CN102643829A - 水稻产量基因gy6的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了分离克隆的控制水稻谷粒产量的基因GY6及其等位基因的核苷酸序列。所述序列如SEQ ID NO：1(珍汕97)和SEQ ID NO：4(密阳46)所示，包含4个外显子；其编码序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示。两者在在编码区共存在11处单核苷酸多态，导致6个氨基酸变化。利用转基因技术获得了转GY6基因的水稻植株，转基因阳性植株表现出实粒数增加、千粒重提高、产量增加的特点。

Description

水稻产量基因GY6的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及到一个位于水稻第6染色体短臂上控制谷粒产量的基因GY6的克隆与应用。

背景技术

水稻谷粒产量是水稻生产最重要的目标，单株穗数、每穗实粒数和千粒重是水稻谷粒产量的三个主要构成因子。水稻产量及其构成因子是典型的数量性状，由数量性状基因(Quantitative trait loci，QTL)控制。随着分子生物学的发展，近年来已有14个控制水稻产量相关性状的QTL应用图位克隆策略获得克隆，分布于除第6、11和12染色体外的10个不同座位上，它们通过调控株型、穗形、每穗实粒数、每穗颖花数、粒重或灌浆速率控制产量。

近等基因系(Near-isogenic line，NIL)是QTL精细定位和克隆中最常用的材料，其优点是只在目标区间存在差异，遗传背景高度一致，使得群体只在单个QTL区间发生分离，极大地降低了遗传背景差异对目标QTL作用的干扰和对目标性状测定结果的影响，有效地提高了QTL检测的灵敏度和可靠性。长期以来，近等基因系的构建一般通过多代回交获得，利用剩余杂合体(Residual heterozygote，RH)或剩余杂合系(Residual heterozygous line，RHL)发展近等基因系是一种新的策略。所谓RH，指的是目标区间杂合而遗传背景纯合的单株，可从重组自交系群体中通过一轮标记筛选获得，它相当于一对近等基因系杂交产生的F1单株。应用RH自交产生的只在目标区间发生分离的群体，可以有效地实现QTL的精细定位和克隆。这种策略为分离和克隆新基因提供了一种新的途径。

发明内容

本发明的目的是应用图位克隆法从水稻中分离克隆一种控制谷粒产量的基因，并利用该基因提高水稻的谷粒生产能力。申请人将克隆的这个基因命名为GY6，所述片段如序列表SEQ ID No：1-6所示，或者基本相当于SEQ ID No：1-6所示的高度同源核苷酸序列。

具体地，本发明分离克隆的基因或等位基因的核苷酸序列及其氨基酸序列的信息如下：

一种控制水稻谷粒产量的基因GY6，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示。

上述基因GY6的编码序列如序列表SEQ ID No：2所示。

上述基因GY6的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：3所示。

与此同时，申请人得到GY6的一种等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：4所示。

上述等位基因的编码序列如序列表SEQ ID No：5所示。

上述等位基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：6所示。

本发明通过以下技术方案实现：

从珍汕97/密阳46F₇重组自交系中筛选获得一个在第6染色体短臂上的RM190-RM19784约7.3Mb区域呈杂合而背景基本纯合的剩余杂合体，自交产生分离群体，通过DNA分子标记分析，筛选获得杂合区间更小且相互交叠的RH梯系材料。经连续4次自交构建群体和基因型筛选，最终获得仅在13.7kb区间呈分离的近等基因系。近等基因系群体产量性状鉴定结果显示，该基因对每穗实粒数、千粒重和单株产量均具显著作用，来源于珍汕97的等位基因提高每穗实粒数、千粒重和单株产量(见本发明下述的表2)。该区间仅含一个候选基因，将之命名为GY6。序列分析表明，珍汕97和密阳46等位基因的基因组DNA分别长为6842bp和4716bp，编码序列长度均为537bp，编码一个由178个氨基酸组成的含PEBP结构域的蛋白。与珍汕97等位基因相比，密阳46等位基因在编码区共存在11处单核苷酸多态，导致了6处氨基酸的置换。将GY6(ZS97)等位基因转入中花11中，其T2代产量性状鉴定结果显示，该基因对每穗实粒数、千粒重和单株产量均具显著作用，转入GY6(ZS97)可提高每穗实粒数、千粒重和单株产量(见本发明下述的表3)。

本发明的优点在于：

本发明在水稻中克隆了一个对粒数、粒重和谷粒产量具有较大正调控效应的基因GY6，为水稻等禾谷类作物的高产育种提供了新的基因资源。

附图说明

序列表SEQ ID No：1显示的是本发明分离克隆的来源于珍汕97的GY6等位基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID No：2显示的是本发明分离克隆的来源于珍汕97的GY6等位基因的编码序列。

序列表SEQ ID No：3显示的是本发明分离克隆的来源于珍汕97的GY6蛋白的氨基酸序列。

序列表SEQ ID No：4显示的是本发明分离克隆的来源于密阳46的GY6等位基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID No：5显示的是本发明分离克隆的来源于密阳46的GY6等位基因的编码序列。

序列表SEQ ID No：6显示的是本发明分离克隆的来源于密阳46的GY6蛋白的氨基酸序列。

图1为近等基因系单株和主穗在灌浆期的表现。

图1左侧图片中的左边为携带珍汕97GY6等位基因的NIL-GY6(ZS97)单株，右边为携带密阳46GY6等位基因的NIL-GY6(MY46)单株；图1右侧图片中的左边为NIL-GY6(ZS97)主穗，右边为NIL-GY6(MY46)主穗。

图2为本发明的转基因所用的表达载体图谱。

图3为本发明的转基因单株和主穗在灌浆后期的表现。

图3左侧图片中的左边为中花11阴性单株，右边为转GY6(ZS97)阳性单株；图3右侧图片中的左边为成熟时期的中花11阴性单株主穗，右边为转GY6(ZS97)阳性单株主穗。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。

实施例1GY6的图位克隆

1.NIL构建

根据珍汕97/密阳46衍生群体产量性状的初定位结果，从F₇株系中选择到一个剩余杂合体，该单株在第6染色体短臂上的RM190-RM19784约7.3Mb区域呈杂合，在其他区域基本呈纯合。利用该单株自交，获得由221个株系组成的F_8∶9群体。应用位于RM190和RM19784之间的22个SSR(简单序列重复)标记进行基因型检测，从23个F₈家系的332个F₉单株中筛选获得14个在RM4923-RM6119区域的部分区间呈杂合且相互交叠的RH梯系材料；分别自交获得14套F₁₀群体，从其中一套含288个体的群体中筛选获得1个在RM3414-RM19417区间约97.1kb呈杂合的单株，自交后形成由200个个体组成的F₁₁群体；从中选取1个杂合单株自交形成了由680个单株组成的F₁₂群体，应用3个SSR标记和新发展的4个InDel(插入缺失)标记，从后代中挑选出1个在RM19410-RM19417区间约64.2kb呈杂合的单株，自交后形成由288个个体组成的F₁₃群体；应用包含新发展的2个在内的6个InDel标记进行筛选，挑选到1个仅在Si2925和Si2927-4/5之间、只包含一个预测基因的约1.7kb区间呈杂合的单株，从其自交群体中挑选出30个母本纯合型和30个父本纯合型的株系，构建了只在第6染色体短臂Si2925和Si2927-4/5区间呈分离的NIL群体。

2.DNA微量提取

(1)剪取水稻幼苗叶片2～3cm，剪成0.5cm长的碎片，放入2.0mL离心管中。

(2)加入450ul DNA提取液和一颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。

(3)加入450ul氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。

(4)11,000rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400ul，转入新的1.5ml离心管中，弃枪头。

(5)加入800ul预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。

(6)11,000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。

(7)用70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5ml离心管倒置于纸上，自然干燥。

(8)加入50ul的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。

(9)取1μl进行PCR扩增。

3.分子标记开发

本发明所用到的SSR标记信息来自于Gramene网站(www.gramene.org)。此外，根据珍汕97和密阳46在第6染色体短臂RM19410-RM19417区间的基因组片段测序结果，挑选具有InDel差异、PCR产物长度大约在100-500bp的片段进行分子标记开发，引物设计软件为Oligo 7.0(Lasergene公司)。应用设计的引物对珍汕97和密阳46检测，检查扩增效果和多态性，最终选用6个在珍汕97和密阳46之间呈多态的InDel标记(表1)。

4.PCR扩增

反应体系如下：335mM Tris-HCL，pH 8.8；80mM(NH₄)₂SO₄；0.9mM MgCl；0.05％TWEEN-20；0.2mM dNTPs；3.3ng/μl正向引物；3.3ng/μl反向引物；0.5单位TaqDNA聚合酶/10μl；1μL DNA/10μl。

[0038]扩增条件如下：94℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟，30循环；72℃8分钟；10℃10分钟。

5.PCR产物检测

PCR产物在2％的琼脂糖凝胶或6％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，再进行染色和凝胶成像。

表1用于本发明图位克隆的引物

6.表型鉴定

水稻成熟后收获NIL株系种植的12个单株中间10株，谷粒自然干燥后置于室温下放置3个月以上以保证谷粒的干燥和各株系间含水量的相对一致，考查穗数、每穗实粒数、千粒重和单株产量。单株穗数以总有效穗数除以单株数得出，每穗实粒数以所有实粒数除以总穗数得出，千粒重以挑选的2份300饱满谷粒的重量折算出，单株产量以所有实粒的重量除以单株数得出。

7.效应评价

通过考察NIL的单株穗数、每穗实粒数、千粒重和单株产量，并经SAS分析，结果显示：除单株穗数外，其余性状均具有显著差异(表2，图1)；与密阳46型近等基因系相比，珍汕97型近等基因系的每穗实粒数、千粒重和单株产量分别提高了39.2％、5.7％和32.6％。本发明将该基因命名为GY6。

表2GY6在近等基因系中的表现

实施例2GY6基因的获得

GY6基因采用分段扩增的方法获得。具体步骤如下。

1.引物设计

引物根据水稻品种日本晴的基因组序列(www.gramene.org)，应用Oligo 7.0软件设计。其中，珍汕97B和密阳46两个等位基因的片段A的引物均为primerl：5`-ACGCGTCGACGTGATTCGGTGGGCGTAACTG-3`和primer2：5`-GGTACCAGGAATATCGGTGACCAG-3`；珍汕97等位基因的片段B的引物为primer3：5`-CCTGGTACCACTGGAGCAACATT-3`和primer4：5`-GCCAAGCAGAATCTGAATCC-3`；密阳46等位基因的片段B的引物为primer3：5`-CCTGGTACCACTGGAGCAACATT-3`和primer5：5`-AACTGCAGACTGCCCCCATGTGTCGTC-3`。

2.PCR扩增

反应体系如下：335mM Tris-HCL，pH 8.8；80mM(NH₄)₂SO₄；0.9mM MgCl；0.05％TWEEN-20；0.2mMdNTPs；3.3ng/μl正向引物；3.3ng/μl反向引物；1单位高保真酶/25μl；2μl DNA/25μl。

扩增条件如下：94℃2分钟；98℃10秒，60℃10秒，72℃4分钟，30循环；72℃8分钟；10℃10分钟。

3.PCR产物检测

PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，再进行染色和凝胶成像。

4.PCR产物回收、连接和转化

采用凝胶回收试剂盒Gel Extraction Kits(QIAGEN公司)纯化回收PCR目的片段。将产物加A后连接到pMD 18-T Vector(Takara公司)，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara公司)培养，挑选白色克隆。

5.阳性克隆的鉴定和测序

采用质粒抽提试剂盒

Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)抽提质粒，应用PCR和限制性内切酶(Takara公司)酶切鉴定阳性克隆。携带片段A的克隆鉴定的PCR引物为：5`-TTGGGTTGGTACTGCCTAAAG-3`以及5`-ATATCGGTGACCAGCCTACAG-3`，应用的限制性内切酶为Eco R I和Kpn I，携带片段B的克隆鉴定的PCR引物为：5`-TCTCTTTGTCTGTCTGTAGGC-3`以及5`-CTAGCTAATGCATGAACGC-3`，应用的限制性内切酶分别为Kpn I和Sal I(珍汕97等位基因)以及Kpn I和Pst I(密阳46等位基因)。挑选阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

6.GY6等位基因序列分析

测序结果表明，珍汕97等位基因的片段A长度为2956bp，片段B长度为3895bp，拼接后全长为6842bp(见序列表SEQ ID No：1)。密阳46等位基因的片段A长度为2864bp，片段B为1861bp，拼接后全长为4716bp(见序列表SEQ ID No：4)。两个等位基因均包含4个外显子。编码序列分析则表明，珍汕97和密阳46等位基因均为537bp(见序列表SEQ ID No：2和序列表SEQ ID No：5)，但双亲间共存在11处单核苷酸多态，导致了6处氨基酸的置换。该蛋白编码一个由178个氨基酸组成的含PEBP结构域的蛋白(见序列表SEQ ID No：3和序列表SEQ ID No：6)。

实施例3GY6的转基因互补试验

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所示：

1.试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4二氯苯氧乙酸)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；KT(Kinetin，激动素)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；N6max(N6大量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；B5min(B5微量元素成分溶液)。

2.主要溶液配方

(1)N6max培养基大量元素母液(按照20倍浓缩液(20X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至1000毫升，4℃冷藏备用。

(2)MSmax培养基大量元素母液(按照20X浓缩液配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至1000毫升，4℃冷藏备用。

(3)B5min培养基微量元素母液(按照1000X浓缩液配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至100毫升，置于棕色试剂瓶内，4℃冷藏备用。

(4)维生素母液(按照100X浓缩液配制)

盐酸硫胺(VBI)        100毫克

吡哆醇(VB6)          10毫克

烟酸(VB5)            10毫克

将上述试剂分别溶解后再混合，在室温下用蒸馏水定容至100毫升，置于棕色试剂瓶内，4℃冷藏备用。肌醇用量较大，配培养基时临时添加。

(5)铁盐母液(按照100X浓缩液配制)

硫酸铁(FeSO₄.7H₂O)         2.78克

乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA) 3.75克

将上述两种试剂分别溶解，混合并用蒸馏水定容接近至1000毫升，置于微波炉内加热煮沸，冷却至室温后定容至1000毫升，置于棕色试剂瓶内，4℃冷藏备用。

(6)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

称取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加入10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

(7)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

称取萘乙酸100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加入10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。

(8)乙酰丁香酮(AS)贮存液(0.1M)的配制：

称取AS 0.196克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，-20℃保存备用。

3.用于水稻遗传转化的培养基配方

(1)诱导培养基：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸并定容至1000毫升，分装至50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(121℃灭菌15分钟，下述的培养基灭菌方法与此相同)。

(2)继代培养基：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸并定容至1000毫升，分装至50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口后按上述方法灭菌。

(3)共培养培养基：

加蒸馏水至200毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.5，定容至250毫升，封口后按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基，加入250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

(4)筛选培养基：

加蒸馏水至200毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，定容至250毫升，封口后按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基，加入250微升潮霉素(50毫克/毫升)和250微升头孢氨苄青霉素(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

(5)分化培养基：

加蒸馏水至200毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸并定容至250毫升，封口后按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基，加入250微升潮霉素(50毫克/毫升)和250微升羧苄青霉素(250毫克/毫升)，分装倒入试管中(10毫升/管)。

(6)生根培养基：

加蒸馏水至200毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸并定容至250毫升，分装至试管中(10毫升/管)，封口后按上述方法灭菌。

4.重组表达载体的构建

将实施例2中构建的携带珍汕97等位基因A片段和B片段的T载体分别用EcoR I和Kpn I以及Kpn I和Sal I双酶切，将目的片段回收。先将双酶切后的A片段连接到经EcoR I和Kpn I双酶切处理的pCAMBIA1300载体上(澳大利亚CAMBIA公司)上。将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经提取质粒进行酶切检测后，获得包含A片段的重组表达载体1300-GY6-A。

再将双酶切后的B片段连接到经Kpn I和Sal I双酶切处理的重组表达载体1300-GY6-A上。将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经提取质粒进行酶切检测后，获得含有GY6(ZS97B)等位基因的重组表达载体1300-GY6(图2)。

5.重组农杆菌的获得

用电击法将上述重组载体转化农杆菌EHA105菌株，得到重组农杆菌。提取质粒进行酶切鉴定，获得包含重组表达载体1300-GY6的重组农杆菌。

6.农杆菌介导的遗传转化：

(1)水稻幼胚愈伤组织的诱导培养

取开花后12-15天左右的中花11幼穗脱粒，用70％乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25％的次氯酸钠溶液浸泡90分钟，进行表面灭菌。用无菌水冲洗3-4次。在无菌滤纸上挤出幼胚置于诱导培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基上，在相同的条件下继代培养5天左右，用于共培养。

(2)农杆菌的培养

将上述重组农杆菌在含有50ug/ml卡纳霉素的YM平板上划线，28℃黑暗培养3天，用以金属匙收集农杆菌体，将其悬浮于共培养液体培养基中，调整菌体浓度为OD₆₀₀为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为100uM，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好(色泽淡黄、紧实且相对干燥)的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液，室温下放置20分钟，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃暗培养2-3天。

(4)抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养上继续筛选14天。等到愈伤组织在褐化后，在褐化组织的边缘重新长出乳白色的抗性愈伤组织。

(5)抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，经15-25天左右，出现绿点，30-40天后进一步分化出小苗。

(6)生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2厘米是，将小苗移到生根培养基上，培养2周左右。选择高约10厘米、根系发达的小苗，吸去培养基，在温室内移栽入土。

(7)本发明共获得42株独立的携带珍汕97等位基因的转中花11T0代水稻植株、28个T1代株系以及10个T2代株系，分别包括6个阳性、1个分离和3个阴性。与阴性植株相比，阳性植株的每穗实粒数、千粒重和单株产量分别提高了13.8％、11.5％和36.6％(表3，图3)。

表3GY6(ZS97B)转中花11T2群体中的基因效应

Claims (7)

1.一种控制水稻谷粒产量的基因GY6，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的基因GY6，它的编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的基因GY6，它的编码氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求1所述的基因GY6的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

5.如权利要求4所述的等位基因，它的编码序列如序列表SEQ ID NO：5所示。

6.如权利要求4所述的等位基因，它的编码氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

7.权利要求1或2或3所述的基因在作物遗传改良中的应用。 

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