CN103789303B - 短颌鲚微卫星位点及引物 - Google Patents

Abstract

一种短颌鲚微卫星位点及多态性引物，其特征在于：微卫星位点的核苷酸序列为SEQ？ID？NO：1-6，微卫星引物的序列为SEQ？ID？NO：11-22。本发明从短颌鲚基因组DNA中筛选出6个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，所获得引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，可用于短颌鲚不同地理种群的遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种等领域，使一种可靠有效的分子标记。

Description

短颌鲚微卫星位点及引物

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记技术领域，特别涉及短颌鲚微卫星位点及引物。

背景技术

鲚属(Coilia)隶属于鲱形目（Cluperiformes）、鳀科（Engraulidae），是分布于印度洋—太平洋地区、具有极高经济价值的中小型鱼类。世界上的鲚属鱼类有13种;其中，中国有4种：七丝鲚（C.grayi）、凤鲚（C.mystus）、刀鲚（C.ectens）和短颌鲚（C.brachynathus）。它们主要分布于中国沿海及长江中下游地区。

短颌鲚属华中区特有种，是德国人Kreyenberg和Pappenheim（1908）依据洞庭湖的标本确立的一个物种。长期以来，由于其上颌骨较短和长江中下游及其附属大型湖泊等淡水性分布的特征，一直被视为一个有别于刀鲚的有效物种（Whiteheadetal.，1988）。但随着刀鲚淡水定居性种群在巢湖、太湖等通江湖泊的发现，短颌鲚与刀鲚在生态学上的差异变得模糊，两者的鉴别主要依据上颌骨长度等界限不甚清晰的形态特征，从而引发对短颌鲚物种有效性问题的讨论（张世义，2001；倪勇等，2006）。鲚属Coilia鱼类外形十分相似，该属刀鲚和短颌鲚的分类问题一直存在较大争议。而澄清争议物种的有效性及它们的种间关系是资源开发和繁殖保护的科学基础。因此，迫切需要开发新的鲚属鱼类的有效分子标记研究，寻找区分各种的特异分子标记，这将对鲚属鱼类种群遗传结构、遗传多样性分析以及确定其分类地位具有重要意义。

微卫星（Microsatellite）又称为简单序列重复（SimpleSequenceRepeat,SSR），短串联重复（ShortTandemRepeat,STR）或简单序列长度多态性（SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSSLP），是近些年迅速发展起来的一种分子标记，是1-6个碱基串联重复序列，在至今研究的所有生物基因组中均有分布。其原理是利用SSR为引物进行PCR扩增，扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后进行多态性分析。在众多分子遗传标记中，微卫星标记具有多态性好、稳定性高、特异性高、共显性遗传、操作简便等特点，成为物种的基因型鉴定与品种保护、种质纯度评价和种质保存、多样性研究、基因和QTL分析、谱系分析和分子标记辅助选择育种、资源鉴定、连续图谱绘制和克隆并筛选大片段文库等领域的有用工具，是应用较为广泛的遗传标记。

发明内容

本发明的目的就是提供短颌鲚微卫星位点及多态性引物，即提供6个短颌鲚微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为短颌鲚物种有效性的鉴定、种群遗传多样性分析提供分子标记。

本发明通过磁珠杂交法从短颌鲚基因组DNA中筛选出6个微卫星序列分别是SEQIDNO：1-6。

微卫星序列还包括在严格条件下与上述的核苷酸序列杂交的，包含相同微卫星重复单位的核苷酸序列分子。

本发明的短颌鲚微卫星引物是从序列SEQIDNO：1-6的微卫星重复的侧翼序列上设计的正向、反向引物。

微卫星引物序列分别为SEQIDNO：7-18。

微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表1：

表1：6个微卫星位点及对应引物信息

位点	微卫星序列	正向引物名称/序列	反向引物名称/序列
				DHJ1	SEQ ID NO：1	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：8
DHJ2	SEQ ID NO：2	SEQ ID NO：9	SEQ ID NO：10
				DHJ3	SEQ ID NO：3	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：12
DHJ4	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：13	SEQ ID NO：14
				DHJ5	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：15	SEQ ID NO：16
DHJ6	SEQ ID NO：6	SEQ ID NO：17	SEQ ID NO：18

本发明的微卫星多态性引物用于短颌鲚种群遗传多样性检测，包括如下步骤：

步骤1：基因组DNA的提取：采用酚抽提法提取短颌鲚基因组DNA；

步骤2：微卫星PCR扩增：用微卫星引物扩增基因组DNA，获得短颌鲚个体微卫星扩增产物；

步骤3：扩增产物电泳：采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Goldview染色分型；

步骤4、遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENPOPVersion3.4计算遗传多样性参数；

上述的微卫星引物选自序列分别为SEQIDNO：7-18的微卫星引物。

本发明从短颌鲚基因组DNA中筛选出6个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获引物的扩增结果具有高的多态性和稳定性，可用于短颌鲚的种群遗传多样性检测，物种有效性鉴定以及分子辅助育种等领域。

具体实施方式

一、基因组DNA提取、酶切及回收：

1、用酚抽提法提取短颌鲚基因组DNA：

1)每个个体称取100mg尾鳍于1.5mLEppendorf管中，加入450μLSTE抽提缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0）、35μLSDS（10%）、15μL蛋白酶K（0.2%）。

2)颠倒混匀后，将Eppendorf管放入55℃水浴锅中消化3h左右至溶液澄清透明。

3)加入RNaseA至终浓度20μg/ml，37℃温浴1h。

4)加入700μLTris饱和酚，在DNA混合仪上振荡混匀30min，4℃下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中（注意用尖端剪平的1mL管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀）。

5)在上清液中加入等体积酚仿醇混合物（酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1），振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新Eppendorf管中。

6)上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸取上清液。

7)加入-20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，收集沉淀。

8)用70%乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μLTE（10mmol/LTris-HCl，pH8.0;0.1mmol/LEDTA，pH8.0），室温充分溶解。

2、酶切、回收及接头连接：

基因组DNA酶切：

50μL酶切体系包括：NEBBuffer5μL，BSABuffer0.5μL，短颌鲚基因组DNA200ng，MseI5U，ddH2O40μL。37℃酶切3h。

连接反应：

15μL连接体系包括：酶切样品10μL，MseI接头5pmol（MAAdapter序列见表2-1），10×T4LigaseBuffer1.5μL，T4-DNA连接酶2U，ddH2O补足至15μL。16℃过夜连接。

3、微卫星序列分离和PCR扩增：

1）PCR扩增：将连接产物稀释10倍，取2μL作为模板，将MseI—N（M-A，M-T，M-C，M-G，序列见表2-1）每条引物稀释至10μM混匀作为混合引物。25μL反应体系为：10×Taqbuffer2.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，dNTP2.5mmol/L）1.2μL，MseI—N引物1μL，Taqpolymerase0.2μL，ddH2O13.1μL。反应程序为：94℃变性5min；94℃30s，53℃1min，72℃1min（18个循环），72℃延伸20min。

表2MseI接头及引物

Tab2thesequenceofMseIadaptersandprimers

MseI 接头（Adapters）	TACTCAGGACTCAT
			GACGATGAGTCCTGAG
MseI—N （primers）	GATGAGTCCTGAGTAAN

注：MseI—N引物中，N表示包括所有4种可能的选择碱基N=A，T，C，G

Note:MseIprimer,N=A，T，C，G。

二、磁珠富集微卫星序列：

（1）杂交：扩增产物与探针Biotin-(GT)12+（AG）13杂交。100μL杂交反应体系包括：6×SSC+0.1%SDS70μL，Biotin-(GT)12+（AG）13（40μM）2μL，扩增产物28μL。混匀后在PCR仪上95℃变性5min后迅速降至68℃温育1h，取出冷却至室温。

（2）准备磁珠：取1—2mg充分摇匀的MagneSphere链霉亲和素顺磁颗粒(StreptavidinParamagneticpanicles，美国普洛麦格公司)，用300μL的TNE100仔细洗涤3次，洗涤完用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止。

（3）磁珠富集：将杂交混合液转入磁珠悬浮液，室温放置约30min，其间不断轻柔吹打，避免磁珠沉淀。

（4）磁珠洗脱：

A．非特异性洗脱：用400μLTEN1000在室温下洗涤10min（其间轻柔吹打，以防磁珠沉淀），重复3次；

B．特异性洗脱：分别用400μL0.2×SSC+0.1SDS和0.5SSC在室温下洗涤3次和1次（其间轻柔吹打，以防磁珠沉淀）。

C．目的片段收集：将洗涤后的磁珠悬浮于50μLTE缓冲液中，于PCR仪上99℃变性5min，迅速在磁力架中收集上清液（洗脱产物）。

（5）目的片段再扩增：25μL反应体系为：10×Taqbuffer2.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，dNTP2.5mmol/L）1.2μL，MseI—N引物1μL，Taqpolymerase0.2μL，ddH2O13.1μL。反应程序为：94℃变性5min；94℃30s，53℃1min，72℃1min（25个循环），72℃延伸20min。用PCR纯化试剂盒进行回收纯化后经1%的琼脂糖胶电泳检测回收效果并估测其浓度。

3）PCR扩增片断的克隆、测序：

（1）连接：将已纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接。10μL连接体系包括：pMD18-T（50ng/μL）1μL，目的DNA2μL，ddH2O2μL，LigationBuffer5μL。16℃连接过夜。

（2）转化：将连接产物转化到高效感受态细胞DH5α中。将10μLDNA连接产物加入到装有感受态细胞的1.5mL无菌离心管中（50μL感受态细胞需25ngDNA），轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30min。将管放入预加温至42℃的循环水浴中，准确反应90s，不要摇动试管，然后迅速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min。每管加400μLLB培养液，然后在摇床上37℃温育45min。使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。将适当体积已转化的感受态细胞转移到预先用4μL异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）溶液（200mg/mL）和40μLX-gal溶液（20mg/mL）涂布的AMP＋（氨苄青霉素）平板。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。

(3)含有微卫星DNA序列阳性克隆的PCR筛选：

从AMP＋平板上挑取单个白色菌落接种于800μLLB培养基（含AMP＋100μg/mL）中，37℃摇床上培养5h。作菌液PCR。25μL反应体系为：10×Taqbuffer2.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，dNTP2.5mmol/L）1.2μL，MseI—N引物1μL，Taqpolymerase0.2μL，ddH2O13.1μL，菌液5uL。反应程序为：94℃变性5min；94℃30s，53℃1min，72℃1min（25个循环），72℃延伸20min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。选取阳性克隆送生物公司测序。

三、微卫星引物

挑取140个阳性克隆进行测序，共得到125条含有微卫星DNA的序列。根据微卫星重复序列两端的侧翼序列，利用软件Primerpremier5设计40对微卫星引物，引物设计主要参数为：引物长度20±4bp，产物的长度为100-500bp；单个引物少于3个核苷酸的互补；保证两个引物的Tm值相差不超过4℃；两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对，(G+C)%含量近似(45%-55%)。并对这40对引物进行PCR扩增检测，最终有17对引物能稳定扩增出目的条带。

四、短颌鲚多态性微卫星位点引物的筛选及种群多样性检测

（1）筛选有多态性的引物：

采用酚抽提法提取32个个体的短颌鲚基因组DNA。用上述获得的17对引物扩增基因组。反应体系为25μL，包括10mmol/LdNTP1μL，10×buffer2.5μL，25mmol/LMgC122μL，8pmol/μL两侧引物各0.75μL，5UTaqDNA聚合酶0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL，用超纯水补足25μL。PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，复性30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸7min。4℃保存。PCR扩增产物采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Goldview染色分型。用PBR322/BsuRIMarker作为分子量内标，个体微卫星扩增产物用软件BIO-PROFIL来判断等位基因片段的具体数值，共得到6个具有多态性的微卫星标记；

（2）遗传多样性分析

使用Popgen32软件计算短颌鲚群体的观测杂合度（Ho）和期望杂合度值（He）并进行Hardy-Weinberg平衡（Hardy–Weinbergequilibrium，HWE）检验。其参数信如表3。

表3：6个微卫星位点的重复单位、引物的相关信息

其中没TM代表微卫星引物的退火温度，n代表等位基因数目，Ho代表观察杂合度，He代表期望杂合度。

用本发明的引物对30个短颌鲚基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从8到15个不等，平均等位基因数目为10.5个。观察杂合度（Ho)的范围从0.8667到1.0000，期望杂合度（He）的范围从0.8944到0.9497。

本发明的微卫星引物可用于短颌鲚种群遗传多样性检测、数量性状连锁作图（QTL）、遗传连锁作图以及个体的鉴定等。

SEQUENCELISTING

〈110〉江西省水产科学研究所

〈120〉短颌鲚微卫星位点及引物

〈160〉18

〈210〉1

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〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ1

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ccgctgacgcgccctgacggctttgtctgctccggca1117

〈210〉7

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ1p1

〈400〉7

tagtggaaagagaacaattcca22

〈210〉8

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ1p2

〈400〉8

atagagcaaatcaaggagaact22

〈210〉9

〈211〉23

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ2p1

〈400〉9

tcaaatacaggtattggtatggt23

〈210〉10

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ2p2

〈400〉10

gtgtaggaagactacgacataa22

〈210〉11

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ3p1

〈400〉11

aaggactgcaacaatagagc20

〈210〉12

〈211〉21

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ3p2

〈400〉12

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〈210〉13

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ4p1

〈400〉13

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〈210〉14

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ4p2

〈400〉14

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〈210〉15

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ5p1

〈400〉15

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〈210〉16

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ5p2

〈400〉16

caagacgattaagttgggtaac22

〈210〉17

〈211〉21

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ6p1

〈400〉17

gtatttccaaactctgtctca21

〈210〉18

〈211〉21

〈212〉DNA

〈213〉CoiliabrachygnathusDHJ6p2

〈400〉18

gaaaattttgcatatggggag21

Claims (4)

1.一种短颌鲚微卫星核苷酸，其特征在于：所述的微卫星核苷酸的序列为SEQIDNO：1。

2.在权利要求1所述的微卫星核苷酸的侧翼序列上设计的短颌鲚微卫星引物，其特征在于：所述的微卫星引物序列为SEQIDNO：7-8。

3.如权利要求2所述的短颌鲚微卫星引物在短颌鲚种群遗传多样性检测中的应用。

4.一种利用权利要求2所述短颌鲚微卫星引物进行短颌鲚种群遗传多样性检测的方法，包括如下步骤：

步骤（1）：基因组DNA的提取：采用酚抽提法提取短颌鲚基因组DNA；

步骤（2）：微卫星PCR扩增：用权利要求2所述微卫星引物扩增基因组DNA，获得短颌鲚个体微卫星扩增产物；

步骤（3）：扩增产物电泳：采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Goldview染色分型；

步骤（4）：遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENPOPVersion3.4计算遗传多样性参数。