CN103725688A - 鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鸡新城疫病毒抗体水平相关的两种分子标记，分别位于SEQ ID NO：2所示序列中的第50位碱基处的G/A碱基突变，及SEQ ID NO：3所示序列中的第167位碱基处的T/C碱基突变。还提供了这两种分子标记的鉴别方法及其在鸡新城疫病毒抗体水平性状方面的分子标记辅助选择中的应用。这两种分子标记均是以鸡ROBO2基因的DNA序列为模板，选择SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3及所示的引物进行扩增。本发明所使用的检测方法准确性高、成本低。通过对上述G/A及T/C突变位点的检测，在育种过程中选择TT或者GG基因型的个体，在不影响鸡生长性状的前提下，提高鸡新城疫病毒抗体水平。

Description

鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用

技术领域

本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，具体地说，是涉及用于鸡标记辅助选择的鸡新城疫病毒抗体水平相关的两种分子标记及其鉴别方法和应用。 

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的严重危害家禽养殖的呼吸道传染病，新城疫病毒属于副粘病毒科。新城疫在我国各地均有发生，具有发病率和死亡率相对较高，成年蛋鸡产蛋率、蛋品质下降，饲料报酬低等危害，给养禽业带来了巨大的经济损失。目前在家禽养殖过程中都是通过接种疫苗来预防新城疫，但是随着新城疫疫苗免疫密度的提高和广泛应用，养殖成本进一步提升。同时，一些鸡群尽管按照免疫程序开展了新城疫疫苗防疫，但是由于病毒免疫应答水平存在个体差异，仍然会出现非典型鸡新城疫疫情。宿主对新城疫的抗性研究仍是一种挑战，我们前期利用鸡高密度单核苷酸多态性芯片进行全基因组关联分析发现与鸡新城疫病毒抗体水平密切相关的基因组区域，该基因组区域内的ROBO2基因上的突变与新城疫病毒抗体水平极显著相关。该基因是影响鸡对新城疫病毒免疫应答的候选基因。但目前从遗传的角度来说，还没有建立有关ROBO2基因作为鸡新城疫病毒抗体水平分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡新城疫病毒抗体水平分子标记辅助选择也未见应用。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记及其鉴别方法和应用。 

本发明通过克隆与鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的cDNA全长序 列，寻找该基因编码区的突变位点以及相应的多态性检测方法，通过性状关联分析的应用，为鸡的标记辅助选择提供有用的分子标记。另外本发明还涉及分子标记的鉴别方法以及在鸡标记辅助选择上的应用。 

本发明克隆得到与鸡新城疫抗体水平相关基因ROBO2的全长cDNA序列，该全长cDNA序列包括完整的编码区序列及3’UTR和5’UTR，如序列表SEQ ID NO：1所述，该序列全长为5269bp。 

本发明通过对上述克隆所获得的cDNA片段分析，结果发现可作为鸡标记辅助选择应用的两种分子标记，这两种标记与鸡新城疫病毒抗体水平相关。 

分子标记一的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，在该序列的第50位的G碱基突变为A碱基；该突变位点位于鸡ROBO2基因的全长cDNA序列的1418bp处，如序列表SEQ ID NO：1所示。因此，为了方便表述，将标记一的G/A突变命名为1418G>A。 

分子标记二的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，在该序列的第167位碱基处T/C碱基突变。T碱基突变为C碱基，导致AluI-RFLP多态性；该突变位点位于鸡ROBO2基因的全长cDNA序列的2462bp处，如序列表SEQ ID NO：1所示。因此，为了方便表述，将标记二的T/C突变命名为2462T>C。 

分子标记一（1418G>A）：以鸡ROBO2基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006088.3）为模板，设计引物扩增该基因部分序列。扩增所得到的序列包括部分第5外显子，如序列表SEQ ID NO：2所述，该序列全长为87bp。所用的引物为： 

RS-exon5-F：5'-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3'， 

RS-exon5-R：5'-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3'。 

分子标记二（2462T>C）：以鸡ROBO2基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006088.3）为模板，设计引物扩增该基因部分序列。扩增所得到的序列包括完整的第12外显子和部分第11内含子、部分第12内含子，如序列表SEQ ID NO：3所述，该序列全长为286bp。所用的引物为： 

RS-exon12-F：5'-TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3'， 

RS-exon12-R：5'-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3'。 

本发明的第二个目的是提供了两种分子标记的鉴别方法。 

分子标记一（1418G>A）：以鸡ROBO2基因的DNA序列为模板，通过焦磷酸测 序仪，利用RS-exon5-F/RS-exon5-R引物进行扩增，PS-exon5-SR引物进行测序，可以准确判断该突变位点的基因型。因为在扩增引物的正向引物RS-exon5-F的5’末端做生物素标记，设计了反向的测序引物，所以测序结果为TT基因型，则是发生突变的AA基因型，测序结果为CC基因型，则是没有发生突变的GG野生型，测序结果为TC基因型，则是杂合型AG。 

用到的引物： 

扩增引物RS-exon5-F：5'-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3'（5’末端标记有生物素）， 

扩增引物RS-exon5-R：5'-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3'。 

测序引物PS-exon5-SR：5'-CTTCTTCCAGCGGAC-3'。 

分子标记二（2462T>C）：以鸡ROBO2基因的DNA序列为模板，利用RS-exon12-F/RS-exon12-R引物进行扩增，将PCR扩增所得到的产物利用AluI内切酶进行酶切反应，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。该序列上存在2个AluI内切酶识别位点—“AGTC”，其中一个识别位点位于该序列的第257-260位，该区域没有突变位点，所以被检测个体均可以在该序列处切开为258bp和28bp两条序列，但是由于28bp的序列太短了，琼脂糖凝胶电泳检测不到该序列对应的条带。如果只有一条258bp的条带，则DNA双链在该突变位点处均为C碱基，判断为CC基因型；若有两条分别为165bp和93bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因型；若有三条分别为258bp、165bp和93bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处一条链为C碱基，另一条链为T碱基，判断为TC基因型。 

本发明的第三个目的是提供该分子标记在鸡分子标记辅助选择中的应用，特别是鸡新城疫抗体水平选择育种中的应用。 

通过本发明所提供的技术方案，还可以制备成该两种分子标记的鉴别试剂盒。 

本发明的有益效果是，通过对上述G/A或者T/C突变位点的检测，能知道目标鸡群新城疫抗体水平这一免疫性状的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群新城疫抗体水平的一致性。另外，本发明所使用的检测方法准确性高、成本低、效率高。 

附图说明

图1为利用引物Ct1F/Ct1R克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的部分cDNA片段1的电泳图片； 

图2是利用引物Ct2F/Ct2R克隆所得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的部分cDNA片段2的电泳图片； 

图3是利用5’RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的5’UTR片段的电泳图片； 

图4是利用3’RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的3’UTR的电泳图片； 

图5是实施例1中鸡ROBO2基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记一（1418G>A）的片段的电泳图片，片段大小为87bp（琼脂糖胶浓度为1.5%）； 

图6是实施例1中鸡ROBO2基因外显子5上的G/A突变位点（分子标记一：1418G>A）的三种基因型（GG，AA和AG）的焦磷酸测序结果； 

图7是实施例1中鸡ROBO2基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记二（2462T>C）的片段的电泳图片，片段大小为286bp（琼脂糖胶浓度为1.5%），其中，M泳道为DNA分子量标准（DL2000）； 

图8是本发明中鸡ROBO2基因外显子12上的AluI-RFLP的三种基因型(TT，TC和CC)电泳图谱（琼脂糖胶浓度为2.0%），M泳道为DNA分子量标准（DL2000）。 

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 

序列表SEQ ID NO：1是本发明将所获得的鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记ROBO2全部序列利用DNAStar中的SeqMan程序拼接成一条完整的cDNA序列，包含3621bp CDS全长，662bp5’UTR和986bp3’UTR。 

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的第一只国内地方鸡种“惠阳胡须鸡” ROBO2基因包括分子标记一（1418G>A）在内的核苷酸序列。 

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的第一只国内地方鸡种“惠阳胡须鸡”ROBO2基因包括分子标记二（2462T>C）在内的核苷酸序列。 

实施例1:鸡新城疫抗体水平分子检测方法的建立 

（一）ROBO2基因cDNA序列克隆 

以鸡ROBO2基因的mRNA序列（参考序列GeneBank登录号为XM_416674.3）为模板，设计两对引物Ct1F/Ct1R，Ct2F/Ct2R克隆得到如图1和图2所示的cDNA序列；图1为利用引物Ct1F/Ct1R克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的部分cDNA片段1的电泳图片；图2是利用引物Ct2F/Ct2R克隆所得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的部分cDNA片段2的电泳图片。根据所获得的cDNA序列设计三条下游引物5GSP-R1、5NGSP-R2以及5NGSP-R3，以SMART cDNA为模板，用上述三条下游引物和5’RACE引物扩增该基因的5’末端，得到1279bp的扩增产物，其序列如图3所示，图3是利用5’RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的5’UTR片段的电泳图片。根据所获得的cDNA序列设计两条上游游引物3GSP-F1、3NGSP-F2，以SMARTcDNA为模板，用上述两条上游引物和3’RACE引物扩增该基因的3’末端，得到1518bp的扩增产物，其序列如图4所示，图4是利用3’RACE克隆得到的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2的3’UTR的电泳图片。 

将上述所获得的四条序列利用DNAStar中的SeqMan程序进行拼接得到鸡ROBO2基因的cDNA全长，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。该序列是本发明将所获得的鸡新城疫病毒抗体水平相关基因ROBO2全部序列利用DNAStar中的SeqMan程序拼接成一条完整的cDNA序列，包含3621bp CDS全长，662bp5’UTR和986bp3’UTR。 

扩增ROBO2基因cDNA序列的引物如下所示（分4段扩增）： 

第一段：扩增部分cDNA序列 

Ct1F：5'-GCGAGTGGAAACTGACAAAGATGAT-3'， 

Ct1R：5'-TATGGGTTGTGGCTCACTTTTCACT-3'。 

第二段：扩增部分cDNA序列 

Ct2F：5'-CTACCGAGTAATGTATCGCCAAACG-3'， 

Ct2R：5'-AGGAGGTTGTGTATTGCTTTGGATG-3'。 

第三段：5’RACE扩增5’UTR 

5‘RACE上游引物：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATC 

AACGCAGAGT-3'/5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'， 

5GSP-R1：5'-CATCCTTCTTCCAGCGGACGGTCGG-3'。 

5‘RACE上游槽式引物：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'， 

5NGSP-R2：5'-TCCAGTAGATGGTAGGCTCAGGGTGTCC-3'。 

5‘RACE上游槽式引物：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'， 

5NGSP-R3：5'-CATAACTTCCTTCGTCAGGTTTACTCC-3'。 

第四段：3’RACE扩增3’UTR 

3GSP-F1：5'-GTGTTCCCCTCCCACCCCCTCCTGT-3'， 

3‘RACE下游引物：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATC 

AACGCAGAGT-3'/5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'。 

3NGSP-F2：5'-TTCATCACCTGCGATCTCCTTTGGG-3'， 

3‘RACE下游槽式引物：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'。 

（二）PCR扩增条件： 

总体积为25μL的PCR反应体系中加入DNA模板1μL，2×PCR反应混合物12.5μL，10mM引物前后各1μL，Taq DNA聚合酶0.625U,双蒸水8.25μL，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度见表1，表1为引物的退火温度和延伸时间的列表。退火时间45s，72℃延伸时间见表1，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。 

表1：引物的退火温度和延伸时间 

（三）寻找分子标记： 

以鸡ROBO2基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006088.3）为模板，设计引物RS-exon5-F/RS-exon5-R扩增该基因外显子5部分序列（分子标记一：1418G>A）， 

RS-exon5-F：5'-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3'，其中该引物序列的5’末端标记有生物素， 

RS-exon5-R：5'-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3'。 

或者引物RS-exon12-F/RS-exon12-R扩增该基因的外显子12及部分内含子11、部分内含子12的序列（分子标记二：2462T>C）。 

RS-exon12-F：5'-TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3'， 

RS-exon12-R：5'-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3'； 

选取两只白来航鸡和两只惠阳胡须鸡的DNA做模板，进行PCR扩增，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，以用来寻找分子标记的片段的电泳图片。结果如图5、7所示，图5是实施例1中鸡ROBO2基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记一（1418G>A）的片段的电泳图片，片段大小为87bp（琼脂糖胶浓度为1.5%）；图7是实施例1中鸡ROBO2基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记二（2462T>C）的片段的电泳图片，片段大小为286bp（琼脂糖胶浓度为1.5%），其中，M泳道为DNA分子量标准（DL2000）。 

将PCR产物回收、克隆、测序，获得的序列如序列表SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11所示。SEQ ID NO：4、5、6、7是分子标记一检测得到的序列；其中，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5是白来航鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7是惠阳胡须鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列。SEQ ID NO：8、9、10、11是分子标记二检测得到的序列；其中，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9是白来航鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11是惠阳胡须鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列。 

通过Cluster W比对发现分别存在一处SNP，与白来航鸡种比对发现惠阳胡须鸡种在序列SEQ ID NO：2的50位由G碱基突变为A碱基（分子标记一：1418G>A），在序列SEQ ID NO：3的167处由T碱基突变为C碱基，突变为C碱基后恰好破坏了内切酶AluI的识别位点，利用扩增引物RS-exon12-F/ RS-exon12-R进行酶切分型鉴定（分子标记二：2462T>C）。分子标记一在ROBO2基因的cDNA全长序列（SEQ ID NO：1所示）上的位置是1418bp处，分子标记二在ROBO2基因的cDNA全长序列（SEQ ID NO：1所示）上的位置是2462bp处。实验具体操作步骤如下： 

1、PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒（购自Promega公司）纯化PCR产物，按照该试剂盒说明书操作。 

2、连接反应：将纯化的PCR产物与pMDl9-T Vector（购自TaKaRa公司）连接，连接反应总体积是10μL，其中包括2×快速连接缓冲液，2.5μL；载体（50ng），0.5μL；回收DNA，7-8μL。稍微弹打混合均匀，于16℃连接1h以上或者4℃连接过夜。 

3、感受态细胞的制备：从37℃培养箱中培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃摇床振荡培养3h，转接1mL菌液于含有300mL LB的盐水瓶中，继续在37℃摇床振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。 

4、转化：在灭菌的1.5mL离心管中加入100μL感受态细胞，于冰上加入连接产物5μL，用移液枪吹打均匀，冰浴30min；将离心管置于42℃的循环水浴中（勿震动），热激90s后，迅速冰浴2min；再在离心管中加入400μL LB培养液，在37℃摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60min；离心，去除部分上清液，取100μL复苏后的菌液布于含Amp的平板上，涂匀；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37℃培养14-16小时，观察有无菌落长出。 

5、阳性克隆子的鉴定及测序：从平板上挑取转化好的菌斑接入含400μL LB的1.5mL离心管中并于37℃摇床振摇培养约8h左右。以此菌液为模板，选用原引物或测序的通用引物M13（上海生工生物工程技术服务有限公司提供）进行PCR扩增（退火温度58-60℃）。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由上上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 

在本实施例中，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特 异的PCR产物，结果如图5、7所示，图5是实施例1中鸡ROBO2基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记一（1418G>A）的片段的电泳图片，片段大小为87bp（琼脂糖胶浓度为1.5%）；图7是实施例1中鸡ROBO2基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记二（2462T>C）的片段的电泳图片，片段大小为286bp（琼脂糖胶浓度为1.5%），其中，M泳道为DNA分子量标准（DL2000）。 

将PCR产物回收、纯化后克隆，测序，获得的序列如序列表SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11所示。SEQ ID NO：4、5、6、7是分子标记一检测得到的序列；其中，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5是白来航鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7是惠阳胡须鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列。SEQ ID NO：8、9、10、11是分子标记二检测得到的序列；其中，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9是白来航鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11是惠阳胡须鸡ROBO2基因PCR扩增片段的核苷酸序列。 

（四）分子标记一（1418G>A）的焦磷酸测序检测方法建立： 

在引物PS-exon5-F/R的正向引物PS-exon5-F的5'末端标记生物素进行PCR扩增。设计一条测序引物PS-exon5-SR，该引物是一条15个碱基的反向引物，因此焦磷酸测序得到的突变位点为G/A突变位点的互补碱基即C/T。 

将正向引物5'末端标记生物素的引物对PS-exon5-F/R PCR扩增所得到的产物在PyroMark ID焦磷酸测序系统（Biotage,Uppsala,Sweden）进行SNP分析，操作方法按照仪器使用方法进行，SNP数据用PyroMark ID SNP软件（Biotage）进行分析，分析结果如图6所示。图6是实施例1中鸡ROBO2基因外显子5上的G/A突变位点（分子标记一：1418G>A）的三种基因型（GG，AA和AG）的焦磷酸测序结果；其中所示的TT基因型是发生突变的AA基因型，测序结果为CC基因型是没有发生突变的GG野生型，测序结果为TC基因型是杂合型AG。 

寻找分子标记及检测50位G/A碱基突变所用到的引物序列如下所示： 

RS-exon5-F：5'-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3'（5’末端标记有生物素）， 

RS-exon5-R：5'-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3', 

PS-exon5-SR：5'-CTTCTTCCAGCGGAC-3'。 

（五）分子标记二（2462T>C）PCR-AluI-RFLP检测方法建立： 

该片段167处的T/C碱基突变，恰好可以被内切酶AluI识别，将引物 RS-exon12-F/R所扩增得到的PCR产物6μL，10×缓冲液1μL，限制性内切酶AluI0.4μL（4U），加双蒸水补至10μL，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置6h，用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，成像系统观察酶切结果，记录基因型。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中C是没有形成酶切位点的等位基因，T是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中CC型为未发生酶切的纯合型（电泳检测时只有258bp一条DNA带），TT型为发生酶切的纯合型（电泳检测时出现165bp和93bp两条DNA带），TC为杂合型（电泳检测时出现258bp、165bp和93bp三条DNA带），详见图8。图8是本发明中鸡ROBO2基因外显子12上的AluI-RFLP的三种基因型(TT，TC和CC)电泳图谱（琼脂糖胶浓度为2.0%），M泳道为DNA分子量标准（DL2000）。 

寻找分子标记及检测167位T/C碱基突变（分子标记二：2462T>C）所用到的引物序列如下所示： 

RS-exon12-F：5'-TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3'， 

RS-exon12-R：5'-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3'。 

实施例2：1418G>A及2462T>C两个突变位点多态性在各鸡种中分布情况的检测及应用 

（一）1418G>A及2462T>C两个突变位点多态性在各鸡种中分布情况的检测 

本例中收集了10个品种的鸡血液DNA，样本均来自广东智威农业科技股份有限公司。按照实施例1所述的方法对以上鸡种进行了焦磷酸测序及PCR-AluI-RFLP检测，两个突变位点在不同鸡种中的等位基因频率如表2所示，结果显示在快长型A系、惠阳胡须鸡、丝羽乌骨鸡、北京油鸡、麻黄鸡、文昌鸡、霞烟鸡、杏花鸡以及清远麻鸡中均为G（1418G>A）、T（2462T>C）等位基因占优势，而只有白来航鸡种中分别是A（1418G>A）、C（2462T>C）等位基因占优势。表2显示10个鸡种中ROBO2基因T/C突变多态性的基因型和基因频率。 

表2 

（二）鸡ROBO2基因上1418G>A及2462T>C两个分子标记在群体中的应用 

用于统计分析的试验材料包括快长型A系与惠阳胡须鸡的F2代总共800个个体，所分析的性状主要为新城疫病毒抗体水平及生长性状。生长性状包括6，8，10以及12周的活体重；7-8，9-10以及11-12周的料重比。 

申请人采用SAS系统的JMP软件中（SAS Institute Inc.,Cary,NC）GLM程序进行性状与基因型间的关联分析，并进行显著性检验，所采用模型为： 

Y_ijklm=μ+S_i+H_j+S_k+D_kl+G_m+e_ijklm

Y_ijklm为性状表型值，μ为平均值，G_m为基因型效应；S_i、H_j、S_k、D_kl为固定效应，分别为性别、批次、父亲及父亲组内母亲效应；e_ijklm为残差效应。 

基因型检测结果表明：在所检测的800头快长型A系×惠阳胡须鸡F2代个体中，1418G>A突变位点：GG基因型个体383个，AG基因型个体320个，AA基因型个体62个；2462T>C突变位点：TT基因型个体387个，TC基因型个体383个， 未检测到TC基因型。不同基因型与新城疫病毒抗体水平及生长性状的统计结果总结于表3，表3是1418G>A及2462T>C突变位点基因型与鸡新城疫病毒抗体水平及生长性状的统计分析表。 

表3 

注：n:数量；NDV_S/P：新城疫病毒抗体水平；BW6,8,10,12：6,8,10以及12周的活体重，单位：g；FCR7–8,9–10,11–12：7–8,9–10及11–12周的料重比；1表型值是将μ+e_ijklm通过Johnson Su进行正态分布转化的；a,b表示P<0.05，达到显著水平。 

由表3可以看出，ROBO2基因上1418G>A及2462T>C两个突变位点多态性均与鸡新城疫病毒抗体水平呈极显著相关，GG基因型（1418G>A）及TT基因型（2462T>C）个体的新城疫病毒抗体S/P值显著高于AA、AG基因型个体（1418G>A），TT基因型个体显著高于TC基因型个体（2462T>C）。但1418G>A及2462T>C两个突变位点多态性均与6，8，10以及12周的活体重、7-8，9-10以及11-12周的料重比等生长性状没有显著相关性。 

本发明所述的分子标记可应用在鸡新城疫病毒抗体水平选择育种中。在育种过程中选择GG基因型（1418G>A）或者TT基因型（2462T>C）的个体在一定程度上能够提高鸡新城疫病毒抗体水平，同时不影响其生长性状。此外，应用本 发明所述的分子标记可以对鸡群体进行分子检测，选留基因型一致的个体，进而提高群体在新城疫抗体水平的均一性，有利于制定整个群体的免疫程序，节约成本。 

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 

Claims (5)

1.鸡新城疫病毒抗体水平相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括分子标记一和分子标记二：

所述分子标记一为如SEQ ID NO：2所示序列中的第50位碱基处G/A碱基突变，

所述分子标记二为如SEQ ID NO：3所示序列中的第167位碱基处T/C碱基突变。

2.一种鉴别权利要求1所述的分子标记一的方法，其特征在于，包括以下步骤：以鸡ROBO2基因的DNA序列为模板，选择如下引物进行扩增及焦磷酸测序检测：

RS-exon5-F：5'-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3'，其中该引物序列的5’末端标记有生物素，

RS-exon5-R：5'-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3'，

PS-exon5-SR：5'-CTTCTTCCAGCGGAC-3'；

若测序结果为TT基因型，则是发生突变的AA基因型；

若测序结果为CC基因型，则是没有发生突变的GG野生型；

若测序结果为TC基因型，则是AG杂合型。

3.一种鉴别权利要求1所述的分子标记二的方法，其特征在于，包括以下步骤：以鸡ROBO2基因的DNA序列为模板，选择如下引物扩增：

RS-exon12-F：5'-TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3'，

RS-exon12-R：5'-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3'；

将所得扩增产物用限制性内切酶AluI酶切，

若只有一条带，则该突变位点处均为C碱基；

若有二条带，则突变位点处均为T碱基；

若有三条带，则说明该突变位点处一条链为C碱基，另一条链为T碱基。

4.权利要求1所述的分子标记在鸡新城疫病毒抗体水平性状方面的分子标记辅助选择中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为在鸡新城疫病毒抗体水平选择育种中的应用。

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