甲长性状的均值大于BB基因型个体，推测等位基因C对背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状的正向效应优于等位基因B。另外，标记DX16与各生长性状极显著关联(表4)，因此可以作为以背甲宽，背甲长，体高和体重4个重要生长性状为选育目标的有效标记。
在标记DX19中，AC基因型个体各生长性状与BB基因型和BC基因型个体差异极显著，BB和BC之间无差异；就4个生长性状而言，AC基因型个体的均值均大于BB和BC基因型个体；又由于标记DX19与4个生长性状关联显著，所以可将DX19作为以背甲宽，背甲长，体高和体重4个重要生长性状为选育目标的有效标记，将AC基因型个体的三疣梭子蟹作为良种选育的亲本进行繁殖育种。
在三疣梭子蟹小个群体关联分析中(表3)，只有标记DX15和DX19与生长性状关联，其中标记DX15与背甲宽和体高关联显著；标记DX19与背甲宽和背甲长关联显著，与体重关联极显著(表4)。在标记DX15中，就背甲宽而言，AA和AB基因型个体与CC基因型个体差异极显著，AA基因型个体与BB和BC基因型个体差异显著；就体高而言，AA基因型个体与AC、BB和CC基因型个体差异极显著。因为AA基因型个体的背甲宽和体高性状均值大于其他基因型个体，故推测AA基因型个体可能是良种选育中的理想亲本。在标记DX19中，就背甲宽、背甲长和体重3个生长性状而言，AC基因型个体与BB、BC和CC基因型个体差异显著，而BB、BC和CC基因型个体之间无差异；又因为AC基因型个体性状的均值均大于其他3个基因型个体；故推测AC基因型个体可能是良种选育中的理想亲本。
综上所述，8个微卫星标记(DX05，DX07，DX09，DX10，DX14，DX15，DX16和DX19)与三疣梭子蟹大小个体的4个生长性状有不同程度的关联，可作为三疣梭子蟹良种选育中以背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状为选育目标的理想标记。其中微卫星标记DX15和DX19在大小个体均有出现，与背甲宽，背甲长，体高和体重4个生长性状有不同程度的关联性，因此可将这两个标记作为三疣梭子蟹良种选育的候选标记应用于育种实践。另外，标记DX15中的AA基因型个体以及标记DX19中的AC基因型个体可作为三疣梭子蟹良种选育的理想亲本应用于实践进行繁殖育种。
表2 8个微卫星标记不同基因型在三疣梭子蟹大个群体不同表型中的多重比较
Figure BDA0002648477240000091
Figure BDA0002648477240000101
表3 8个微卫星标记不同基因型在三疣梭子蟹小个群体不同表型中的多重比较
标记 基因型 个数 背甲宽(mm) 背甲长(mm) 体高(mm) 体重(g)
DX15 AA 14 125.859±5.528<sup>Aa</sup> 59.127±1.624<sup>a</sup> 30.931±0.677<sup>A</sup> 105.604±11.147<sup>a</sup>
AB 11 124.629±6.197<sup>A</sup> 59.154±2.591 30.171±1.919 104±10.275
AC 5 119.574±7.496 57.304±4.418 28.82±0.876<sup>B</sup> 94.5±13.059
BB 18 121.13±5.728<sup>b</sup> 58.389±2.005 29.401±1.558<sup>B</sup> 99.483±8.84
BC 8 119.204±6.929<sup>b</sup> 57.909±2.865 29.641±1.809 95.813±10.97<sup>b</sup>
CC 14 117.981±7.418<sup>B</sup> 57.092±3.379<sup>b</sup> 29.304±1.485<sup>B</sup> 96.643±12.564<sup>b</sup>
DX19 AC 4 130.278±6.312<sup>Aa</sup> 61.08±0.803<sup>Aa</sup> 31.515±0.945<sup>a</sup> 115.75±9.129<sup>Aa</sup>
BB 7 117.897±5.376<sup>B</sup> 56.657±2.123<sup>B</sup> 29.144±1.571<sup>b</sup> 94.214±11.22<sup>B</sup>
BC 18 120.731±8.466<sup>B</sup> 58.157±3.286<sup>b</sup> 30.042±1.824 99.344±12.85<sup>B</sup>
CC 29 123.008±5.7<sup>b</sup> 58.387±2.272<sup>b</sup> 29.707±1.524<sup>b</sup> 101.39±10.075<sup>b</sup>
注：同一行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同一行不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
表4标记与各生长性状之间的关联性
Figure BDA0002648477240000102
*表示标记与性状关联显著；**表示标记与性状关联极显著。
进行分子标记选择育种时，若采用微卫星标记DX05引物能够扩增AB(146bp，152bp)、AC(146bp，174bp)、BB(152bp，152bp)、BC(152bp，174bp)和CD(174bp，188bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC和CD相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX07引物能够扩增AA(122bp，122bp)、AB(122bp，126bp)、AC(122bp，130bp)、BB(126bp，126bp)和BC(126bp、130bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB和BC相关联的背甲宽、背甲长和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX09引物能够扩增出AB(141bp，149bp)、AC(141bp，155bp)、BB(149bp，149bp)、BC(149bp，155bp)和CC(155bp，155bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX10引物能够扩增出AB(118bp，124bp)和BB(124bp，124bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB和AC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX14引物能够扩增出AB(148bp，154bp)、BB(154bp，154bp)、BD(154bp，169bp)、CD(157bp，169bp)和DD(169bp，169bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、BB、BD、CD和DD相关联的体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX15引物能够扩增出AA(203bp，203bp)、AB(203bp，215bp)、AC(203bp，221bp)、BB(215bp，215bp)、BC(215bp，221bp)和CC(221bp，221bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX16引物能够扩增出AA(112bp，112bp)、AB(112bp，118bp)、AC(112bp，120bp)、BB(118bp，118bp)、BC(118bp，120bp)和CC(120bp，120bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系；
若采用微卫星标记DX19引物能够扩增出AC(169bp，181bp)、BB(175bp，175bp)、BC(175bp，181bp)和CC(181bp，181bp)基因型，表明待测样品为与基因型AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、背甲长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹品系。
序列表
<110> 河北大学
<120> 三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 146
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 1
gtgggccgcc aatatcacta tttcaccctg ccaaatgatg acgagaatgt tacctatatg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtaaaggaa caaagggtat ggtagaaagc atagaggatt 120
agatacttgg gtgcaagtgg tggatt 146
<210> 2
<211> 123
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 2
cgtgcatccg tgtgtttgtt tatcagagag caggactgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtcag 60
ctgggagagg cgaggttgct cagtccgccg ctcgctctca caccaactcg gcgaaaagat 120
ggc 123
<210> 3
<211> 150
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 3
taggcatggg atgggtgaga aacaaagtta gacaccaata caaatctctc tctcacacac 60
acacacacac acacacacac acacacaaag cctcttttcc agtcaaattc agatacctca 120
ttcagaacaa ctcaacaaca ctccttcccg 150
<210> 4
<211> 125
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 4
aatcacaacc cagccgcata tcaccagcag gccagcagct gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtaaacaa acagtaccct cgggcctcga cattcttcct cgtgcccgca tctctccttc 120
gttgt 125
<210> 5
<211> 154
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 5
cccgctaccc cataactcac tgcacaaagg ggagggcgcc aggaatccgc cggtggacaa 60
cgtaccaggc gtgaggtgcg gaggtgttag acgtggtggt ggtggtggtg gtgggaagat 120
atgtacagat tggatatggc tgtggggagg aaga 154
<210> 6
<211> 209
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 6
cgtcccatca tctgacaaag gaaaggagga caaggagaag aaagagagag ggaaagagaa 60
agagagatgg aagaagaggg tgaaagataa gaggaggagg aggaggagga agaagaagaa 120
gatgaatagg atgaagtaaa agaaatacaa gagaatgaga tgtaagaatt ggaggaggaa 180
aacaaaagaa aagaggaaga ggtgaagga 209
<210> 7
<211> 119
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 7
gaggcaagca agttaaccat taggccacga ggttctggga agacggggct gtctatagga 60
ggagaggctg taggtctgtg cgtgtgtgtg tgtgttggta ggatgaggta accaggaag 119
<210> 8
<211> 160
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 8
cacactcgtt gcagacacta cttcatttaa actgttccac gtctcaatac atctttgagg 60
gaaactatat cttttaacat ctctcagact tcttcctgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt 120
ttagcaggat tcattgtcca aagcaccgag taagtaacag 160
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgggccgcc aatatcacta 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatccaccac ttgcacccaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtgcatccg tgtgtttgtt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccatctttt cgccgagttg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taggcatggg atgggtgaga 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgggaaggag tgttgttgag t 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aatcacaacc cagccgcata 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acaacgaagg agagatgcgg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccgctaccc cataactcac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcttcctccc cacagccata 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgtcccatca tctgacaaag g 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tccttcacct cttcctcttt tct 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaggcaagca agttaaccat tag 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttcctggtt acctcatcct acc 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cacactcgtt gcagacacta ctt 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctgttactta ctcggtgctt tgg 23

Claims (4)

1.一种三疣梭子蟹微卫星标记，其特征在于，包括微卫星标记DX05、DX07、DX09、DX10、DX14、DX15、DX16和DX19；
所述微卫星标记DX05与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.1所示；
所述微卫星标记DX07与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长和体重性状相关联，其序列如SEQID NO.2所示；
所述微卫星标记DX09与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.3所示；
所述微卫星标记DX10与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.4所示；
所述微卫星标记DX14与三疣梭子蟹的体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.5所示；
所述微卫星标记DX15与三疣梭子蟹的背甲宽和体高性状相关联，其序列如SEQ IDNO.6所示；
所述微卫星标记DX16与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长、体高和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.7所示；
所述微卫星标记DX19与三疣梭子蟹的背甲宽、背甲长和体重性状相关联，其序列如SEQID NO.8所示。
2.一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物，其特征在于，包括8对微卫星引物，分别为：
DX05F：序列如SEQ ID NO.9所示， DX05R：序列如SEQ ID NO.10所示；
DX07F：序列如SEQ ID NO.11所示，DX07R：序列如SEQ ID NO.12所示；
DX09F：序列如SEQ ID NO.13所示，DX09R：序列如SEQ ID NO.14所示；
DX10F：序列如SEQ ID NO.15所示，DX10R：序列如SEQ ID NO.16所示；
DX14F：序列如SEQ ID NO.17所示，DX14R：序列如SEQ ID NO.18所示；
DX15F：序列如SEQ ID NO.19所示，DX15R：序列如SEQ ID NO.20所示；
DX16F：序列如SEQ ID NO.21所示，DX16R：序列如SEQ ID NO.22所示；
DX19F：序列如SEQ ID NO.23所示，DX19R：序列如SEQ ID NO.24所示。
3.一种权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2所述的引物在三疣梭子蟹生长性状关联分析中的应用。
4.一种权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2所述的引物在三疣梭子蟹分子育种中的应用。
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