CN104694650B - 一种鉴别鸡饲料利用效率的分子检测方法及其应用和试剂盒 - Google Patents
一种鉴别鸡饲料利用效率的分子检测方法及其应用和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明通过克隆获得鸡饲料利用效率相关基因组片段，以该序列的第158位碱基处A/T碱基突变作为鸡标记辅助选择应用的一种分子标记。以鸡DNA序列为模板，选择M‑promoter‑F/M‑promoter‑R引物扩增，将所得扩增产物用限制性内切酶BsaBI酶切，观察条带的不同。本发明还提供了该方法在鸡饲料利用效率性状方面的分子标记辅助选择中的应用，特别是鸡饲料利用效率选择育种中的应用，以及该种分子标记的鉴别试剂盒。本发明的检测方法准确性高、成本低。通过对A/T突变位点的检测，在育种过程中选择AA基因型的个体，在不影响鸡生长性状的前提下，提高鸡的饲料利用效率，节约成本，高效生产。
Description
技术领域
本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，具体地说，是一种涉及用于鸡标记辅助选择的鸡饲料利用效率相关的一种分子标记鉴别方法及其应用和试剂盒。
背景技术
动物饲料成本几乎是任何动物生产系统的主要盈利决定因素。饲料大约占肉鸡生产成本的70％左右，因此提高饲料效率将减少肉鸡生长所要求的饲料采食量、生产成本和氮浪费。饲料利用效率，即动物采食饲料的利用能力包括了复杂的生物学过程及同环境的互作，为克服由于饲料采食量同动物的体型大小和生产水平高度相关因而使饲料效率高度复杂化的特性，以及阐明饲料采食量同生产系统效率的关系，先后发展出了相对生长率(Relative growth rate，RGR)、饲料转化率(Feed conversion ratio，FCR)、Kleiber比值、生长部分效率(Partial efficiency of growth，PEG)、剩余采食量(Residual feedintake，RFI)等，并反映出了饲料效率的数学和生物学的不同方面，其中FCR在过去得到了广泛应用，但FCR缺乏对采食量和体增重的遗传独立性，因而在不直接影响体重的情况下很难提高。然而RFI以能量采食和能量需求为基础，是一个更敏感和更精确度量饲料利用效率的性状。联合国粮农组织(FAO，2007)建议“以RFI为基础的选择方案作为提高内在效率的方法，这对所有的物种和所有的生产系统是一个重要的标准”。我们前期利用鸡高密度单核苷酸多态性芯片进行全基因组关联分析发现与鸡RFI密切相关的基因组区域，该基因组区域内的MIR1596基因附近的突变与RFI极显著相关。该基因是影响鸡RFI的候选基因，即也是影响鸡饲料利用效率的候选基因。但目前从遗传的角度来说，还没有建立有关MIR1596基因作为鸡饲料利用效率分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡饲料利用效率分子标记辅助选择也未见应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供了一种鸡饲料利用效率相关的分子鉴别方法及其应用和试剂盒。
本发明通过克隆与鸡饲料利用效率相关microRNA miR-1596的前体基因MIR1596以及其上下游基因组序列，寻找该基因及其调控区的突变位点以及相应的多态性检测方法，通过性状关联分析的应用，为鸡的标记辅助选择提供有用的分子标记。
本发明克隆得到与鸡饲料利用效率相关miR-1596的前体基因MIR1596序列以及3'和5'侧翼区基因组序列，如序列表SEQ ID NO：1所述，该序列全长为1228bp，包括该基因全部序列及部分调控区。所用的引物为：
MIR1596-F：5'-ATCACCCTCTGACTTGGC-3'，
MIR1596-R：5'-GTGAAGTGAGCGTTAGTTAG-3'。
本发明通过对上述克隆所获得的基因组片段分析，结果发现可作为鸡标记辅助选择应用的一种分子标记，这一种标记与鸡饲料利用效率指标RFI和FCR都相关。
分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列的第158位碱基处有A/T碱基突变。该突变位点位于鸡MIR1596基因上游序列的95bp处，因此，为了方便表述，将标记的A/T突变命名为MIR1596.-95A>T。
本发明的第二个目的是提供了一种鸡饲料利用效率相关的分子鉴别方法。该鉴别方法如下，以如SEQ ID NO：1所示序列中的第158位碱基作为分子标记，检测所述第158位的碱基处A/T碱基突变。具体包括以下步骤：以鸡的DNA序列为模板，选择如下引物扩增：
M-promoter-F：5'-TGCGGCGAGGAGTTGGAC-3'，
M-promoter-R：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGA
AACAGCTATGACCTAAATGACACACAAATCAAACCCAGA-3'；
将所得扩增产物用限制性内切酶BsaBI酶切，若只有一条带，则该突变位点处均为T碱基；若有两条带，则突变位点处均为A碱基；若有三条带，则说明该突变位点处一条链为A碱基，另一条链为T碱基。
本发明还提供了该方法在鸡饲料利用效率性状方面的分子标记辅助选择中的应用，特别是鸡饲料利用效率选择育种中的应用。
通过本发明所提供的技术方案，还可以制备成该种分子标记的鉴别试剂盒。本发明还提供了一种鉴别鸡饲料利用效率的分子检测试剂盒，所述试剂盒包含M-promoter-F/M-promoter-R引物、PCR反应混合物、Taq DNA聚合酶、双蒸水、缓冲液和限制性内切酶BsaBI，所述M-promoter-F/M-promoter-R引物序列如下：
M-promoter-F：5'-TGCGGCGAGGAGTTGGAC-3'，
M-promoter-R：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGAAA
CAGCTATGACCTAAATGACACACAAATCAAACCCAGA-3'。
本发明的有益效果是，通过对上述A/T突变位点的检测，能知道目标鸡群RFI或FCR这两个饲料利用效率性状的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群饲料利用效率。另外，本发明所使用的检测方法准确性高、成本低、效率高。
附图说明
图1是利用引物MIR1596-F/MIR1596-R克隆得到的鸡饲料利用效率相关基因MIR1596的全部基因序列及上下游部分调控区DNA片段的电泳图；
图2是本发明中分子标记(MIR1596.-95A>T)三种基因型(AA，AT和TT)的部分测序图；
图3是本发明中分子标记(MIR1596.-95A>T)的PCR-BsaBI-RFLP的三种基因型(AA，AT和TT)电泳图谱(琼脂糖胶浓度为2.5％)，M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
序列表中SEQ ID NO：1所示序列是本发明以国内地方鸡种“惠阳胡须鸡”DNA克隆所获得的与鸡饲料利用效率相关基因MIR1596的全部核苷酸序列及其上下游部分核苷酸序列，片段大小为1228bp。
序列表中SEQ ID NO：5所示序列是本发明用于分子标记检测而克隆获得的第一只国内地方鸡种“惠阳胡须鸡”MIR1596基因上游包括分子标记MIR1596.-95A>T在内的核苷酸序列。
实施例1:鉴别鸡饲料利用效率的分子检测方法的建立
(一)MIR1596基因DNA序列克隆及分子标记筛查
以鸡参考基因组(Gallus_gallus-4.0)中MIR1596基因及其上下游DNA序列为模板，以两只国内地方鸡种“惠阳胡须鸡”和两只“丝羽乌骨鸡”为材料，设计一对引物MIR1596-F/MIR1596-R用于MIR1596基因DNA序列克隆及分子标记筛查，引物序列分别为MIR1596-F：5'-ATCACCCTCTGACTTGGC-3'，MIR1596-R：5'-GTGAAGTGAGCGTTAGTTAG-3'。PCR扩增条件包括总体积为25μL的PCR反应体系中加入DNA模板1μL，2×PCR反应混合物12.5μL，10mM引物前后各1μL，Taq DNA聚合酶0.625U，双蒸水8.25μL，PCR条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。在本实例中，利用引物MIR1596-F/MIR1596-R扩增的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物，结果如图1所示，图1是利用引物MIR1596-F/MIR1596-R扩增得到的MIR1596基因的全部序列及上下游部分调控区DNA片段的电泳图片，片段大小为1228bp(琼脂糖胶浓度为1％)，其中M泳道为DNA分子量标准(DL2000)，1、2、3和4泳道分别为第1和第2只惠阳胡须鸡以及第1和第2只丝羽乌骨鸡。
将PCR产物回收、克隆、测序，获得的序列如序列表SEQ ID NO：1、2、3和4所示。其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是惠阳胡须鸡PCR扩增片段的核苷酸序列，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是丝羽乌骨鸡PCR扩增片段的核苷酸序列。序列包括了MIR1596基因全部90bp序列，以及其5’侧翼区252bp序列和3’侧翼区886bp序列。
将以惠阳胡须鸡与丝羽乌骨鸡DNA为模板的克隆序列通过Cluster W比对发现存在一处SNP，即相对于惠阳胡须鸡种而言，丝羽乌骨鸡在序列SEQ ID NO：3的158位由A碱基突变为T碱基(分子标记MIR1596.-95A>T)，位于鸡MIR1596基因上游序列的95bp处。突变位点附近区域的序列图如图2所示，图2是本实施例1中分子标记MIR1596.-95A>T三种基因型(AA，AT和TT)的部分测序图。
实验具体操作步骤如下：
1、PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照该试剂盒说明书操作。
2、连接反应：将纯化的PCR产物与pMDl9-T Vector(购自TaKaRa公司)连接，连接反应总体积是10μL，其中包括2×快速连接缓冲液，2.5μL；载体(50ng)，0.5μL；回收DNA，7-8μL。稍微弹打混合均匀，于4℃连接过夜。
3、感受态细胞的制备：从37℃培养箱中培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃摇床振荡培养3h，转接1mL菌液于含有300mL LB的盐水瓶中，继续在37℃摇床振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
4、转化：在灭菌的1.5mL离心管中加入100μL感受态细胞，于冰上加入连接产物5μL，用移液枪吹打均匀，冰浴30min；将离心管置于42℃的循环水浴中(勿震动)，热激90s后，迅速冰浴2min；再在离心管中加入400μL LB培养液，在37℃摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60min；离心，去除部分上清液，取100μL复苏后的菌液布于含Amp的平板上，涂匀；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37℃培养14-16小时，观察有无菌落长出。
5、阳性克隆子的鉴定及测序：从平板上挑取转化好的菌斑接入含400μL LB的1.5mL离心管中并于37℃摇床振摇培养约8h左右。以此菌液为模板，选用原引物或测序的通用引物M13(上海生工生物工程技术服务有限公司提供)进行PCR扩增(退火温度58-60℃)。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由上上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
(二)分子标记(MIR1596.-95A>T)PCR-BsaBI-RFLP检测方法和检测试剂盒的建立：
本发明的鉴别鸡饲料利用效率的分子检测试剂盒，包含M-promoter-F/M-promoter-R引物、PCR反应混合物、Taq DNA聚合酶、双蒸水、缓冲液和限制性内切酶BsaBI，所述M-promoter-F/M-promoter-R引物序列如下：
M-promoter-F：5'-TGCGGCGAGGAGTTGGAC-3'，
M-promoter-R：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGAAA
CAGCTATGACCTAAATGACACACAAATCAAACCCAGA-3'。
运用上述试剂盒对鸡饲料效率进行鉴别的时候，在筛选到位于鸡MIR1596基因上游序列的95bp处的分子标记(MIR1596.-95A>T)的基础上，利用引物M-promoter-F/M-promoter-R进行PCR，将扩增所得到的产物利用BsaBI内切酶进行酶切反应，2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。该序列上存在1个BsaBI内切酶识别位点“GATNNNNATC”，该识别位点位于序列SEQ ID NO：5的第420-429位，若被检测个体该区域没有突变，则可以在该序列处切开为424bp和65bp两条序列。利用琼脂糖凝胶电泳图检测，如果只有一条489bp的条带，则DNA双链在该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因型；若有两条分别为424bp和65bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处均为A碱基，判断为AA基因型；若有三条分别为489bp、424bp和65bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处一条链为A碱基，另一条链为T碱基，判断为AT基因型。
产物序列如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。序列表SEQ ID NO：5和SEQID NO：6中第427位处存在的A/T碱基突变，即为鸡MIR1596基因上游序列的95bp处的分子标记，该处为A碱基时恰好可以被内切酶BsaBI所识别，而为T碱基存在时则破坏了内切酶BsaBI识别区。
利用本试剂盒对鸡饲料效率进行鉴别，以鸡MIR1596基因上游DNA序列为模板，利用M-promoter-F/M-promoter-R引物进行扩增，将引物M-promoter-F/M-promoter-R所扩增得到的PCR产物6μL，10×缓冲液1μL，限制性内切酶BsaBI 0.5μL(5U)，加双蒸水补至10μL，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置6h，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，成像系统观察酶切结果，记录基因型。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中T是没有形成酶切位点的等位基因，A是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中TT型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有489bp一条这亮带)，AA型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现424bp和65bp两条亮带)，TC为杂合型(电泳检测时出现489bp、424bp和65bp三条亮带)，详见图3。图3是本发明中分子标记(MIR1596.-95A>T)的PCR-BsaBI-RFLP的三种基因型(AA，AT和TT)电泳图谱(琼脂糖胶浓度为2.5％)，M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
分子标记(MIR1596.-95A>T)检测所用到的引物序列如下所示：
M-promoter-F：5'-TGCGGCGAGGAGTTGGAC-3'，
M-promoter-R：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGAAACAGCTATGAC
CTAAATGACACACAAATCAAACCCAGA-3'。
PCR扩增条件包括总体积为25μL的PCR体系中加入DNA模板1μL，2×PCR反应混合物12.5μL，10mM引物前后各1μL，Taq DNA聚合酶0.625U，双蒸水8.25μL，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
实施例2：MIR1596.-95A>T突变位点多态性在各鸡种中分布情况的检测及应用
(一)MIR1596.-95A>T突变位点多态性在各鸡种中分布情况的检测
本实施例中收集了12个鸡群体血液DNA，样本均来自广东省农业科学院动物科学研究所。按照实施例1所述的方法对以上12个鸡群体进行了PCR-BsaBI-RFLP检测，MIR1596.-95A>T突变位点在不同鸡种中的基因型和等位基因频率如表1所示，结果显示分子标记MIR1596.-95A>T的A等位基因在大部分鸡群体中占优势，特别是在隐性白洛克鸡、罗斯308鸡、岭南黄快长型A系鸡等高效生长商业类型鸡群中均为AA基因纯合子，而只有在国内地方鸡种的丝羽乌骨鸡和清远麻鸡中为T等位基因占优势。表1显示为12个鸡群体中分子标记MIR1596.-95A>T的基因型和等位基因频率分布情况。
表1
(二)分子标记MIR1596.-95A>T在杂种鸡群体中的应用
用于统计分析的试验材料包括岭南黄快长型A系与惠阳胡须鸡的F2代总共784个个体，所分析的性状主要为饲料利用效率性状及生长性状。饲料利用效率性状包括7至10周的RFI和FCR；生长性状包括6、8和10周的活体重。
发明人采用SAS系统的JMP软件中(SAS Institute Inc.,Cary,NC)GLM程序进行性状与基因型间的关联分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yijklm＝μ+Si+Hj+Fk+Mkl+Gm+eijklm
Yijklm为性状表型值，μ为总体平均值，Gm为基因型效应；Si、Hj、Fk、Mkl为固定效应，分别为性别、批次、父亲及父亲组内母亲效应；eijklm为随机残差效应。
基因型检测结果表明：在所检测的784只岭南黄快长型A系与惠阳胡须鸡的F2代个体中，不存在分子标记MIR1596.-95A>T的TT基因型纯合个体，而AA基因型个体有537个，AT基因型个体有247个。不同基因型与饲料利用效率及生长性状的统计结果总结于表2，表2是在岭南黄快长型A系与惠阳胡须鸡的F2代个体中分子标记MIR1596.-95A>T基因型与饲料利用效率和生长性状的统计分析表。
表2
注：n：数量；RFI7-10：7至10周的剩余采食量；FCR7-10：7至10周的料重比；BW6、8、10：6、8和10周的活体重，单位：g；同行上标字母不同表示在P<0.05的情况下同行性状均值达到显著差异水平。
由表2可以看出，分子标记MIR1596.-95A>T均与7至10周的RFI和FCR等饲料利用效率性状呈显著相关，AA基因型个体7至10周的RFI和FCR值都显著低于AT基因型个体，但其均与6、8和10周的活体重等生长性状没有显著相关性，说明AA基因型个体饲料利用效率较优，但并不影响生长水平。
(三)分子标记MIR1596.-95A>T在纯种鸡群体中的应用
用于统计分析的试验材料一批有系谱和性状记录的惠阳胡须鸡，总共782个个体，所分析的性状主要为饲料利用效率性状及生长性状。饲料利用效率性状包括7至10周的RFI和FCR；生长性状包括6、8和10周的活体重。
发明人采用SAS系统的JMP软件中(SAS Institute Inc.,Cary,NC)GLM程序进行性状与基因型间的关联分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yijklm＝μ+Si+Fj+Mjk+Gl+eijkl
Yijklm为性状表型值，μ为总体平均值，Gl为基因型效应；Si、Fj、Mik为固定效应，分别为性别、父亲及父亲组内母亲效应；eijkl为随机残差效应。
基因型检测结果表明：在所检测的782只惠阳胡须鸡个体中，AA基因型个体有598个，AT基因型个体有173个，TT基因型个体有11个。不同基因型与饲料利用效率及生长性状的统计结果总结于表3，表3是在惠阳胡须鸡中分子标记MIR1596.-95A>T基因型与饲料利用效率和生长性状的统计分析表。
表3
注：n：数量；RFI7-10：7至10周的剩余采食量；FCR7-10：7至10周的料重比；BW6、8、10：6、8和10周的活体重，单位：g；同行上标字母不同表示在P<0.05的情况下同行性状均值达到显著差异水平。
由表3可以看出，分子标记MIR1596.-95A>T均与7至10周的RFI和FCR等饲料利用效率性状呈显著相关，AA基因型个体7至10周的RFI和FCR值都显著低于TT和AT基因型个体，但其均与6、8和10周的活体重等生长性状没有显著相关性，说明在纯种鸡群体中AA基因型个体饲料利用效率也较优，同时也不影响生长水平。
本发明所述的分子标记MIR1596.-95A>T可应用于鸡饲料利用效率的选择育种中。在育种过程中选择AA基因型的个体在一定程度上能够提高饲料利用效率，同时不影响其生长性状。此外，应用本发明所述的分子标记可以对鸡群体进行分子检测，选留基因型一致的个体，进而提高群体在饲料利用效率方面的均一性，有利于制定整个群体的饲料营养供给水平，节约成本，高效生产。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种鉴别鸡饲料利用效率的分子检测方法，其特征在于，以如SEQ ID NO：1所示序列中的第158位碱基作为分子标记，检测所述第158位的碱基处A/T碱基突变。
2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以鸡的DNA序列为模板，选择如下引物扩增：
M-promoter-F：5'-TGCGGCGAGGAGTTGGAC-3'，
M-promoter-R：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGAAACAGCTAT
GACCTAAATGACACACAAATCAAACCCAGA-3'；
将所得扩增产物用限制性内切酶BsaBI酶切，
若只有一条带，则该突变位点处均为T碱基；
若有两条带，则突变位点处均为A碱基；
若有三条带，则说明该突变位点处一条链为A碱基，另一条链为T碱基。
3.权利要求1所述的方法在鸡饲料利用效率性状方面的分子标记辅助选择中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为在鸡饲料利用效率选择育种中的应用。
5.一种鉴别鸡饲料利用效率的分子检测试剂盒，所述试剂盒包含M-promoter-F和M-promoter-R引物、Taq DNA聚合酶、双蒸水、缓冲液和限制性内切酶BsaBI，其特征在于，所述M-promoter-F和M-promoter-R引物序列如下：
M-promoter-F：5'-TGCGGCGAGGAGTTGGAC-3'，
M-promoter-R：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGAAACAGCTAT
GACCTAAATGACACACAAATCAAACCCAGA-3'。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |