CN101886070A - 一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种拟穴青蟹微卫星分子标记的获得方法，包括：拟穴青蟹基因组DNA的提取；基因组DNA的酶切、连接接头及预扩增；扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增；扩增产物的克隆及测序；序列分析及微卫星特异引物设计；不同地理群体或群体内个体的基因组DNA的PCR扩增；6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱的获得。本发明在拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域中具有良好的应用前景。

Description

一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法

技术领域

本发明属于水产生物DNA分子遗传标记技术领域，特别涉及一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法。

背景技术

微卫星DNA(Microsatellite DNA)几乎存在于所有真核生物基因组中，由1-6个核苷酸组成的简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)，是近十几年发展起来的一种新型分子标记技术。微卫星具有数量多、随机分布、多态性高、重复性强、呈共显性遗传及操作简单等优点，被广泛地应用于群体遗传多样性分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及QTL定位等领域中。

国内外学者已在大多数的重要水产养殖动物中开发了微卫星标记。如：Guo等开发了大黄鱼的6个多态微卫星标记；李绍戊等开发了团头鲂的19个微卫星标记；马洪雨等报道了圆斑星鲽的40个多态微卫星标记和条斑星鲽的31个多态微卫星标记；Wang等开发了太平洋牡蛎的17个EST来源的多态微卫星标记；Elfstrom等开发了扇贝的16个微卫星标记；Yap等筛选到梭子蟹的8个多态微卫星标记；An等筛选了中华绒螯蟹的9个微卫星标记。这些多态微卫星标记已经被广泛地应用到群体遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建等研究中。

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，主要分布于太平洋、印度洋的热带、亚热带和温带沿岸，在我国主要分布于东南沿海各省，以福建、广东和海南最多，是我国重要的养殖蟹类之一。为了鉴定和保护在我国广泛分布的青蟹资源，马凌波等对我国东南沿海的青蟹的线粒体进行了研究，结果证实在我国广泛分布的青蟹绝大多数为拟穴青蟹，而不是先前认为的锯缘青蟹。目前，可利用的拟穴青蟹微卫星标记数量非常少，严重限制了相关遗传学研究的发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹微卫星分子标记及其构建方法和应用，该方法具有操作简单，快速、准确、灵敏等优点，一次可获得几百、甚至上千条微卫星序列，并且所获得的大多数的微卫星序列均可设计引物，在拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域中具有良好的应用前景。

本发明的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，包括：

(1)拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释备用；

(2)基因组DNA的酶切、连接接头及预扩增；

(3)扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增；

(4)扩增产物的克隆及测序；

(5)序列分析及微卫星特异引物设计；

(6)使用引物对拟穴青蟹不同地理群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增；

(7)使用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；

(8)根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，共获得20个多态性的微卫星标记，从而获得拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱。

所述步骤(1)中的拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释，包括以下步骤：剪取拟穴青蟹少量肌肉组织100-150mg，置于500μl组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的RNaseA，55℃消化2-3个小时；用酚∶氯仿∶异戊醇混合液按体积比为25∶24∶1混合，抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，于-20℃保存备用。

所述步骤(2)中的基因组DNA的酶切是利用限制性内切酶MseI消化DNA，于37℃酶切3个小时；之后于70℃保温15分钟使内切酶失活；

所述的连接街头是在酶切片断两端连接上序列特异的接头，其序列为oligo A：5’-CTACTCAGGACTCAT-3’；oligo B：5’-GAGTCCTGAGTAGCA-3’，连接反应在16℃进行10个小时，之后将连接产物稀释10倍待用；

所述的预扩增是利用接头特异性引物通过PCR扩增，达到富集连接产物的目的，预扩增引物MseI-N的序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’；用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。

所述步骤(3)中的扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增，包括以下步骤：将步骤(2)回收的预扩增产物与生物素标记的微卫星重复探针((CAA)₁₀和(GATA)₈)进行杂交，再利用该杂交产物与磁珠杂交，然后将非目的片断洗脱，从而获得微卫星重复片断，最后利用PCR扩增法富集微卫星重复片断。

所述步骤(4)中的克隆及测序，包括以下步骤：首先是将PCR富集片段连接到pMD19-T载体中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，接种到LB培养基中生长，再利用载体通用引物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入片段大小在250-800bp的阳性克隆并进行测序。

所述步骤(5)中的序列分析及微卫星特异引物设计，包含以下步骤：首先利用生物学软件DNAMAN 4.0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同的序列；然后使用软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次；再利用BLAST方法搜索这些微卫星序列在GenBank数据库中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物学软件Primer Premier 5.0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行引物设计；

引物应符合以下标准：(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60％之间；(3)退火温度在48-60℃之间；(4)PCR产物的预期长度在130-350bp之间；

其中，所述的拟穴青蟹微卫星分子标记及其对应的特异引物序列，如下所示：

Scp01：长度337bps

taaccacatc cacccgtcca ctcaaccact caaccatatc cactcactca cctacttacc

cacactcata acgccatcct tctatccact aactcacact cacccgacca cccacctccg

ttagcccacc catccactca ctcaaccaca accacccatc cacccaccgc acactaccta

caggctcatc cacctatcta tccatccatc cgctcatcta cctgtaaacc acccacccac

actcacacat tcatcatccc acccacatcc accaaaccag ccaccccacc atccagtaca

cattggccta tccatccaca actacaacct cccatta

Scp01标记的特异引物序列：

F：tcataacgccatccttctat

R：tgggaggttgtagttgtgga；

Scp02：长度243bps

aacaacgcag cgcaacacaa tataatgcaa tgtaacaaca caacacaaca caacacaaca

caacaccgca acgcaacacc ggcttagggt gacagcacgt aacacctcgc agcgtgcatg

aagccaaaac agcaacactg aatgggaaga catacaagag caatccaatg ttggcgcagc

aggaatcctg tgtccctatc agcaggtcac gcttgcctcc atttcaaatc cactcgcaca

tta

Scp02标记的特异引物序列：

F：gcaacacaatataatgcaatgtaa

R：agcgtgacctgctgatagg；

Scp03：长度298bps

taataataac aataacagaa acaatgactc taccttctaa cacaggaatg gtcctcaaca

acctcattgg caagaagggg tcactgtcat cactgcaaga ctactgggac gtggccacct

tctttgagat cagcgtgttg gcagaggatt atggaaaggc ggtgcaggca gctgagtgca

tgtttagatt gaagcctcct aattggtgag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagggt

ggtgcattgt gggagtgtgt ttagtgttgg tgagagaatg gtaggtggta cgtcatta

Scp03标记的特异引物序列：

F：tggtcctcaacaacctcatt

R：atgacgtaccacctaccattct；

Scp04：长度509bps

taatgtcaga cgcagtgatg taggcagaaa tgttaagaat aaagcaacac catcaccaac

attaccatta tcatcaccag caccaccaac accataacca aaacaatcat aattaccatc

actatatcta caactcatca caacctctaa tcaccaccac caccatcatc accagtcaac

accagtgcac cacaggaacg aaaacaccac cccactcatc tccctcctca tctcctgctc

ctgtttcgtc tattccagtt tcccctcgtg taccaatttc ctggacttgc ttgcgtaaac

gtcactccat tttctgtcat tcgtttttct ctcatgcatc cctcggcctc gtgtgtgtgt

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt

gtgtggtgac agcgggtgtg gactcctgtg tgcgtgattg ttgctgtgta cacacgccgc

acacacaagg agtagcgagg cgcgagtta

Scp04标记的特异引物序列：

F：ttcctggacttgcttgcgtaaa

R：gcgcctcgctactccttgtg；

Scp05：长度334bps

taaccactca accaccccca atccacttac caatccatcc agccattgac tcctatcgat

ccatccattc aaccacccgt ccactcacac acactctaca cacacattca tccatccatc

catccatcta tccacacaac tattcacact ctcatccacc tacccctcta ctgaccagcc

catccaccca tctaacaaca cacctaccta caactcattc atccatccat ccatctatcc

aaccatccac ttactcttcc atccacattt caatccaccc atccattcat ttagccgtac

atgaatgcag ctacccattc acacacccct ccat

Scp05标记的特异引物序列：

F：cagccattgactcctatcga

R：tgcattcatgtacggctaaa；

Scp06：长度237bps

caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac tttcctgaca catcttttcc

tccctccttg ttttccttcc ttcatctctt ccactattat ttcccttata gtagtggtgg

tggtggtgga ggacgatatt acaaacaagc attcacacag acagacagac agacagacaa

actaacaaag gaacaaacaa ataatgacta actgcaggct tctctcactc aggctta

Scp06标记的特异引物序列：

F：ccttgttttccttccttcatct

R：gagagaagcctgcagttagtcat；

Scp07：长度301bps

aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa cagcaacagc

aggagaaaac aataataact actactacta ctactactac tattaaattt attactacta

ttaatatttc ttttactgga acaactgcca atactaccac caccaccacc accaccagca

ccaccaccac caccagcaca taccaatacc agcagtagtg aagaggcacg gttacataac

atcactgcat tataaaaccc acgaactgtt cataataggg gcaatcaatt agtgcatatt

a

Scp07标记的特异引物序列：

F：agcaacagcaggagaaaacaat

R：cctattatgaacagttcgtggg；

Scp08：长度271bps

taacccttcc tttgtaaagt tagcgcgtca ttttaacagt tgtgcgctct ttgtattgtg

attccatgta ttcttcttct tcttcttctt cttcttgttc ttgttcttgt tcttcttatt

gttattatta tacttttgtt gtgttcggtt acttatgaaa agctctcgtt ttgtgtcttg

ttgttacact ttttcttttg ttgttgtggt ttagctcagt ttttactttc gtttgtgtct

tttgctttgg ttttgagtca taataagtgg t

Scp08标记的特异引物序列：

F：cgctctttgtattgtgattcc

R：atgactcaaaaccaaagcaaa；

Scp09：长度315bps

taagccgcca gagcaaggcc agtattgaaa tgatagggta gatgacacct cgccaggatt

ttctgtccgt ttgtctgtgt gtatgctgtt gcttgcctgt gtgtctgttt tcctttatat

ttgtctgttt gtcagtgtct gtctgtttgt gtgtctgtcg taaagtctca ctcttctttt

ctttgtctgt ctgtccttac ttctgactgt caatctctcc ctctctctct ctctctctct

ctctctctct gcttgttctc gccgttgtta ccgtcgggag ttgcttttgt cgttgttgtt

gttgttgttg ttgtt

Scp09标记的特异引物序列：

F：cagtattgaaatgatagggtagatgac

R：cggtaacaacggcgagaac；

Scp10：长度274bps

taacgaagct aacacaacta gcgccgcccc tcgtgcgtgt gtgtgtgtgg cgagacgagt

gcaagcaaga gagtgtttat ctacttgtct tgacttgtct gcacctacaa gagcaatatt

tgtcttgtac tgtgtttccc gggccgacag aaagcagcgg tgtgggtgag agggaatatg

atacagtgcg gagataaggc cagtaatccc cgagtgtgta gggttgtgca gcgcgaggtc

ttaaggctgg gtagtgatct agacgcgact taca

Scp10标记的特异引物序列：

F：acaactagcgccgcccctcg

R：acccagccttaagacctcgc；

Scp11：长度262bps

taacacacac tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc

tctaagcttt tttcatttca tcttccatcc gatatttttt tttttcactt ttccttcctt

ccctcgttcc ttcctgactt tctctcttcg tccctcttcc taaccttttt ctccggtctc

ttcttttact cctttatctc ctttcatctc gctgttcttt tgcattattt tatctggttc

ttttctctca acttgtatct ta

Scp11标记的特异引物序列：

F：ttcatcttccatccgatatt

R：gaaccagataaaataatgcaaa；

Scp12：长度294bps

taataatatc aacatggcgg tcacccatcc aagaactaac cgaacccccc gttgcttaac

ctcacttaca acacgaaaag ctgcgtattg aacatagtaa ggtcgttggc acacacacac

acacacacac acacacacac acgcaatgat ctagagtaac atgcatccaa attacaagtt

tttttttctc tctttctctc atagtaatta gcgtcattca attaacacct gctcgtgatt

gatgagggga agttaatgac tgatgcattt gttgctaata attaggcgaa gatc

Scp12标记的特异引物序列：

F：cacccatccaagaactaacc

R：caatcacgagcaggtgttaa；

Scp13：长度273bps

taagcactat ttgtttggat tcttcttttc agtgtccaca ttcgttaatg agttgtttgt

ggtgctggtg aatctgagct agaggattga gtagtggtag gtgattctga ttatgatagt

gagtttgaat ttaggttaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca

cacacacaca ccttccgaag cttgctgcca gcgcccacat gccactctca caccctgtac

tcctgtggta tagaagtctt aattatactg tta

Scp13标记的特异引物序列：

F：tgtttggattcttcttttcag

R：taccacaggagtacagggtg；

Scp14：长度359bps

taaacacaaa tacactgttg tgaaaacgta agacagaccg gtagacacaa agaccgaaag

tttttatagt attgtagatt atatgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca

cgtgtagagg aggacagcca aggccagaaa aacagagtga aaataatgaa cgttaaatta

attgcggctc ccacattgac aactggagag tttccaaaac gctggccagt tcattttctg

agatgtcttg atatttccct catgcaatag ttgtaattat aagaaggaga aaaagagaaa

caagtaaagt gttttagagt ttgccactga aatgcatgaa agagtgaaaa ttgcggtta

Scp14标记的特异引物序列：

F：ttgtgaaaacgtaagacagac

R：aattacaactattgcatgagg；

Scp15：长度422bps

taacacagac tacgaatgta gactttttta tgcatgtgat atgggatatg cgtgtgtatt

gtgtgctgga tgaatacgag taagaacgtt cagatgtgtg tatatgtgat ggcgtatgag

atggtaaagt atgcgtgtag gatagcaaat gtataaactc gtgtttatga atatagtgtg

tgtgtgtgtg tgtgttctaa tcaatcattg gctatgcctt ccctctagtc gctagcgagt

gaagatgaca cgctgccatt gccttgtgct aaggaagcag acactaacgt cggccgtcgg

cccttcaagc cagacagtat agttggcgga ggtgactgag acacgtatta caatgcagta

ttacaatgac gtgagggtac gggatgagta caccacaaca ttcataacca gctaattgat

ta

Scp15标记的特异引物序列：

F：taacacagactacgaatgtagactt

R：gcatagccaatgattgattaga；

Scp16：长度262bps

taactccaaa ggaatgtggt gagtgaaagc aaacccaagt aactgaggag tggtgtgtgt

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgt

gtgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcaa ccctttgact gccacttggt acacctttcc

ctacagccac attcgatctt tgaactggga agaaattgca aaatgtattc tatttcgtaa

ctaactttct tgtagatgct ta

Scp16标记的特异引物序列：

F：aaacccaagtaactgaggag

R：gtagggaaaggtgtaccaag；

Scp17：长度187bps

agatagacag acacagaggc atactgaaac acaaataata ggccattcag tcagtccaat

tgacatatat acataccttc tgacaaacac acagatgcag agagataact acacacacac

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac aactccggta tgcgaatgcc

gacgtta

Scp17标记的特异引物序列：

F：agatagacagacacagaggcatact

R：taacgtcggcattcgcatac；

Scp18：长度307bps

taactgcagt cccttacctg aagatgctac aggtgtgctc aggtgtggct aatgagtccc

cacacctgtc ccctcccaca cctggcaagg gaaaatggaa ggaggaggaa gaaagaggaa

aagaaggagg aggaaaaaag tggaaaaatg agagaaggaa gtgatggagg gaagaagaaa

aaaggaatag gagaaaagag aagaggtgaa gagaggaaag aggaaaaaaa gaagagaagg

gatgaaggaa gaagggagag agagagagag agtcactcta gctttgcgtt ggggcaggcg

ctttctc

Scp18标记的特异引物序列：

F：cccttacctgaagatgct

R：caacgcaaagctagagtg；

Scp19：长度179bps

taagggcgat gattattggt tggccagaac aagcggcccc tcccaggcgc tggaggaagg

gaggtggaag gaaggaagga agaagaagaa gaaaagaaag agaaggaaag aaagctgcaa

ataaaaaaaa ggacgaatcg ggtgaagtga gtcagtggat ggaggagaga gagagagag

Scp19标记的特异引物序列：

F：ggcgatgattattggttggc

R：ttcacccgattcgtcctttt；

Scp20：长度155bps

taacccgcgt gcttgtgtat ttatttgtgt attggatata aagtggaact gatggcgact

catgcattag gagggcgaag tagagtgaca gagatcaggg ctgtgtgagg ggcgtgtgag

gggagagaga gagaaggggt atgggagcgg tgtgt

Scp20标记的特异引物序列：

F：tggatataaagtggaactgatggcg

R：cacaccgctcccatacccctt。

所述步骤(6)中的PCR扩增的反应体系总体积为25μl，包括：基因组DNA模板1μl、上下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟。

所述步骤(7)中的检测步骤包括：将步骤(6)的PCR产物于95℃变性后，上样3μl于6％的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，再经染色、显色后获得了拟穴青蟹的PCR产物电泳图像。

本发明的一种拟穴青蟹微卫星分子标记应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域。

本发明的通过拟穴青蟹两种微卫星富集文库(CAA)_n、(GATA)_n的构建，阳性克隆的鉴定及测序，序列分析及微卫星引物的设计，最终获得20个扩增条带清晰的多态性的微卫星标记，将这20个多态性标记用于拟穴青蟹不同地理群体或群体内不同个体的遗传学分析，获得拟穴青蟹的遗传变异的多态性图谱。

有益效果

本发明提供了一种可快速、大量的制备拟穴青蟹的微卫星标记，一次可获得几百、甚至上千条微卫星序列，并且所获得的大多数的微卫星序列均可设计引物，具有操作简单，快速、准确、灵敏等优点，一周内可完成一个过程，大大提高了构建微卫星标记的效率，在拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域中具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1、拟穴青蟹基因组DNA的提取

剪取拟穴青蟹少量肌肉组织约100-150mg，置于500μl组织提取液(10mmol/L Tris-CI，pH8.0；100mmol/L EDTA，pH8.0；100mmol/L NaCl；0.5％SDS)中剪碎，加入蛋白酶K(终浓度为20mg/ml)和RNaseA(终浓度为100μg/ml)，充分混匀，55℃消化2-3个小时至澄清；用酚∶氯仿∶异戊醇混合液(体积比为25∶24∶1)抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于50μL TE(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，并保存在-20℃备用；

2、拟穴青蟹基因组DNA的酶切、连接

利用限制性内切酶MseI对拟穴青蟹基因组DNA进行消化，酶切反应总体积为30μl，包括：6μl的10×buffer R with BSA、6U的内切酶MseI、10μl的基因组DNA及13.4μl的灭菌双蒸水，37℃水浴消化约3小时，之后70℃保温15分钟使内切酶失活；

连接步骤如下：首先将合成的单链寡核苷酸oligo A(oligo A：5’-CTACTCAGGACTCAT-3’)和oligo B(5’-GAGTCCTGAGTAGCA-3’)稀释为浓度100μmol/L，然后等体积混合，再稀释为浓度20μmol/L，于94℃变性5分钟，缓慢冷却至室温，-20℃保存备用；

连接反应的总体积为17.5μl，包括：1.5μl的10×T4DNAbuffer、2.5μl的接头、10.5U的T4DNA连接酶及10μl的酶切产物，16℃连接约10小时，之后将连接产物稀释10倍待用；

3、预扩增

预扩增引物MseI-N的序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’，PCR反应体系为20μl，包括：10×连接产物5μl、引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶1U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为20μl；PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、53℃退火50秒、72℃延伸1分钟，25个循环；最后于72℃延伸7分钟。利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物；

4、回收产物与生物素标记的微卫星探针杂交

委托生物公司合成两种微卫星寡核苷酸探针，用生物素在其5’端进行标记。两种探针序列分别为：5’-CAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA-3’和5’-GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA-3’；将两种探针稀释为浓度40μmol/L，杂交体系为96μl，包括：70μl的杂交液(6×SSC+0.1％SDS)、6μl的探针及20μl的上述预扩增回收产物，杂交反应在PCR仪中进行，程序为：94℃变性5分钟，65℃退火30分钟，10℃暂时保存；

5、磁珠杂交及洗脱

首先用杂交液(6×SSC+0.1％SDS)对磁珠进行仔细的洗涤3次，每次3分钟；然后将上述杂交混合液与磁珠混合，在室温下杂交约30分钟，期间不断的重悬磁珠；最后对磁珠进行洗涤，目的是去除非目的片段及杂质。洗涤步骤如下：首先用400μl的杂交液(6×SSC+0.1％SDS)清洗磁珠3次，每次3分钟；然后用400μl的2×SSC清洗磁珠3次，每次3分钟；最后用400μl的1×SSC清洗磁珠2次，每次3分钟；用磁力架吸附磁珠并去除液体后，向磁珠中加入50μl的TE溶液，在95℃水浴中变性5分钟后，快速收集TE溶液；

6、杂交后的PCR扩增

对磁珠杂交后的洗脱产物进行PCR扩增，其反应体系为20μl，包括：洗脱产物5μl、预扩增引物终浓度为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶1U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为20μl；PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、53℃退火50秒、72℃延伸1分钟，25个循环；最后于72℃延伸7分钟，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的浓度；

7、T载体连接

将上述PCR扩增产物连接到T载体中，连接体系为10μl，包括：solution I 5.0μl、pMD19-T载体(TaKaRa)1.0μl及PCR扩增产物4.0μl，4℃过夜；

8、克隆、测序

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，使用载体通用引物(M₁₃-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；M₁₃-48：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)对克隆进行PCR鉴定。PCR反应体系为25μl，包括：菌液1μl、上下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶1U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、55℃退火50秒、72℃延伸50秒，25个循环；最后于72℃延伸7分钟。最后，挑选插入片断长度在250-800bp之间的阳性克隆，用ABI3730测序仪进行测序；

9、微卫星引物设计

首先利用生物学软件DNAMAN 4.0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同的序列；然后使用软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次；再利用BLAST方法搜索这些微卫星序列在GenBank数据库中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物学软件PrimerPremier 5.0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行引物设计。

引物应符合以下标准：(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60％之间；(3)退火温度在48-60℃之间；(4)PCR产物的预期长度在130-350bp之间，引物信息详见表1；

10、微卫星标记的PCR扩增

利用上述微卫星引物对拟穴青蟹群体进行PCR扩增，其反应体系为25μl，包括：基因组DNA模板1μl、上、下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶1U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度(表1)退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟，4℃保存备用；

11、PCR产物的电泳检测

向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂(98.0％甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯氰)，于95℃变性5分钟，快速冷却；然后上样约3μl于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。分子量标准为pBR322/MspI，电泳液为1×TBE，恒压35-40V/cm，电泳约1-1.5小时。

电泳完成后进行染色和显色，其操作过程为：首先用70％乙醇固定10分钟，蒸馏水洗5分钟；然后用1.5‰硝酸银染色10分钟，蒸馏水洗8秒钟；最后用显色液(2％的NaOH+4‰的甲醛)显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净，便获得了拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱。

表1本发明所构建的拟穴青蟹的20个微卫星标记

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国水产科学研究院东海水产研究所

<120>一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法

<140>2010101296298

<141>2010-03-19

<160>40

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp01的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(40)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp01的下游引物R

<400>1

tcataacgcc atccttctat tgggaggttg tagttgtgga 40

<210>2

<211>337

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>2

aaccacatc cacccgtcca ctcaaccact caaccatatc cactcactca cctacttacc     60

cacactcata acgccatcct tctatccact aactcacact cacccgacca cccacctccg    120

ttagcccacc catccactca ctcaaccaca accacccatc cacccaccgc acactaccta    180

caggctcatc cacctatcta tccatccatc cgctcatcta cctgtaaacc acccacccac    240

actcacacat tcatcatccc acccacatcc accaaaccag ccaccccacc atccagtaca    300

cattggccta tccatccaca actacaacct cccatta                             337

<210>3

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(24)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp02的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(25)..(43)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp02的下游引物R

<400>3

gcaacacaat ataatgcaat gtaaagcgtg acctgctgat agg 43

<210>4

<211>243

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>4

aacaacgcag cgcaacacaa tataatgcaa tgtaacaaca caacacaaca caacacaaca    60

caacaccgca acgcaacacc ggcttagggt gacagcacgt aacacctcgc agcgtgcatg    120

aagccaaaac agcaacactg aatgggaaga catacaagag caatccaatg ttggcgcagc    180

aggaatcctg tgtccctatc agcaggtcac gcttgcctcc atttcaaatc cactcgcaca    240

tta                                                                  243

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp03的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(42)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp03的下游引物R

<400>5

tggtcctcaa caacctcatt atgacgtacc acctaccatt ct 42

<210>6

<211>298

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>6

taataataac aataacagaa acaatgactc taccttctaa cacaggaatg gtcctcaaca    60

acctcattgg caagaagggg tcactgtcat cactgcaaga ctactgggac gtggccacct    120

tctttgagat cagcgtgttg gcagaggatt atggaaaggc ggtgcaggca gctgagtgca    180

tgtttagatt gaagcctcct aattggtgag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagggt    240

ggtgcattgt gggagtgtgt ttagtgttgg tgagagaatg gtaggtggta cgtcatta      298

<210>7

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(22)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp04的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(23)..(42)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp04的下游引物R

<400>7

ttcctggact tgcttgcgta aagcgcctcg ctactccttg tg 42

<210>8

<211>509

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>8

taatgtcaga cgcagtgatg taggcagaaa tgttaagaat aaagcaacac catcaccaac    60

attaccatta tcatcaccag caccaccaac accataacca aaacaatcat aattaccatc    120

actatatcta caactcatca caacctctaa tcaccaccac caccatcatc accagtcaac    180

accagtgcac cacaggaacg aaaacaccac cccactcatc tccctcctca tctcctgctc    240

ctgtttcgtc tattccagtt tcccctcgtg taccaatttc ctggacttgc ttgcgtaaac    300

gtcactccat tttctgtcat tcgtttttct ctcatgcatc cctcggcctc gtgtgtgtgt    360

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt    420

gtgtggtgac agcgggtgtg gactcctgtg tgcgtgattg ttgctgtgta cacacgccgc    480

acacacaagg agtagcgagg cgcgagtta                                      509

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp05的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(40)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp05的下游引物R

<400>9

cagccattga ctcctatcga tgcattcatg tacggctaaa    40

<210>10

<211>334

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>10

taaccactca accaccccca atccacttac caatccatcc agccattgac tcctatcgat    60

ccatccattc aaccacccgt ccactcacac acactctaca cacacattca tccatccatc    120

catccatcta tccacacaac tattcacact ctcatccacc tacccctcta ctgaccagcc    180

catccaccca tctaacaaca cacctaccta caactcattc atccatccat ccatctatcc    240

aaccatccac ttactcttcc atccacattt caatccaccc atccattcat ttagccgtac    300

atgaatgcag ctacccattc acacacccct ccat                                334

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(22)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp06的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(23)..(45)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp06的下游引物R

<400>11

ccttgttttc cttccttcat ctgagagaag cctgcagtta gtcat    45

<210>12

<211>237

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>12

caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac tttcctgaca catcttttcc    60

tccctccttg ttttccttcc ttcatctctt ccactattat ttcccttata gtagtggtgg    120

tggtggtgga ggacgatatt acaaacaagc attcacacag acagacagac agacagacaa    180

actaacaaag gaacaaacaa ataatgacta actgcaggct tctctcactc aggctta       237

<210>13

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(22)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp07的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(23)..(44)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp07的下游引物R

<400>13

agcaacagca ggagaaaaca atcctattat gaacagttcg tggg    44

<210>14

<211>301

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>14

aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa cagcaacagc    60

aggagaaaac aataataact actactacta ctactactac tattaaattt attactacta    120

ttaatatttc ttttactgga acaactgcca atactaccac caccaccacc accaccagca    180

ccaccaccac caccagcaca taccaatacc agcagtagtg aagaggcacg gttacataac    240

atcactgcat tataaaaccc acgaactgtt cataataggg gcaatcaatt agtgcatatt    300

a                                                                    301

<210>15

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(21)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp08的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(22)..(42)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp08的下游引物R

<400>15

cgctctttgt attgtgattc catgactcaa aaccaaagca aa    42

<210>16

<211>271

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>16

taacccttcc tttgtaaagt tagcgcgtca ttttaacagt tgtgcgctct ttgtattgtg    60

attccatgta ttcttcttct tcttcttctt cttcttgttc ttgttcttgt tcttcttatt    120

gttattatta tacttttgtt gtgttcggtt acttatgaaa agctctcgtt ttgtgtcttg    180

ttgttacact ttttcttttg ttgttgtggt ttagctcagt ttttactttc gtttgtgtct    240

tttgctttgg ttttgagtca taataagtgg t                                   271

<210>17

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(27)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp09的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(28)..(46)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp09的下游引物R

<400>17

cagtattgaa atgatagggt agatgaccgg taacaacggc gagaac    46

<210>18

<211>315

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>18

taagccgcca gagcaaggcc agtattgaaa tgatagggta gatgacacct cgccaggatt    60

ttctgtccgt ttgtctgtgt gtatgctgtt gcttgcctgt gtgtctgttt tcctttatat    120

ttgtctgttt gtcagtgtct gtctgtttgt gtgtctgtcg taaagtctca ctcttctttt    180

ctttgtctgt ctgtccttac ttctgactgt caatctctcc ctctctctct ctctctctct    240

ctctctctct gcttgttctc gccgttgtta ccgtcgggag ttgcttttgt cgttgttgtt    300

gttgttgttg ttgtt                                                     315

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp10的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(40)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp10的下游引物R

<400>19

acaactagcg ccgcccctcg acccagcctt aagacctcgc    40

<210>20

<211>274

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>20

taacgaagct aacacaacta gcgccgcccc tcgtgcgtgt gtgtgtgtgg cgagacgagt    60

gcaagcaaga gagtgtttat ctacttgtct tgacttgtct gcacctacaa gagcaatatt    120

tgtcttgtac tgtgtttccc gggccgacag aaagcagcgg tgtgggtgag agggaatatg    180

atacagtgcg gagataaggc cagtaatccc cgagtgtgta gggttgtgca gcgcgaggtc    240

ttaaggctgg gtagtgatct agacgcgact taca                                274

<210>21

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp11的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(42)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp11的下游引物R

<400>21

ttcatcttcc atccgatatt gaaccagata aaataatgca aa    42

<210>22

<211>262

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>22

taacacacac tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc    60

tctaagcttt tttcatttca tcttccatcc gatatttttt tttttcactt ttccttcctt    120

ccctcgttcc ttcctgactt tctctcttcg tccctcttcc taaccttttt ctccggtctc    180

ttcttttact cctttatctc ctttcatctc gctgttcttt tgcattattt tatctggttc    240

ttttctctca acttgtatct ta                                             262

<210>23

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp12的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(10)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp12的下游引物R

<400>23

cacccatcca agaactaacc caatcacgag caggtgttaa    40

<210>24

<211>294

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>24

taataatatc aacatggcgg tcacccatcc aagaactaac cgaacccccc gttgcttaac    60

ctcacttaca acacgaaaag ctgcgtattg aacatagtaa ggtcgttggc acacacacac    120

acacacacac acacacacac acgcaatgat ctagagtaac atgcatccaa attacaagtt    180

tttttttctc tctttctctc atagtaatta gcgtcattca attaacacct gctcgtgatt    240

gatgagggga agttaatgac tgatgcattt gttgctaata attaggcgaa gatc          294

<210>25

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(21)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp13的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(22)..(41)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp13的下游引物R

<400>25

tgtttggatt cttcttttca gtaccacagg agtacagggt g    41

<210>26

<211>273

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>26

taagcactat ttgtttggat tcttcttttc agtgtccaca ttcgttaatg agttgtttgt    60

ggtgctggtg aatctgagct agaggattga gtagtggtag gtgattctga ttatgatagt    120

gagtttgaat ttaggttaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca    180

cacacacaca ccttccgaag cttgctgcca gcgcccacat gccactctca caccctgtac    240

tcctgtggta tagaagtctt aattatactg tta                                 273

<210>27

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(21)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp14的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(22)..(42)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp14的下游引物R

<400>27

ttgtgaaaac gtaagacaga caattacaac tattgcatga gg    42

<210>28

<211>359

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>28

taaacacaaa tacactgttg tgaaaacgta agacagaccg gtagacacaa agaccgaaag    60

tttttatagt attgtagatt atatgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca    120

cgtgtagagg aggacagcca aggccagaaa aacagagtga aaataatgaa cgttaaatta    180

attgcggctc ccacattgac aactggagag tttccaaaac gctggccagt tcattttctg    240

agatgtcttg atatttccct catgcaatag ttgtaattat aagaaggaga aaaagagaaa    300

caagtaaagt gttttagagt ttgccactga aatgcatgaa agagtgaaaa ttgcggtta     359

<210>29

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(25)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp15的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(26)..(47)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp15的下游引物R

<400>29

taacacagac tacgaatgta gacttgcata gccaatgatt gattaga    47

<210>30

<211>422

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>30

taacacagac tacgaatgta gactttttta tgcatgtgat atgggatatg cgtgtgtatt    60

gtgtgctgga tgaatacgag taagaacgtt cagatgtgtg tatatgtgat ggcgtatgag    120

atggtaaagt atgcgtgtag gatagcaaat gtataaactc gtgtttatga atatagtgtg    180

tgtgtgtgtg tgtgttctaa tcaatcattg gctatgcctt ccctctagtc gctagcgagt    240

gaagatgaca cgctgccatt gccttgtgct aaggaagcag acactaacgt cggccgtcgg    300

cccttcaagc cagacagtat agttggcgga ggtgactgag acacgtatta caatgcagta    360

ttacaatgac gtgagggtac gggatgagta caccacaaca ttcataacca gctaattgat    420

ta                                                                   422

<210>31

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp16的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(40)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp16的下游引物R

<400>31

aaacccaagt aactgaggag gtagggaaag gtgtaccaag 40

<210>32

<211>262

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>32

taactccaaa ggaatgtggt gagtgaaagc aaacccaagt aactgaggag tggtgtgtgt    60

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgt    120

gtgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcaa ccctttgact gccacttggt acacctttcc    180

ctacagccac attcgatctt tgaactggga agaaattgca aaatgtattc tatttcgtaa    240

ctaactttct tgtagatgct ta                                             262

<210>33

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(25)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp17的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(26)..(45)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp17的下游引物R

<400>33

agatagacag acacagaggc atacttaacg tcggcattcg catac 45

<210>34

<211>187

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>34

agatagacag acacagaggc atactgaaac acaaataata ggccattcag tcagtccaat    60

tgacatatat acataccttc tgacaaacac acagatgcag agagataact acacacacac    120

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac aactccggta tgcgaatgcc    180

gacgtta                                                              187

<210>35

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(18)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp18的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(19)..(36)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp18的下游引物R

<400>35

cccttacctg aagatgctca acgcaaagct agagtg    36

<210>36

<211>307

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>36

taactgcagt cccttacctg aagatgctac aggtgtgctc aggtgtggct aatgagtccc    60

cacacctgtc ccctcccaca cctggcaagg gaaaatggaa ggaggaggaa gaaagaggaa    120

aagaaggagg aggaaaaaag tggaaaaatg agagaaggaa gtgatggagg gaagaagaaa    180

aaaggaatag gagaaaagag aagaggtgaa gagaggaaag aggaaaaaaa gaagagaagg    240

gatgaaggaa gaagggagag agagagagag agtcactcta gctttgcgtt ggggcaggcg    300

ctttctc                                                              307

<210>37

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp19的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(21)..(40)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp19的下游引物R

<400>37

ggcgatgatt attggttggc ttcacccgat tcgtcctttt 40

<210>38

<211>179

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>38

taagggcgat gattattggt tggccagaac aagcggcccc tcccaggcgc tggaggaagg   60

gaggtggaag gaaggaagga agaagaagaa gaaaagaaag agaaggaaag aaagctgcaa   120

ataaaaaaaa ggacgaatcg ggtgaagtga gtcagtggat ggaggagaga gagagagag    179

<210>39

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(25)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp20的上游引物F

<220>

<221>prim_bind

<222>(26)..(46)

<223>拟穴青蟹微卫星分子标记Scp20的下游引物R

<400>39

tggatataaa gtggaactga tggcgcacac cgctcccata cccctt 46

<210>40

<211>155

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>40

taacccgcgt gcttgtgtat ttatttgtgt attggatata aagtggaact gatggcgact    60

catgcattag gagggcgaag tagagtgaca gagatcaggg ctgtgtgagg ggcgtgtgag    120

gggagagaga gagaaggggt atgggagcgg tgtgt                               155

Claims (9)

1.一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，包括：

(1)拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释备用；

(2)基因组DNA的酶切、连接接头及预扩增；

(3)扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增；

(4)扩增产物的克隆及测序；

(5)序列分析及微卫星特异引物设计；

(6)使用引物对拟穴青蟹不同地理群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增；

(7)使用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；

(8)根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，共获得20个多态性的微卫星标记，从而获得拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱。

2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中的拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释，包括以下步骤：剪取拟穴青蟹少量肌肉组织100-150mg，置于500μl组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的RNaseA，55℃消化2-3个小时；用酚∶氯仿∶异戊醇混合液按体积比为25∶24∶1混合，抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，于-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的基因组DNA的酶切是利用限制性内切酶MseI消化DNA，于37℃酶切3个小时；之后于70℃保温15分钟使内切酶失活；

所述的连接街头是在酶切片断两端连接上序列特异的接头，其序列为oligo A：5’-CTACTCAGGACTCAT-3’；oligo B：5’-GAGTCCTGAGTAGCA-3’，连接反应在16℃进行10个小时，之后将连接产物稀释10倍待用；

所述的预扩增是利用接头特异性引物通过PCR扩增，达到富集连接产物的目的，预扩增引物MseI-N的序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’；用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。

4.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中的扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增，包括以下步骤：将步骤(2)回收的预扩增产物与生物素标记的微卫星重复探针((CAA)₁₀和(GATA)₈)进行杂交，再利用该杂交产物与磁珠杂交，然后将非目的片断洗脱，从而获得微卫星重复片断，最后利用PCR扩增法富集微卫星重复片断。

5.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的克隆及测序，包括以下步骤：首先是将PCR富集片段连接到pMD19-T载体中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，接种到LB培养基中生长，再利用载体通用引物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入片段大小在250-800bp的阳性克隆并进行测序。

6.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于：所述步骤(5)中的序列分析及微卫星特异引物设计，包含以下步骤：首先利用生物学软件DNAMAN 4.0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同的序列；然后使用软件SSRHUNTER 1.3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次；再利用BLAST方法搜索这些微卫星序列在GenBank数据库中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物学软件Primer Premier 5.0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行引物设计；

引物应符合以下标准：(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60％之间；(3)退火温度在48-60℃之间；(4)PCR产物的预期长度在130-350bp之间；其中，所述的拟穴青蟹微卫星分子标记及其对应的特异引物序列，如下所示：Scp01：长度337bps

taaccacatc cacccgtcca ctcaaccact caaccatatc cactcactca cctacttacc

cacactcata acgccatcct tctatccact aactcacact cacccgacca cccacctccg

ttagcccacc catccactca ctcaaccaca accacccatc cacccaccgc acactaccta

caggctcatc cacctatcta tccatccatc cgctcatcta cctgtaaacc acccacccac

actcacacat tcatcatccc acccacatcc accaaaccag ccaccccacc atccagtaca

cattggccta tccatccaca actacaacct cccatta

Scp01标记的特异引物序列：

F：tcataacgccatccttctat

R：tgggaggttgtagttgtgga；

Scp02：长度243bps

aacaacgcag cgcaacacaa tataatgcaa tgtaacaaca caacacaaca caacacaaca

caacaccgca acgcaacacc ggcttagggt gacagcacgt aacacctcgc agcgtgcatg

aagccaaaac agcaacactg aatgggaaga catacaagag caatccaatg ttggcgcagc

aggaatcctg tgtccctatc agcaggtcac gcttgcctcc atttcaaatc cactcgcaca

tta

Scp02标记的特异引物序列：

F：gcaacacaatataatgcaatgtaa

R：agcgtgacctgctgatagg；

Scp03：长度298bps

taataataac aataacagaa acaatgactc taccttctaa cacaggaatg gtcctcaaca

acctcattgg caagaagggg tcactgtcat cactgcaaga ctactgggac gtggccacct

tctttgagat cagcgtgttg gcagaggatt atggaaaggc ggtgcaggca gctgagtgca

tgtttagatt gaagcctcct aattggtgag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagggt

ggtgcattgt gggagtgtgt ttagtgttgg tgagagaatg gtaggtggta cgtcatta

Scp03标记的特异引物序列：

F：tggtcctcaacaacctcatt

R：atgacgtaccacctaccattct；

Scp04：长度509bps

taatgtcaga cgcagtgatg taggcagaaa tgttaagaat aaagcaacac catcaccaac

attaccatta tcatcaccag caccaccaac accataacca aaacaatcat aattaccatc

actatatcta caactcatca caacctctaa tcaccaccac caccatcatc accagtcaac

accagtgcac cacaggaacg aaaacaccac cccactcatc tccctcctca tctcctgctc

ctgtttcgtc tattccagtt tcccctcgtg taccaatttc ctggacttgc ttgcgtaaac

gtcactccat tttctgtcat tcgtttttct ctcatgcatc cctcggcctc gtgtgtgtgt

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt

gtgtggtgac agcgggtgtg gactcctgtg tgcgtgattg ttgctgtgta cacacgccgc

acacacaagg agtagcgagg cgcgagtta

Scp04标记的特异引物序列：

F：ttcctggacttgcttgcgtaaa

R：gcgcctcgctactccttgtg；

Scp05：长度334bps

taaccactca accaccccca atccacttac caatccatcc agccattgac tcctatcgat

ccatccattc aaccacccgt ccactcacac acactctaca cacacattca tccatccatc

catccatcta tccacacaac tattcacact ctcatccacc tacccctcta ctgaccagcc

catccaccca tctaacaaca cacctaccta caactcattc atccatccat ccatctatcc

aaccatccac ttactcttcc atccacattt caatccaccc atccattcat ttagccgtac

atgaatgcag ctacccattc acacacccct ccat

Scp05标记的特异引物序列：

F：cagccattgactcctatcga

R：tgcattcatgtacggctaaa；

Scp06：长度237bps

caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac tttcctgaca catcttttcc

tccctccttg ttttccttcc ttcatctctt ccactattat ttcccttata gtagtggtgg

tggtggtgga ggacgatatt acaaacaagc attcacacag acagacagac agacagacaa

actaacaaag gaacaaacaa ataatgacta actgcaggct tctctcactc aggctta

Scp06标记的特异引物序列：

F：ccttgttttccttccttcatct

R：gagagaagcctgcagttagtcat；

Scp07：长度301bps

aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa cagcaacagc

aggagaaaac aataataact actactacta ctactactac tattaaattt attactacta

ttaatatttc ttttactgga acaactgcca atactaccac caccaccacc accaccagca

ccaccaccac caccagcaca taccaatacc agcagtagtg aagaggcacg gttacataac

atcactgcat tataaaaccc acgaactgtt cataataggg gcaatcaatt agtgcatatt

a

Scp07标记的特异引物序列：

F：agcaacagcaggagaaaacaat

R：cctattatgaacagttcgtggg；

Scp08：长度271bps

taacccttcc tttgtaaagt tagcgcgtca ttttaacagt tgtgcgctct ttgtattgtg

attccatgta ttcttcttct tcttcttctt cttcttgttc ttgttcttgt tcttcttatt

gttattatta tacttttgtt gtgttcggtt acttatgaaa agctctcgtt ttgtgtcttg

ttgttacact ttttcttttg ttgttgtggt ttagctcagt ttttactttc gtttgtgtct

tttgctttgg ttttgagtca taataagtgg t

Scp08标记的特异引物序列：

F：cgctctttgtattgtgattcc

R：atgactcaaaaccaaagcaaa；

Scp09：长度315bps

taagccgcca gagcaaggcc agtattgaaa tgatagggta gatgacacct cgccaggatt

ttctgtccgt ttgtctgtgt gtatgctgtt gcttgcctgt gtgtctgttt tcctttatat

ttgtctgttt gtcagtgtct gtctgtttgt gtgtctgtcg taaagtctca ctcttctttt

ctttgtctgt ctgtccttac ttctgactgt caatctctcc ctctctctct ctctctctct

ctctctctct gcttgttctc gccgttgtta ccgtcgggag ttgcttttgt cgttgttgtt

gttgttgttg ttgtt

Scp09标记的特异引物序列：

F：cagtattgaaatgatagggtagatgac

R：cggtaacaacggcgagaac；

Scp10：长度274bps

taacgaagct aacacaacta gcgccgcccc tcgtgcgtgt gtgtgtgtgg cgagacgagt

gcaagcaaga gagtgtttat ctacttgtct tgacttgtct gcacctacaa gagcaatatt

tgtcttgtac tgtgtttccc gggccgacag aaagcagcgg tgtgggtgag agggaatatg

atacagtgcg gagataaggc cagtaatccc cgagtgtgta gggttgtgca gcgcgaggtc

ttaaggctgg gtagtgatct agacgcgact taca

Scp10标记的特异引物序列：

F：acaactagcgccgcccctcg

R：acccagccttaagacctcgc；

Scp11：长度262bps

taacacacac tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc

tctaagcttt tttcatttca tcttccatcc gatatttttt tttttcactt ttccttcctt

ccctcgttcc ttcctgactt tctctcttcg tccctcttcc taaccttttt ctccggtctc

ttcttttact cctttatctc ctttcatctc gctgttcttt tgcattattt tatctggttc

ttttctctca acttgtatctta

Scp11标记的特异引物序列：

F：ttcatcttccatccgatatt

R：gaaccagataaaataatgcaaa；

Scp12：长度294bps

taataatatc aacatggcgg tcacccatcc aagaactaac cgaacccccc gttgcttaac

ctcacttaca acacgaaaag ctgcgtattg aacatagtaa ggtcgttggc acacacacac

acacacacac acacacacac acgcaatgat ctagagtaac atgcatccaa attacaagtt

tttttttctc tctttctctc atagtaatta gcgtcattca attaacacct gctcgtgatt

gatgagggga agttaatgac tgatgcattt gttgctaata attaggcgaa gatc

Scp12标记的特异引物序列：

F：cacccatccaagaactaacc

R：caatcacgagcaggtgttaa；

Scp13：长度273bps

taagcactat ttgtttggat tcttcttttc agtgtccaca ttcgttaatg agttgtttgt

ggtgctggtg aatctgagct agaggattga gtagtggtag gtgattctga ttatgatagt

gagtttgaat ttaggttaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca

cacacacaca ccttccgaag cttgctgcca gcgcccacat gccactctca caccctgtac

tcctgtggta tagaagtctt aattatactg tta

Scp13标记的特异引物序列：

F：tgtttggattcttcttttcag

R：taccacaggagtacagggtg；

Scp14：长度359bps

taaacacaaa tacactgttg tgaaaacgta agacagaccg gtagacacaa agaccgaaag

tttttatagt attgtagatt atatgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca

cgtgtagagg aggacagcca aggccagaaa aacagagtga aaataatgaa cgttaaatta

attgcggctc ccacattgac aactggagag tttccaaaac gctggccagt tcattttctg

agatgtcttg atatttccct catgcaatag ttgtaattat aagaaggaga aaaagagaaa

caagtaaagt gttttagagt ttgccactga aatgcatgaa agagtgaaaa ttgcggtta

Scp14标记的特异引物序列：

F：ttgtgaaaacgtaagacagac

R：aattacaactattgcatgagg；

Scp15：长度422bps

taacacagac tacgaatgta gactttttta tgcatgtgat atgggatatg cgtgtgtatt

gtgtgctgga tgaatacgag taagaacgtt cagatgtgtg tatatgtgat ggcgtatgag

atggtaaagt atgcgtgtag gatagcaaat gtataaactc gtgtttatga atatagtgtg

tgtgtgtgtg tgtgttctaa tcaatcattg gctatgcctt ccctctagtc gctagcgagt

gaagatgaca cgctgccatt gccttgtgct aaggaagcag acactaacgt cggccgtcgg

cccttcaagc cagacagtat agttggcgga ggtgactgag acacgtatta caatgcagta

ttacaatgac gtgagggtac gggatgagta caccacaaca ttcataacca gctaattgat

ta

Scp15标记的特异引物序列：

F：taacacagactacgaatgtagactt

R：gcatagccaatgattgattaga；

Scp16：长度262bps

taactccaaa ggaatgtggt gagtgaaagc aaacccaagt aactgaggag tggtgtgtgt

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgt

gtgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcaa ccctttgact gccacttggt acacctttcc

ctacagccac attcgatctt tgaactggga agaaattgca aaatgtattc tatttcgtaa

ctaactttct tgtagatgct ta

Scp16标记的特异引物序列：

F：aaacccaagtaactgaggag

R：gtagggaaaggtgtaccaag；

Scp17：长度187bps

agatagacag acacagaggc atactgaaac acaaataata ggccattcag tcagtccaat

tgacatatat acataccttc tgacaaacac acagatgcag agagataact acacacacac

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac aactccggta tgcgaatgcc

gacgtta

Scp17标记的特异引物序列：

F：agatagacagacacagaggcatact

R：taacgtcggcattcgcatac；

Scp18：长度307bps

taactgcagt cccttacctg aagatgctac aggtgtgctc aggtgtggct aatgagtccc

cacacctgtc ccctcccaca cctggcaagg gaaaatggaa ggaggaggaa gaaagaggaa

aagaaggagg aggaaaaaag tggaaaaatg agagaaggaa gtgatggagg gaagaagaaa

aaaggaatag gagaaaagag aagaggtgaa gagaggaaag aggaaaaaaa gaagagaagg

gatgaaggaa gaagggagag agagagagag agtcactcta gctttgcgtt ggggcaggcg

ctttctc

Scp18标记的特异引物序列：

F：cccttacctgaagatgct

R：caacgcaaagctagagtg；

Scp19：长度179bps

taagggcgat gattattggt tggccagaac aagcggcccc tcccaggcgc tggaggaagg

gaggtggaag gaaggaagga agaagaagaa gaaaagaaag agaaggaaag aaagctgcaa

ataaaaaaaa ggacgaatcg ggtgaagtga gtcagtggat ggaggagaga gagagagag

Scp19标记的特异引物序列：

F：ggcgatgattattggttggc

R：ttcacccgattcgtcctttt；

Scp20：长度155bps

taacccgcgt gcttgtgtat ttatttgtgt attggatata aagtggaact gatggcgact

catgcattag gagggcgaag tagagtgaca gagatcaggg ctgtgtgagg ggcgtgtgag

gggagagaga gagaaggggt atgggagcgg tgtgt

Scp20标记的特异引物序列：

F：tggatataaagtggaactgatggcg

R：cacaccgctcccatacccctt。

7.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于：所述步骤(6)中的PCR扩增的反应体系总体积为25μl，包括：基因组DNA模板1μl、上下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、TagDNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟。

8.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于：所述步骤(7)中的检测步骤包括：将步骤(6)的PCR产物于95℃变性后，上样3μl于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，再经染色、显色后获得了拟穴青蟹的PCR产物电泳图像。

9.一种拟穴青蟹微卫星分子标记应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种领域。