CN101148674A - 一种控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd7的克隆及应用 - Google Patents

一种控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd7的克隆及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因GHD7的克隆和应用。该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，序列全长3917bp，包含2个外显子，编码257个氨基酸。其cDNA序列如SEQIDNO：1所示。该基因编码的蛋白质具有CO蛋白的CCT结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。利用转基因获得了转GHD7基因的水稻植株，转基因植株都表现出比各自对照(野生型受体)谷物产量显著提高，每穗颖花数显著增多，抽穗期明显延迟，株高显著变高。这些性状变化与珍汕97的GHD7近等基因系两种亲本基因型的表现非常吻合。本发明还公开了基因克隆、近等基因系选育和转基因的方法。本发明还涉及多效性基因GHD7在水稻育种以及植物进化研究中的应用。

Description

一种控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd7的克隆及应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种控制水稻谷粒产量，抽穗期和株高的多效性基因Ghd7的克隆及应用。
背景技术
水稻谷粒产量是水稻生产最为关注的终极性状之一，它是每穗实粒数，有效穗数和千粒重的复合性状。每穗实粒数是每穗颖花数和结实率决定的。大量的研究表明，每穗颖花数由于具有较高遗传力，对产量贡献较大，很大程度上决定水稻产量而备受重视。抽穗期是很重要的生物学性状，直接决定水稻品种的生态适应性和季节适应性。而株高与生物学产量息息相关，与收获指数密切相关，影响产量的稳定性。因此，阐明每穗实粒数，抽穗期和株高的遗传基础和分子机理有利于改良水稻丰产性和稳产性。
抽穗期受基本营养基因和感光基因调控(Tanisaka et al.Jpn J Breeding，1997，442：657-668；Tsai，Rice genet Newslett，1985，2：77-78)。水稻品种的地域分布，籼粳稻分化也认为与抽穗期基因进化有关。因此，揭示抽穗期的遗传基础可以为水稻的进化研究提供线索，为选育不同生态型水稻品种提供理论指导。利用经典遗传学和分子遗传学手段，都证明了抽穗期是由少数质量性状基因和多个数量性状基因(QTL Quantitative Trait Loci)控制的。其中，水稻第7染色体的着丝粒附近的C1023-R1440区间的抽穗期QTL(该QTL在本发明中被命名为Ghd7)在籼粳交的群体(Li等，2003，Theor.Appl.Genet.108：141-153)，籼籼交群体(Xing等，2002，Theor.Appl.Genet.105：248-257)，粳粳交群体(Lin等，2003，Breeding Sci.53：51-59)和野栽群体(Thomson等，2003，Theor.Appl.Genet.107：479-493)等不同群体里检测到，但不同群体里的遗传效应差别很大。本实验室利用珍汕97/明恢63衍生的F2∶3和重组自交系群体也多次检测到Ghd7区域检测到一个控制抽穗期的QTL，最高可以揭示抽穗期总变异的25％左右(Xing等，2001，Acta.Bot.Sin.43：721-726；Yu等，2002，Theor.Appl.Genet.104：619-625)。这些结果表明Ghd7基因可以在不同的遗传背景以及不同环境下都能稳定表达。多年的遗传学研究认为株高也是少数质量性状基因和多个QTL控制的。不同的群体(Li等，1996，Genetics，145：453-465；Li等，2003，Theor.Appl.Genet.108：141-153；Li等，2006，The New Phyto.170：185-193；Xiao等，1996，Theor Appl Genet，92：230-244)在Ghd7区间也发现存在影响株高的QTL，受环境影响。同时，也有群体在这个区间检测到影响谷粒产量性状的QTL(Brondani等，2002，Theor Appl Genet，104：1192-1203；Li等，1996，Genetics)。我们在同一地点不同年份的相同季节种植珍汕97/明恢63的F2，RIL和“永久F2”群体，在同一个组合衍生的不同世代群体里，均发现这个QTL能控制抽穗期，株高和每穗颖花数和产量(Yu等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：9226-9231；Xing等，2001，Acta.Bot.Sin.43：721-726；Yu等，2002，Theor.Appl.Genet.104：619-625；Xing等，2002，Theor.Appl.Genet.105：248-257；Hua等，2002，Genetics 162：1885-1895)。这是其他研究小组未报到过的。Ghd7同时影响每穗颖花数，抽穗期和株高，明恢63等位基因对3个性状表现增加表型值。因此，Ghd7对于水稻产量和品种适应性的改良具有巨大的应用潜力和前景，对Ghd7进行精细定位和克隆，为水稻的高产育种提供新的基因资源。
利用初级作图群体对数量性状基因进行精细定位几乎不可能，这是因为在这样的群体材料中，影响同一性状的多个QTL都在分离，QTL间的相互干扰以及环境因素的影响，使得QTL定位的准确性受到很大限制。另外，对于一个QTL密集区间，很难判断到底是一个一因多效QTL还是多个微效QTL的作用(Yano等，1997，Plant Molecular Biology 35：145-153)。因此，必须构建高级群体来精细定位QTL。通常的做法就是构建目标QTL的近等基因系(Near IsogenicLines，NIL)，把目标QTL位点之外的绝大部分背景差异消除，使该位点表现为典型的孟德尔遗传，即数量性状质量化。这种方法已经在许多QTL的精细定位和基因克隆研究中发挥了重要的作用。Fan等采用这种方法已经将GS3定位到7.9kb的区域，并图位克隆了GS3(Fan等，2006，Theo Appl Genet 112：1164-1171)。由于群体大小的限制或着丝粒附近的区间往往存在重组抑制，有时候，基因定位的分辨率不足以确定目标基因，这就给图位克隆带来了麻烦，候选基因克隆方法是一个比较好的策略。分析定位区域内的所有基因，借助已经克隆的基因结构域特点和相关功能，通过比较已知基因的功能和预测基因的注解，从中遴选出结构、功能相关基因作为候选基因，进行功能验证。这种候选基因策略为分离和克隆Ghd7的基因提供了新的途径。
本发明利用图位候选基因克隆方法分离克隆一个控制水稻谷粒产量，抽穗期和株高主效基因Ghd7，为水稻的产量和品质育种提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供线索。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用图位候选基因克隆法从水稻中分离克隆一种同时控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd7及其再水稻育种中的应用。利用这个基因大幅度`提高水稻产量。申请人将克隆的这个基因命名为Ghd7。
本发明是这样实现的：本发明从珍汕97(一个公知公用的水稻品种)和明恢63(一个公知公用的水稻品种)组合衍生的重组自交系群体里选择含有Ghd7基因且70％遗传背景与珍汕97一致的材料，与珍汕97回交两代，自交，构建Ghd7的近等基因系。利用近等基因系群体分析，发现该基因对抽穗期，每穗颖花数和株高都有很大的效应(表2)，后代测验表明，该基因呈现孟德尔基因分离比(图2)。利用近等基因系大群体，将Ghd7精细定位到0.4cM，约2,300kb的染色体区段内(图3)，通过对该区间的基因进行预测，发现一个CCT结构域的基因，从明恢63的BAC文库里筛选到含Ghd7的阳性克隆，亚克隆后，获得一个8,175bp的基因组片段作为Ghd7的候选基因，进行转基因验证，将该基因转入水稻品种牡丹江8号和合江19(两个公知公用的水稻品种)转基因单株均表现出产量，每穗颖花数显著增加，抽穗期明显延迟，株高变高(如表4所示)。通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法(Frohman等，1988，Proc Natl Acad SciUSA，1988，85：8998-9002)，分离出Ghd7的全长cDNA，全长1014bp。比较基因组序列和全长cDNA序列发现，Ghd7基因包含2个外显子，共编码257个氨基酸。基因表达分析发现，该基因全生育期在各个组织表达，表达水平偏低。光周期反应试验表明，长日条件下Ghd7表达量比短日条件下增强，延迟抽穗。珍汕97等位基因缺失，4个大穗品种明恢63、H94(来自上海市农业生物基因中心)、93-11(江苏里下河地区农业科学研究所育成的中籼品种)和特青(上世纪80年代推广面积很大的水稻高产品种)，2个小穗品种牡丹江8号，合江19以及2个中间穗大小的品种中花11(来自中国农业科学院作物研究所商业品种)和日本晴(英文名称：Nipponbare，一个公知公用的水稻品种材料，且已经完成全基因组测序的水稻品种)进行比较测序。8个不同材料的等位基因测序发现：包括启动子区间和全基因的5.5kb序列内，4个大穗品种第1个外显子跟2个小穗品种存在共同的变异，由谷氨酸GAG突变为终止终止密码子(TGA)。
本发明的优点在于：
(1)本发明首次在水稻中克隆了一个影响水稻谷粒产量，抽穗期和株高的一因多效基因。为水稻的高产育种和培育适应不同生态型和季节性的品种提供了新的基因资源，也为其它作物利用同源基因法克隆相关基因提供了基因序列。
(2)本发明中克隆的基因也可以为水稻等禾谷类作物以及油菜等双子叶作物的光反应和分子进化研究提供证据。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的Ghd7基因组序列(其中包括Ghd7基因编码序列)。
图1.是本发明的总体技术路线图。
图2.BC3F2随机群体中谷粒产量、每穗颖花数、抽穗期和株高的频率分布。图2a是抽穗期的频率分布；图2b是株高的频率分布；图2c是每穗颖花数的频率分布图。图中灰色黑色和白色棒分别表示Ghd7位点珍汕97基因型，杂合基因型和明恢63基因型，Ghd7的三种基因型是通过后代测验推断的。
图3.Ghd7在遗传连锁图上的定位，遗传单位为cM。图3a重组自交系群体定位的图谱，图3b是利用BC3F2小群体定位的图谱，图3c是利用极端隐性单株精细定位图谱，染色体左侧数字表示两个标记间的物理距离，右侧标记括号里的数字，表示基因与标记的重组时间。
图4.是本发明的近等基因系构建流程图。回交时，以珍汕97作为母本。
图5.是本发明的近等基因系和转基因单株表现。图5a近等基因系植株，从左往右分别为珍汕97，珍汕97-珍汕97 Ghd7，珍汕97-杂合Ghd7，珍汕97-明恢63 Ghd7，明恢63；图5b是稻穗，从左至右分别为珍汕97-珍汕97 Ghd7，珍汕97-杂合Ghd7，珍汕97-明恢63 Ghd7基因型。图5c是Ghd7转基因系植株，左为合江19阴性株，右为阳性株，图5d是转基因植株的稻穗，左为合江19阴性株稻穗，右为阳性株稻穗。
图6.双元载体pCAMBIA1301结构示意图
图7.本发明克隆的Ghd7基因的结构示意图。黑色的方框代表外显子，带斜线的方框代表5’和3’UTR，“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码，大小穗型形品种间的一个碱基的差异位于Ghd7基因第1个exon中，由小穗型品种中的谷氨酸(GAG)突变为大穗型品种中的终止密码子(TGA)。下划线区间为CCT保守结构域。
具体实施方式
根据图1的技术路线，从水稻品种珍汕97和明恢63组合衍生的重组自交系群体里选择含有明恢63的Ghd7等位基因且遗传背景与珍汕97最为相似的第50号自交系RIL50(参见：邢永忠等，水稻株高和抽穗期基因的定位和分离。植物学报，2001，43(7)：721-726)与珍汕97杂交，珍汕97为轮回亲本，连续回交3代，自交，构建了水稻Ghd7基因的近等基因系。利用一个含有190个BC3F2单株的随机群体对Ghd7进行了定位和遗传效应分析；利用目标区间公共SSR标记对来自于8400个单株的1082个极端早穗矮秆小穗单株进一步分析，最终将Ghd7定位到C39和RM3859之间，两者遗传距离为0.4cM，物理距离却达到2300kb；利用基因组已经完全测序的日本晴和93-11(江苏里下河地区农业科学研究所育成的中籼品种)两个品种的序列分析，预测到该区间存在一个CCT结构域的基因，确定为Ghd7的候选基因。从明恢63的BAC文库里，分离到一个包含Ghd7基因的8,1725bp序列，把该片段连接到双元载体质粒pCAMBIA1301(来自澳大利亚一个公开报道和使用的质粒)通过超量表达和正义转化受体合江19，牡丹江8号和珍汕97，转基因单株均表现出期望的性状变化，即产量显著提高，穗大小显著变大，抽穗期显著变迟和株高显著变高，与Ghd7近等基因系两种纯合基因能型的表现型极为相似。证明这个候选基因就是Ghd7。珍汕97缺失该基因。根据Ghd7序列，设计引物，利用RACE技术分离Ghd7的全长cDNA序列，共1014bp。对包括启动子和全基因的5.5kb序列进行比较测序，发现4个大穗品种(武汉生育期长，株高偏高，穗子偏大)第1个外显子跟2个小穗品种存在共同的变异，即由谷氨酸GAG突变为终止终止密码子(TAG)。短日和长日条件下处理转基因阴性和阳性单株以及近等基因系两纯合基因型，发现长日条件下Ghd7表达比短日条件下增强，明恢63纯合基因型抽穗期显著延迟，株高显著变高，穗大小显著变大，产量大幅度提高；但短日条件下，各基因型间表型差异不大，与珍汕97表现类似。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离克隆Ghd7基因，遗传转化，比较测序验证Ghd7等位基因之间序列差异的方法和该基因在长短日条件下的表达规律。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：Ghd7近等基因系构建
1、回交与选择
如附图3a所示，根据珍汕97和明恢63的重组自交系群体QTL定位结果，结合标记基因型选择包含明恢63的Ghd7等位基因区间，且70％的遗传背景与珍汕97相同的自交系RIL50为母本，与珍汕97连续回交3次，自交一次，获得BC3F2(图4)。在BC1F1和BC2F1代对Ghd7只进行正向选择，即选择目标区段为珍汕97/明恢63杂合基因型的单株用于下一轮的回交。在BC3F1代，除进行正向选择外，还对目标区段以外的遗传背景进行扫描，从中选择遗传背景与珍汕97最为相近的单株用于后续的实验。参照已发表的水稻遗传连锁图谱(Temnykh等，2000，Theor.Appl.Genet.100：697-712：Temnykh等，2001，Genome Res.11：1441～1452)，从中选择了150对在亲本间具有多态性并且均匀分布于水稻12条染色体的SSR标记用于遗传背景的筛选。最终选择了一个遗传背景最接近珍汕97的单株(BC3F1)，其RM5451和RM445标记((参见：http://www.gramene.org/)基因型为珍汕97/明恢63杂合，而在150对SSR标记中仅7％(10对)为珍汕97/明恢63杂合，其余都是珍汕97纯合基因型。该单株的后代(BC3F2和BC3F3)用于后续的基因精细定位和克隆。
2．微卫星标记基因型鉴定方法(SSR)
PCR标准程序参见参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法。PCR采用20μl的反应体系，包含：20-50ng DNA模板，10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％Triton X-100，1.8mM MgCl2，0.1mM dNTP，0.2μM引物(如上所述的RM282和RM16的引物参见http://www.gramene.org/)和1 U Taq DNA polymerase。PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，34个循环；72℃延伸10min。PCR产物在6％的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染(Bassam等，1991，Anal.Biochem.196：80-83)。
实施例2：Ghd7在随机群体中的定位和效应评价
1、表型测量
抽穗期，自播种到单株的第一个穗子长出的天数，即单株抽穗期。株高，从田间地面到单株最高穗子顶部的高度，即单株株高。每穗颖花数，计数单株所有种子(包括实粒数和空瘪粒数)数目和有效穗数目，所有种子数除以有效穗数即每穗颖花数。产量，谷粒自然干燥后的单株饱满种子的质量即谷粒产量。
从BC3F1单株衍生的BC3F2群体中随机挑选了190单株构成一个随机群体。考察珍汕97、明恢63和随机群体中每个单株的抽穗期，株高，每穗颖花数合产量。结果显示所有性状在两亲本间都具有显著差异(表1)。在随机群体中，每穗颖花数呈现不连续分布，以110-120粒为分界线，即可分为两类，即大穗和小穗类型(表1和图2c)。抽穗期，株高和产量都表现为双峰连续分布(参见图2a，2b和2c)。并且产量，株高，抽穗期和每穗颖花数表现为极显著正相关，即高产株系比低产株系的抽穗期迟，株高高，每穗颖花数多。为简化叙述，本发明中将每穗颖花数多的类型叫大穗型，每穗颖花数少的类型叫小穗型。
表1．随机群体中大小穗类型以及两亲本的表型值
性状   亲本(mean±SD)     大穗型     小穗型
珍汕97  明恢63   Mean±SD   Range     Mean±SD  Range
单株产量(g)每穗颖花数抽穗期(天)株高(cm) 19.6±1.6109.2±6.460.4±1.379.4±2.1  29.9±2.1148.6±9.589.2±1.5107.4±2.5   25.7±4.0174.8±27.781.9±7.3109.3±8.9   16.5-39.4121.9-216.771.3-92.498.1-129.3     10.5-25.390.2±11.360.7±1.880.0±5.6  17.5±2.874.9-109.259.1-62.770.1-91.7
2.Ghd7的QTL定位和效应评价
从C1023-R1440的QTL区间(图3a)选择21个SSR标记，获得珍汕97和明恢63间有多态性的9个PCR标记和1个RFLP标记。对近等基因系随机群体进行标记基因型分析，用Mapmaker/Exp 3.0软件(Lincoln等，1992，Whitehead Institute Technical Report，WhiteheadInstitute，Cambridge，Massachusetts，USA)构建Ghd7区间的局部遗传连锁图(图3b)，利用区间作图法Mapmaker/QTL1.1对随机群体的单株产量，每穗颖花数，抽穗期和株高进行QTL定位，LOD值3.0作为检测QTL的域值。从表2结果可以看出在RM3859-C39区间存在一个QTL同时单株产量，每穗颖花数，抽穗期和株高等性状，分别解释这几个性状43.2％，74.2％，91.8％和88.9％的表型变异。其中明恢63的基因型增加单株产量，每穗颖花数，抽穗期和株高，该QTL对不同的性状表现为部分显性效应。表明可以通过标记辅助选择来定向利用优良等位基因，改良水稻品种，而且，显性纯合基因型是比较理想的基因型。
表2.位于RM3859-C39区间控制产量，每穗颖花数，抽穗期和株高的QTL效应
Traits     LOD     Aa     Db     D/A     R2(％)c
产量(克)每穗颖花数抽穗期(天)株高(cm)     22.356.1102.976.7     4.459.812.318.8     2.7***28.3***4.0*12.3**     0.610.470.330.65     43.274.291.888.9
a明恢63等位基因的加性效应；b明恢63等位基因的显性效应，*，**和***分别表示P＜0.01，0.001和0.0001的显著性水平(t测验)。cQTL解释性状总变异的百分率；
4.后代测验
随机群体每株系种植20个家系(BC3F3代)进行后代测验。结果发现在190个株系中，有45个株系的后代都表现为小穗，早穗，矮秆和低产量的表型，有43个株系的后代都表现为大穗，晚穗，高秆和高产量的表型，剩下的102个株系的后代4个目标性状出现了分离。卡方测验表明三种类型符合单个孟德尔因子的1∶2∶1分离比(χ2＝1.07，P＞0.05)，表明在此BC3F2群体中，这4个性状是由一个主效基因控制的，并且大穗等位基因对小穗等位基因表现为显性作用。由于后代表现出的这三种类型分别对应各个BC3F2单株的Ghd7位点的三种基因型：明恢63纯合基因型(大穗)，珍汕97纯合基因型(小穗)和杂合基因型(大小穗分离)，因此，Ghd7作为一个标记直接定位于SSR标记RM3859和RFLP标记C39之间，该区间相距0.4cM，Ghd7与RM5436共分离(图3c)。
实施例3：Ghd7的精细定位和候选基因确定
1.重组单株筛选和Ghd7的精细定位
为进一步缩小Ghd7的区间，从8,400株由BC3F1单株衍生的BC3F2中挑选出最早抽穗，而且表现矮秆和小穗的1,082单株，用于重组单株的筛选。在随机小群体定位的基础上，选择包含Ghd7的8cM区间的5个SSR标记和1个RFLP标记(图3b)，筛选这1082个单株。
首先用SSR标记RM5431和RM445进行筛选，从1,082个单株中分别找到66和94个重组单株(共160个)。然后，用RM3859，RM5436，RM5499，C39和RM7110四个标记分析这160个重组单株，结果发现在RM3859和C39间共有8个重组单株，在RM3859和C39分别与Ghd7间存在4个重组单株。RM5436和RM5499均与Ghd7共分离(图3c)。因此，Ghd7最终被定位于RM3859和C39间，该区间对应于Nipponbare基因组序列上的约2300-kb的物理范围，并和920-kb的区间共分离(图3c)。
2.候选基因的确定
Ghd7所处的区间0.4cM遗传距离`对应于2300-kb的物理距离，表明目标区间存在严重的重组抑制，这与该基因所处于的着丝粒附近区间有关。Ghd7与920-kb区间共分离，表明图位克隆不可能把基因区间进一步缩小，因此，结合候选基因法，来确定候选基因。根据日本晴对应的2300-kb区间序列，预测所有可能的基因，发现，该区间有450多个基因，其中有一个基因具有CCT(CONSTANS(CO)，CO-LIKE and TIMING OF CAB1(TOC1))保守结构域，这个结构域报道与拟南芥和水稻开花期有关，因此，被首选为Ghd7的候选基因。
实施例5：Ghd7的转基因互补试验
根据预测的候选基因序列，设计3对如表3所示的PCR引物筛选明恢63的BAC文库的DNA池，挑选出含有候选基因的克隆，利用限制性核酸内切酶BamHI and EcoRI酶切阳性克隆，进行亚克隆，获得一个8175bp的片断，该片段包含转录起始点上游2,261kb和终止位点下游3,255kb序列。
这个片段连接到双元载体pCAMBIA1301上，采用转基因的方法，得到转基因的水稻小植株，本发明的转基因具体步骤如下：
我们对挑选到的明恢63 BAC 60F11，用限制性核酸内切酶BamHI and EcoRI进行酶切，然后在0.8％的琼脂糖中分离大约8kb片段，连接到双元载体pCAMBIA1301上(载体图参见图6)，然后再用表3所示的引物筛选阳性克隆，用用表3所示的引物对得到的克隆进行测序，确定基因所在片段连接在载体上。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花合江19，牡丹江8号中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativaL.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)基础上进行优化。
本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：
(1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthaleneacetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)
(2)主要溶液配方
1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：
硝酸钾(KNO3)           28.3克
磷酸二氢钾(KH2PO4)     4.0克
硫酸铵((NH4)2SO4)      4.63克
硫酸镁(MgSO4·7H2O)    1.85克
氯化钙(CaCl2·2H2O)    1.66克
将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。
2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制
碘化钾(KI)             0.08克
硼酸(H3BO3)            0.16克
硫酸锰(MnSO4·4H2O)    0.44克
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)    0.15克
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)
将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4 7H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)
烟酸(Nicotinic acid)        0.1克
维生素B1(Thiamine HCl)      0.1克
维生素B6(Pyridoxine HCl)    0.1克
甘氨酸(Glycine)             0.2克
肌醇(Inositol)              10克
加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)
硝酸铵(NH4NO3)              16.5克
硝酸钾                      19.0克
磷酸二氢钾                  1.7克
硫酸镁                      3.7克
氯化钙                      4.4克
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)
硫酸锰(MnSO4 4H2O)          2.23克
硫酸锌(ZnSO4 7H2O)          0.86克
硼酸(H3BO3)                 0.62克
碘化钾(KI)                  0.083克
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)       0.025克
硫酸铜(CuSO4·5H2O)         0.0025克
氯化钴(CoCl2 6H2O)          0.0025克
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取2，4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。
8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取NAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升 蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取IAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：
秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同)        100毫升
N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)       10毫升
Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)  10毫升
维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)    10毫升
2，4-D贮存液(取上述制备好的)                    2.5毫升
脯氨酸(Proline)                                 0.3克
CH                                              0.6克
蔗糖                                            30克
Phytagel                                        3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
2)继代培养基
N6max母液(10X)                                  100毫升
N6mix母液(100X)                                 10毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)                            10毫升
维生素贮存液(100X)                              10毫升
2，4-D贮存液                                    2.0毫升
脯氨酸                                          0.5克
CH                                              0.6克
蔗糖                                            30克
Phytagel                                        3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
3)预培养基
N6max母液(10X)                                  12.5毫升
N6mix母液(100X)                                 1.25毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)                            2.5毫升
维生素贮存液(100X)                              2.5毫升
2，4-D贮存液                                    0.75毫升
CH                                              0.15克
蔗糖                                            5克
琼脂粉                                          1.75克
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升 葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X)           12.5毫升
N6mix母液(100X)          1.25毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)     2.5毫升
维生素贮存液(100X)       2.5毫升
2，4-D贮存液             0.75毫升
CH                       0.2克
蔗糖                     5克
琼脂粉                   1.75克
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。
5)悬浮培养基
N6max母液(10X)          5毫升
N6mix母液(100X)         0.5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)    0.5毫升
维生素贮存液(100X)      1毫升
2，4-D贮存液            0.2毫升
CH                      0.08克
蔗糖                    2克
加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。
使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6)选择培养基
N6max母液(10X)           25毫升
N6mix母液(100X)          2.5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)     2.5毫升
维生素贮存液(100X)       2.5毫升
2，4-D贮存液             0.625毫升
CH                       0.15克
蔗糖                     7.5克
琼脂粉                   1.75克
加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。
7)预分化培养基
N6max母液(10X)         25毫升
N6mix母液(100X)        2.5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)   2.5毫升
维生素贮存液(100X)    2.5毫升
6-BA贮存液            0.5毫升
KT贮存液              0.5毫升
NAA贮存液             50微升
IAA贮存液             50微升
CH                    0.15克
蔗糖                  7.5克
琼脂粉                1.75克
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
8)分化培养基
N6max母液(10X)       100毫升
N6mix母液(100X)      10毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X) 10毫升
维生素贮存液(100X)   10毫升
6-BA贮存液           2毫升
KT贮存液             2毫升
NAA贮存液            0.2毫升
IAA贮存液            0.2毫升
CH                   1克
蔗糖                 30克
Phytagel             3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
9)生根培养基
MSmax母液(10X)       50毫升
MSmix母液(100X)      5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X) 5毫升
维生素贮存液(100X)   5毫升
蔗糖                 20克
Phytagel             3克
加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤
3.1愈伤诱导
1)将成熟的合江19，牡丹江8号，水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；
2)用灭菌水洗种子4-5次；
3)将种子放在诱导培养基上；
4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
3.2愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.3预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.4农杆菌培养
1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；
2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
3.5农杆菌侵染
1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；
3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
3.6愈伤洗涤和选择培养
1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；
3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。
3.7分化
1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；
2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
3.8生根
1)剪掉分化时产生的根；
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
3.9移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
转化粳稻品种合江19和牡丹江8号，2个受体的转基因单株T0代均表现出期望的表型变化，即类似于近等基因系的表型差异(图5a，图5b)，每穗颖花数，抽穗期和株高表型值均明显比对照偏高(图5c和图5d)，T1表现出类似的性状变化(表4)和，而且呈现单基因的分离比，表明这些转基因单株含有单拷贝的Ghd7基因(表5)。同时也证明了这个基因可以通过遗传转化来改良水稻品种。
表3 本发明的用于Ghd7基因分离的引物
引物名称  Forward primer(5’-3’)   Reverse primer(5’-3’)  产物大小bp 退火温度℃ 用途
Cexu1-2Cexu7-8  gcaaggggatgtctaaacgacatacggatccagcctctgt   aatttttgaccgtcggattcttgcaatgatgcgtattcac  950950 5555 BAC克隆筛选BAC克隆筛选
Cexu13-14Full-cDNA  atttgtgccatgagagagcacaacttgccctgtcttcttcttc  ccccaaatatctttgccactgatcagtcatatatagttagtg  9501014     5550     BAC克隆筛选全长cDNA分离
表4 本发明克隆的Ghd7基因转基因T1单株的表现
基因型 考察单株数     播种到开花天数     株高(cm)     主穗颖花数
牡丹江8牡丹江8(+)牡丹江8(-)合江19合江19(+)合江19(-) 102811102510     53.0±1.4130.9±1.559.8±1.2P＝0.00000052.8±0.7104.3±1.750.8±1.5P＝0.000000     67.9±1.1106.8±0.971.6±1.3P＝0.00000060.7±0.7101.3±1.260.7±0.7P＝0.000000     69.3±4.3123.4±3.865.0±3.1P＝0.00000053.3±3.9161.7±8.355.5±2.1P＝0.000000
注释(+)and(-)代表转基因阳性和阴性单株；P值表示T1代阳性和阴性单株性状间差异t测验的概率值。
表5 Ghd7转基因T1代分离比测验
受体 晚穗，大穗和高杆单株数 早穗，小穗和矮杆单株数   卡方值(3∶1)
Moudanjian 8Hejiang 19 3625 1110    0.00720.085
实施例6：Ghd7的基因结构和功能预测
(1)Ghd7基因结构分析：
转基因单株验证候选基因的功能后，确定Ghd7基因在这个8175bp区间。根据Ghd7的序列，设计引物3’RACE(GTCATATTGTGGGAGCACGT)与5’RACE(ACCATCTCCTTGGGCATCGA)，利用5’和3’RACE技术，获得5’与3’末端的序列，据此分离全长cDNA。获得一个全长1014bp的cDNA，核苷酸序列特征如SEQ ID NO：2所示。本发明克隆的Ghd7基因的cDNA序列，与这个8175bp范围内的1,469bp至3,884kb区段完全匹配。通过比较该全长cDNA和明恢63的8,175bp的基因组序列得到了Ghd7基因的结构：Ghd7基因从转录起始密码至转录终止长2659bp，包含2个外显子(exon)和1个内含子(intron)，起始外显子长444bp，第二个外显子长327bp；内含子长1,647bp(图6)。因此，Ghd7基因的阅读框(open reading frame)长771bp，编码257个氨基酸，该基因的序列号如SEQ ID NO：1所示。
(2)Ghd7功能预测
利用BLASTp对Ghd7基因编码的由277个氨基酸组成的蛋白质结构进行搜索，发现在第189个氨基酸到第233个氨基酸区间包含1个与拟南芥CO蛋白保守的CCT结构域高度同源的基因(74％，2e-09)(Putterill et al.1995)，同时与许多调控植物开花有关的蛋白有高度同源性，如光周期调控开花(Putterill et al.1995，Yano et al.2000，Turner et al.2005)，小麦春花(Yan et al.2004)，生物钟(Strayer et al.2000；Salome et al.2006)and光信号(Kaczorowski and Quail 2003)。但是，Ghd7并没有明显的B-box锌指蛋白，因此，Ghd7是一个具有CCT结构域基因家族的新成员。
实施例7：比较测序确定Ghd7等位基因间的碱基变异
(1)序列测定
4个大穗型品种(明恢63，特青，93-11和HR5)，2个小穗型品种(牡丹江8和合江19)和2个中间表型的品种(中花11和Nipponbare)进行目标区段的测序。利用3对PCR引物扩增出覆盖8175bp的产物，再利用15条引物对该产物进行测序(表6)，采用高保真度的LA-Taq(日本TakaRa公司)从这些品种的基因组中进行PCR扩增。然后按照pGEM-T Vector System 1 kit试剂盒(购自美国Promega公司)的使用说明书，将PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌DH10B(购自美国Invitrogen公司)，通过兰白斑筛选获得阳性克隆后采用T7-R和SP6-F通用引物(购自中国上海生工生物工程公司)、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)、分别从每个亚克隆的两端测序。使用Sequencher 4.5软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。
表6 用于本发明比较测序的自行设计的引物
引物名称   Forward primer(5’-3’)  Reverse primer(5’-3’)  产物大小*  退火温度 用途
Full-cDNACEXU1-2CEXU3-4XUECEXU5-6XUECEXU7-8CEXU3374Cexue800CEXU4147cexu4933CEXU6105CEXU13-14   caacttgccctgtcttcttcttcgcaaggggatgtctaaacgattgccgaagaactggaactcttatccgttcatgtcgatggcatacggatccagcctctgttagaactgcaaggagatgcagtcatattgtgggagcacgtcaaagttccacgtatcctctatttgtgccatgagagagca  gatcagtcatatatagttagtgAatttttgaccgtcggattcTtgccgaagaactggaactcaccgaactcgaaaagcacacTtgcaatgatgcgtattcacCtcttcttcctcttctccttggaacggaacagaagttagctGtcgctggtgccaattatgaCcccaaatatctttgccact  26599509501870950  5055555055 全长基因扩增启动子区扩增启动子区扩增中间测序引物中间测序引物中间测序引物中间测序引物3’外区扩增中间测序引物中间测序引物3‘外区扩增
*PCR产物的大小是根据Nipponbare的序列确定的，不同品种中可能会有所变化。
2.序列比较
目标区段间的序列比较分析在4个大穗品种(明恢63、HR5、特青和93-11)和2个小穗品种(合江19和牡丹江8号)间进行，其中93-11中的Ghd7区间序列信息来自于重叠群AAAA02021502.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。序列比较在软件Vector NTI 9(美国InforMaxTM公司)上进行。序列分析发现，大穗型材料均在第一个外显子的第53个氨基酸发生终止突变(见图7)，可能这个提前的终止突变是导致基因功能的关键变异。
实施例7：Ghd7对光周期调控的反应
对珍汕97背景的Ghd7近等基因系进行长短日照处理。发现含有明恢63的Ghd7等位基因的单株，长日条件下，抽穗明显比珍汕97等位基因型(Ghd7缺失型)显著偏晚，株高显著偏高，穗颖花数显著偏多，产量显著偏高。但在短日条件下，近等基因系两种基因型间则没有差异(表7)。明恢63和珍汕97(MM)在长短日条件下，3个性状差异极显著；而珍汕97和珍汕97(ZZ)间只有每穗颖花数存在显著差异，而株高和抽穗期则差异不显著。显然，Ghd7在长日条件下延迟抽穗。
表7 近等基因系Ghd7两纯合基因型长、短日照条件下的表现
性状 环境   珍汕97   珍汕97(ZZ)  明恢63   珍汕97(MM)
抽穗期(天)株高(厘米)每穗颖花数 长日短日差异长日短日差异长日短日差异   62.5±1.163.1±1.3-0.678.2±2.375.32.988.7±4.480.4±5.38.3*   63.8±1.064.8±2.2-1.074.3±3.671.3±3.13.086.7±5.378.5±5.08.2*  90.3±1.975.3±1.815.0**102.4±2.786.7±2.115.7**155.4±7.896.1±4.859.3**   90.8±2.268.1±2.722.7**105.3±5.180.5±4.124.8**152.6±5.784.9±7.067.7**
珍汕97(ZZ)和珍汕97(MM)分别表示珍汕97背景的近等基因系；*，**表示5％，1％水平显著差异。
序列表
                                                                                    
<110>华中农业大学
<120>一种控制水稻谷粒产量，抽穗期和株高的多效性基因Ghd7的克隆及应用
<130>
<141>2007-09-12
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3917
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa0
<220>
<221>gene
<222>(1)..(3917)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(3558)..(3884)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1469)..(1912)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1913)..(3557)
<223>
<220>
<221>5’UTR
<222>(1259)..(1468)
<223>
<220>
<221>exon
<222>(1469)..(1912)
<223>
<220>
<221>exon
<222>(3558)..(3884)
<223>
<220>
<221>3’UTR
<222>(3885)..(3917)
<223>
<400>1
gagggatgag acggcacgac aacgccctca tgagggggaa tgaatcatcg ttgtcggtac       60
ggtcaaaacc aggctgggtt ttcacccacc gctcatcacc tgcaaatcta cggctgacgc      120
accgatgctc caccacagct caacctctgc cgatgtgtgg gaccactgca ccccctcccc      180
gccggctagc cttcgtacgc cgaagactgc gccacaccct caatctatta tcagtcatat      240
gtatgagagc aaccacggta tatcgaaagg taaccttatg gcaataatta catttataaa      300
gtggaacaca tacattgtga gaaatagctt tagcttagag tgcatcttat acttaaggtc      360
tacgacaagc aaaaagaaaa tattctctct cttatttatg tcatgaacaa gagctgaaaa      420
gcaggttttt ctatctcata tgggccccat attattgtta aatttcagca agggattagc      480
taaaaaactg ttgcaggttt tttgagtaaa aaactttcaa atctaactat agtatataat      540
tttactagaa ctacattata acaattatat aacttgtata gatgtattaa aataatatat      600
gcaactttat atctaatttg atagagataa taatgtagtt actgtaacta gggtataact      660
gaagtataac taacatgtaa cttgctaatt ttttaaaaaa cttgcaagct ggtgggatcg      720
aggtcctggg ttcgaacccc atgcagcgca caaattatgt ttctcacacg ggattttttt      780
ccatgaacgc gccagcacga atcttgagat gaatccgacg gtcaaaaatt cgaaagaatt      840
tacccctgtt ttctgtccat agaaaactag caaatctgtt tcagcaatag cattatgaga      900
attgctttaa caacaatcaa actattcatg ggccgcttct aagatcacac tagactcata      960
tacattgaga ttgccctgat atatccatct aattcatgga cattttccta gtcttggggg     1020
gatatagtat aataggagct agaggggggc atgggtagtg aagtccagcc agcacagaag     1080
atccttgggg ggatctggtt gcaatgggga tggccaatga ggagtcgcca aattatcagg      1140
tgaaaaaagg cggccggatt cctccacgta aggaccaaat ccatccacag atcgccccgc      1200
tctcctcgat cgatcataat atgatctcgc aatggccccc ctacctttcc ctcatcccca      1260
acttgccctg tcttcttctt cttcttcttc ttgtacctat attattacaa gtcatcgatc      1320
tcgctgatcg atcagtgatc acaagcattt cacaacccta gctagctgag ctgatcgagc      1380
tcaagtgacc tcacctgcta tagctaactt actagctagc tctagctagt tgttgtttgt      1440
agctcgatcg agtttgattt atccgttc atg tcg atg gga cca gca gcc gga         1492
                              Met Ser Met Gly Pro Ala Ala Gly
                              1               5
gaa gga tgt ggc ctg tgc ggc gcc gac ggt ggc ggc tgt tgc tcc cgc         1540
Glu Gly Cys Gly Leu Cys Gly Ala Asp Gly Gly Gly Cys Cys Ser Arg
    10                  15                  20
cat cgc cac gat gat gat gga ttc ccc ttc gtc ttc ccg ccg agt gcg         1588
His Arg His Asp Asp Asp Gly Phe Pro Phe Val Phe Pro Pro Ser Ala
25                  30                  35                  40
tgc cag ggg atc ggc gcc ccg gcg cca ccg gtg cac gag ttc cag ttc         1636
Cys Gln Gly Ile Gly Ala Pro Ala Pro Pro Val His Glu Phe Gln Phe
                45                  50                   55
ttc ggc aac gac ggc ggc ggc gac gac ggc gag agc gtg gcc tgg ctg         1684
Phe Gly Asn Asp Gly Gly Gly Asp Asp Gly Glu Ser Val Ala Trp Leu
            60                  65                   70
ttc gat gac tac ccg ccg ccg tcg ccc gtt gct gcc gcc gcc ggg atg         1732
Phe Asp Asp Tyr Pro Pro Pro Ser Pro Val Ala Ala Ala Ala Gly Met
        75                  80                   85
cat cat cgg cag ccg ccg tac gac ggc gtc gtg gcg ccg ccg tcg ctg         1780
His His Arg Gln Pro Pro Tyr Asp Gly Val Val Ala Pro Pro Ser Leu
    90                   95                 100
ttc agg agg aac acc ggc gcc ggc ggg ctc acg ttc gac gtc tcc ctc         1828
Phe Arg Arg Asn Thr Gly Ala Gly Gly Leu Thr Phe Asp Val Ser Leu
105                 110                 115                 120
ggc gga cgg ccc gac ctg gac gcc ggg ctc ggc ctc ggc ggc ggc agc         1876
Gly Gly Arg Pro Asp Leu Asp Ala Gly Leu Gly Leu Gly Gly Gly Ser
               125                  130                135
ggc cgg cac gcc gag gcc gcg gcc agc gcc acc atc gtgagtatca              1922
Gly Arg His Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Thr Ile
           140                 145
atccaataat cctgatccgg ccggcatgat cggctcgatc gagccgtgtc gattattaat       1982
ttccatctta tatattatta attgatgaat tcttgattga ttcatcgatc ctcctcgtct       2042
tttcttggct tccttgtttt tgttatttag tcaaaaacaa ctcttcattt ctgctgccta       2102
tatgccgtac aacttcaaac tatcaaaggt caaataatcg atcaatatat accaagtttg       2162
aattaatttg gagcttaatt aattaattac tggcttgcag cagctggttt atagtattgt       2222
ttctagctat atatgtgagg gccgtgtgtg ggatgtgatt tgcatctttc gatggcgact       2282
taattaattc gatgatatat ttcattgcat atgcatacgg atccagcctc tgtctatact       2342
gtacgattcc acatacgtat atgtacggtt aagtcagtat atatactttt agatagtcgc    2402
gtgtgctttt cgagttcggt agctatattt tagattgtaa aaacaagtca gaggctaatt    2462
ttataatcta gaaatactta tttccccgta tataaccgta tgttaaatat tgatggtgta    2522
atctacttat aagtcaggaa acatcattgc ttgctttctg gcgctttctt ctacatatca    2582
gtagaggaaa atggaaaaaa aaaagatgaa ttttgatgtt gtagtttgct atattcagca    2642
tatatgccat cagttataca tatgcagatc ttgctaaaac caaaataaaa atagaactgt    2702
aaggagatat tgtgcttctc ggtctattta cttacagttt gttgagaagt aatacgagca    2762
agcaaatgta tatatatatt tctttagaac tgcaaggaga tgcatataca tgtgtgattc    2822
aaacacacgt actgcacatt caaactataa aaacaacttg attgccgtag aagttaaaag    2882
ggagacatat ccatgggttt cggattctaa atcaatctat gtgtaaatga aactttagta    2942
tagtaggaaa taggttttca aaaaaaaagt atagtaggaa atagtatgtg tatatgcctt    3002
tttaaccctt aattacaagt tgtaataatt cagtgttaac aaagtcacgg actcacagag    3062
tgtgccctta cacaatttca gactaatttg taaatgcatc gatcgtcaca ttttatgtgg    3122
ttcaattatc tgacacagtt aattaatggt ggccgatcga tgtatgctcc tctagctttc    3182
cagctatatg cgtatgtaat aaatgaataa aacgtgtagg atgaaatgtg aatacgcatc    3242
attgcaatta atttgattaa tgctagtaaa aaatctgcaa atttgtcttt ttgaaattaa    3302
aatatgcctt ataaaattaa tggacccagg cccctaggcc aaaatatatt ggggcacaaa    3362
atcatgtcca tatatacatt cttatttgaa agtagactct gaaacaaaat atgcccatat    3422
aaatcaaggg aggttacaac taactgcatt tgcttatgcg tacatctgga ttgtaacttc    3482
tacgttttgt acatacgatg attaattgta ttcgagcttc ttaattgtac atctattaac    3542
taactagttt tgcag atg tca tat tgt ggg agc acg ttc act gac gca gcg     3593
                 Met Ser Tyr Cys Gly Ser Thr Phe Thr Asp Ala Ala
                     150                 155                 160
agc tcg atg ccc aag gag atg gtg gcc gcc atg gcc gat gtt ggg gag      3641
Ser Ser Met Pro Lys Glu Met Val Ala Ala Met Ala Asp Val Gly Glu
               165                  170                 175
agc ttg aac cca aac acg gtg gtt ggc gca atg gtg gag agg gag gcc      3689
Ser Leu Asn Pro Asn Thr Val Val Gly Ala Met Val Glu Arg Glu Ala
           180                 185                  190
aag ctg atg agg tac aag gag aag agg aag aag agg tgc  tac gag aag     3737
Lys Leu Met Arg Tyr Lys Glu Lys Arg Lys Lys Arg Cys Tyr Glu Lys
        195                200                  205
caa atc cgg tac gcg tcc aga aaa gcc tat gcc gag atg agg ccc cga      3785
Gln Ile Arg Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Met Arg Pro Arg
    210                 215                 220
gtg aga ggt cgc ttc gcc aaa gaa gct gat cag gaa gct gtc gca ccg      3833
Val Arg Gly Arg Phe Ala Lys Glu Ala Asp Gln Glu Ala Val Ala Pro
225                 230                 235                 240
cca tcc acc tat gtc gat cct agt agg ctt gag ctt gga caa tgg ttc      3881
Pro Ser Thr Tyr Val Asp Pro Ser Arg Leu Glu Leu Gly Gln Trp Phe
                245                 250                 255
aga tagataatta cagtgcgtat ataccactaa cta                             3917
Arg
<210>2
<211>148
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa0
<400>2
Met Ser Met Gly Pro Ala Ala Gly Glu Gly Cys Gly Leu Cys Gly Ala
1               5                   10                  15
Asp Gly Gly Gly Cys Cys Ser Arg His Arg His Asp Asp Asp Gly Phe
            20                  25                  30
Pro Phe Val Phe Pro Pro Ser Ala Cys Gln Gly Ile Gly Ala Pro Ala
        35                  40                  45
Pro Pro Val His Glu Phe Gln Phe Phe Gly Asn Asp Gly Gly Gly Asp
    50                  55                 60
Asp Gly Glu Ser Val Ala Trp Leu Phe Asp Asp Tyr Pro Pro Pro Ser
65                  70                 75                   80
Pro Val Ala Ala Ala Ala Gly Met His His Arg Gln Pro Pro Tyr Asp
                85                  90                  95
Gly Val Val Ala Pro Pro Ser Leu Phe Arg Arg Asn Thr Gly Ala Gly
            100                105                  110
Gly Leu Thr Phe Asp Val Ser Leu Gly Gly Arg Pro Asp Leu Asp Ala
        115                 120                 125
Gly Leu Gly Leu Gly Gly Gly Ser Gly Arg His Ala Glu Ala Ala Ala
    130                 135                 140
Ser Ala Thr Ile
145
<210>3
<211>109
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa0
<400>3
Met Ser Tyr Cys Gly Ser Thr Phe Thr Asp Ala Ala Ser Ser Met Pro
1               5                   10                  15
Lys Glu Met Val Ala Ala Met Ala Asp Val Gly Glu Ser Leu Asn Pro
            20                  25                  30
Asn Thr Val Val Gly Ala Met Val Glu Arg Glu Ala Lys Leu Met Arg
        35                  40                  45
Tyr Lys Glu Lys Arg Lys Lys Arg Cys Tyr Glu Lys Gln Ile Arg Tyr
    50                  55                  60
Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Met Arg Pro Arg Val Arg Gly Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ala Lys Glu Ala Asp Gln Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Tyr
                85                  90                  95
Val Asp Pro Ser Arg Leu Glu Leu Gly Gln Trp Phe Arg
            100                 105

Claims (5)

1.一种分离克隆的控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高性状的多效性基因Ghd7，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1的所述的基因，它的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求2所述的基因，它编码的蛋白质具有CO蛋白的CCT结构域，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.权利要求1-3任一项所述的基因在水稻育种中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的基因在水稻和禾本科植物分子进化研究中的应用。
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