CN101037695B

CN101037695B - 一种控制水稻花粉育性基因及应用

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Publication number: CN101037695B
Application number: CN2006100185751A
Authority: CN
Inventors: 吴昌银; 袁文雅; 张启发
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2026-03-16
Also published as: CN101037695A

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。本发明通过筛选T-DNA随机插入突变体库，得到完全不育的突变体，克隆并鉴定了控制水稻花粉育性的基因，命名为OsNMS。共分离检测表明OsNMS基因的T-DNA插入纯合与完全不育突变表型是共分离的，RT-PCR及启动子分析了OsNMS基因的表达模式，RNAi转基因植株育性的大幅下降，转基因功能互补实验使突变体的育性又大幅上升，进一步证明了OsNMS基因具有控制水稻花粉育性的功能。本发明所述的基因或蛋白质在水稻育种及了解植物雄性不育的机理等方面具有重要意义。

Description

一种控制水稻花粉育性基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及利用水稻T-DNA随机插入突变体库，分离克隆一种控制水稻花粉育性的基因OsNMS。该基因的失活可影响水稻花粉的正常发育并造成水稻植株的完全不育，通过RNAi技术抑制该基因的表达可使正常水稻的育性明显降低，通过互补试验可使突变体的育性有大幅提高。同时还涉及利用该雄性不育基因在水稻杂交制种上的应用。

背景技术

众所周知，水稻是禾谷类作物研究的模式植物。随着水稻基因组全序列的完成，水稻基因组的研究已进入功能基因组时代，而高通量、高效率的研究基因功能的方法是构建饱和的突变体库(Springer P S.Gene traps：tools for plant development andgenomics.Plant Cell，2000，12：1007-1020；Ramachandran S，Sundaresan V.Transposons as tools for functional genomics.Plant PhysiolBiochem，2001，39：243-252)。通过先找目标基因的突变体再观察其突变表型来研究基因的功能或先筛选突变表型再找突变的基因并验证两者之间的必然关系来研究基因的功能，也即是所谓的反向遗传学及正向遗传学两种方法。目前构建饱和突变体库的方法有以下三种：利用射线辐射或化学诱变剂处理种子等物理或化学的方法；利用反转座转座子的细胞培养的方法及利用转座子或T-DNA的遗传转化的方法。其中由于T-DNA的插入拷贝数低、插入位点的稳定遗传及插入位点的随机等特性，采用T-DNA的遗传转化创造突变体的方法是目前构建水稻饱和突变体库的常用方法(Wu et al.Development of enhancer trap linesfor functional analysis of the rice genome.PlantJ，2003，35：418-427；JeonJ S et al.T-DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice.PlantJ，2000，22：561-570；Sallaud C et al.Highly efficient production andcharacterization of T-DNA plants for rice(Oryza sativaL.)functional genomics.Thero Appl Genet，2003，106：1396-1408)。对已有的突变体库开展表型突变体的筛选，通过正向遗传学的方法来鉴定重要的发育调控功能基因是开展基因功能研究的有效方法之一。基于水稻全基因组测序已完成，筛选突变体库来阐释基因的功能已显端倪(Lee S Y et al.Functional analysis of the flowering time gene OsMADS50，theputative SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1/AGAMOUS-LIKE20(SOC1/AGL20)ortholog in rice.PlantJ，2004，38：745-764；Jung K H et al.Rice UndevelopedTapetuml Is a Major Regulator of Early Tapetum Development.Plant Cell，2005，17：2705-2722)。

植物花药的发育是一个多层次多步骤的过程，它包括花粉囊壁的发育、花粉母细胞的发育、小孢子的产生、花粉粒的成熟等等过程，其中任何一个步骤发育不正常，都有可能造成整个植株雄性不育。花粉发育这一复杂过程涉及到许多基因，了解这些基因在其发育过程中所起的生理生化方面的功能，将对花粉发育有个更为清晰的认识，这将有很大的理论和实际应用价值。目前，通过对雄性不育突变体的研究，已在拟南芥、玉米、水稻等植物中克隆了一些影响雄蕊发育的基因(Chaubal R et al.The transformationof anthers in the mscal mutant of maize.Planta，2003，216：778-788；SchiefthalerU et al.Molecular analysis of NOZZLE，a gene involved in pattern formation andearly sporogenesis during sex organ development in Arabidopsis thaliana.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96：11664-11669；Yang S L et al.TAPETUM DETERMINANT1is required for cell specialization in the Arabidopsis anther.Plant Cell，2003，15：2792-2804；Zhao D Z et al.The excess microsporocytesl gene encodes aputative leucine-rich repeat receptor protein kinase that controls somatic andreproductive cell fates in the Arabidopsis anther.Genes Dev，2002，16：2021-2031；Yang X et al.The Arabidopsis MALE MEIOCYTE DEATH1 gene encodesa PHD-finger protein that is required for male meiosis.Plant Cell，2003，15：1281-1295；Nonomura K et al.The novel gene HOMOLOGOUS PAIRING ABERRATION INRICE MEIOSIS1 of rice encodes a putative coiled-coil protein required forhomologous chromosome pairing in meiosis.Plant Cell，2004，16：1008-1020；Jung K H et al.Rice UndevelopedTapetuml Is a Major Regulator of Early TapetumDevelopment.Plant Cell，2005，17：2705-2722)。这些基因往往都是某一重要代谢途径的关键酶类或是调节下游基因表达的转录因子等等，它们的突变失活造成雄蕊发育的某一步骤受阻，最终表现为完全的雄性不育。

水稻是重要的粮食作物，是世界上约一半以上的人口的主食，中国人口众多又是水稻生产的粮食大国，因此提高水稻产量是当前我国水稻研究的主要目的之一。杂交育种是提高水稻产量的重要途径，而雄性不育在杂交育种中又有很重要的作用。利用雄性不育系进行杂交制种，能节约劳力、财力，保证杂交种的纯度，在雄性不育的基础上开展杂交优势的利用是水稻作物育种的主要方向之一。目前，获得雄性不育系材料主要有以下几种途径：寻找和利用自然界产生的雄性不育变异株；通过种间或种内杂交和连续多代回交的方法创造不育系；用人工诱变的方法创造不育系；用细胞工程的方法创造不育系；用基因工程的方法创造不育系。其中用基因工程的方法创造不育资源具有所需时间短，只改变目标性状，可同时得到新的有利性状及可自由配组等优越性。本发明通过筛选T-DNA突变体库，分离并克隆了控制水稻育性的基因，丰富了可供利用的基因资源，并通过基因工程的方法创造雄性不育系，对生产雄性不育水稻及其在水稻杂交育种上的应用都有重要意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种控制水稻花粉育性基因OsNMS，其具有如SEQ ID No.1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No.1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括由于添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物，还包括具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。本发明也包括与SEQID No.2所示的氨基酸序列具有50％以上(包括50％)同源性的功能类似物。该基因的失活可影响水稻花粉的正常发育并造成水稻植株的完全不育，因此该基因的克隆有利于了解花粉发育的过程及水稻雄性不育的机理。

本发明的另一个目的是控制水稻花粉育性基因OsNMS的转基因水稻在水稻杂交育种中的应用。具体的说就是利用基因敲除的方法敲除OsNMS基因或利用RNAi技术抑制该基因的表达从而得到完全不育的水稻植株，创造了水稻新的雄性不育系，开拓了水稻雄性不育的资源，并将该资源用以上方法用于其它性状都比较优良的水稻品种中，得到该品种的不育系，待找到相应的恢复系、保持系，即可利用三系法制出优良的杂交种，使该品种的杂交优势得到充分利用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施。

一、水稻完全不育突变体的筛选

利用增强子捕获系统的T-DNA载体插入粳稻品种中花11号(OryzasativaL. subsp.japonica cv.Zhonghua 11)创建突变体库，经筛选T1代植株得到完全不育突变体Osnms-1。该突变体在营养生长期与正常单株没有任何差别，只是在抽穗期花粉不外露，成熟后表现为完全不育。

二、突变表型与T-DNA插入的共分离检测

利用Tail-PCR技术(Liu et al.Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatableampl ification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones forchromosome walking.Genomics，1995，25：674-681)分离完全不育突变体Osnms-1中T-DNA侧翼水稻基因组序列，对该侧翼序列进行数据搜索，得到水稻基因组中T-DNA插入位点的序列信息，分别在T-DNA两端的水稻基因组上设计引物，加上T-DNA末端设计的引物，如图1a示，引物a+b，b+c配对扩增突变体Osnms-1家系T1及T2代植株，验证各单株的基因型。结果表明突变体Osnms-1完全不育的突变性状与该位点T-DNA的纯合插入事件共分离。

三、插入位点的侧翼序列的序列分析和基因预测

BLAST分析显示突变体Osnms-1的侧翼序列定位于水稻第10号染色体的BAC克隆OSJNBa0060A14上。插入位点位于OsNMS基因的启动子区域，离起始密码子ATG有566bp。预测OsNMS基因的结构如图1a所示，由11个外显子和10个内含子组成。该基因编码一个假定蛋白，BALST分析都没找到同源基因或同源蛋白，表明OsNMS基因是一个新基因，在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上也找不到任何EST，显示该基因可能表达量低或瞬时表达。

四、RT-PCR及启动子转化验证基因的表达模式

RT-PCR(Reverse-transcript PCR)分析OsNMS基因在抽穗期的根、茎、叶、叶鞘、稻穗中的表达情况，结果抽穗期时OsNMS基因在根、茎、叶中不表达，而在叶鞘、稻穗中有表达。OsNMS基因在突变体的根、叶、叶鞘、稻穗中均不表达。同时构建启动子分析载体并转化，结果在转基因植株的茎、叶鞘和叶中GFP均不表达，而在花器官中有表达并且仅在花丝、花柱、柱头及浆片中表达。

五、等位突变体的获得及共分离分析

通过BLAST分析在本室构建的突变体数据库中找到突变体Osnms-1的等位突变体Osnms-2，该突变体的T-DNA插入位点位于OsNMS基因的第4个内含子中，与突变体Osnms-1的插入位点相距约2.8kb。种植突变体Osnms-2家系的T1代群体，观察到有完全不育的突变单株分离出来，共分离检测方法及过程同Osnms-1突变体的共分离分析，结果突变体Osnms-2的完全不育的突变表型与目标位点T-DNA的纯合插入事件共分离。六、遗传转化验证基因的功能

根据预测的OsNMS基因的结构，设计RNAi(RNA干涉)片段，构建RNAi载体并转化，结果显示RNAi的转基因植株的育性大幅的下降。同时将包含完整的OsNMS基因的片段转到突变体Osnms-1中进行功能互补试验，结果阳性的转基因植株的育性又大幅上升，完全不育的突变性状得到恢复。

由上可知，由于T-DNA的纯合插入造成OsNMS基因的失活，而OsNMS基因的失活造成植株的完全不育，同时应用RNAi抑制技术抑制OsNMS基因的表达，可以得到完全不育的水稻植株。因此利用基因敲除的方法敲除OsNMS基因或利用RNAi技术抑制该基因的表达可创造水稻新的雄性不育系，丰富了水稻雄性不育的资源。

本发明的优点：通过对T-DNA突变体库的筛选，克隆了一个控制水稻育性的基因OsNMS，该基因的克隆有利于了解花粉发育的过程及水稻雄性不育的机理；通过基因工程的方法造成OsNMS基因的失活可创造水稻新的雄性不育系，拓展了雄性不育的资源为水稻杂交育种提供一种雄性不育的资源。

附图说明

图1a.显示OsNMS基因的结构示意图及T-DNA插入位点。黑色长方形显示OsNMS基因的11个外显子(Exons)，ATG、TAA分别代表该基因的起始及终止位点。倒置的三角形代表T-DNA的插入位点，RB、RL分别表示T-DNA的右边界及左边界。引物a、b、c是用来检测转化株后代的基因型，其中a+b产物大小约为1kb，b+c产物大小约为0.9kb。RT-PCR引物p1、p2是用来检测OsNMS基因的表达模式。

图1b.显示成熟期突变体Osnms-1的突变表型，完全不育。左边是突变体osnms，右边是野生型对照。

图1c.显示成熟期突变体Osnms-1稻穗，花粉不外露。

图1d.显示成熟期野生型对照的稻穗。

图1e.显示抽穗期野生型对照花粉的I2-KI(1％)染色结果，所有花粉都着色，花粉粒呈圆形，形态正常。

图1f.显示抽穗期突变体Osnms-1花粉的I2-KI(1％)染色结果，所有花粉都不着色，花粉粒皱褶，形态也不正常。

图2a.显示独立转化子T1代分离群体的基因型情况。1-20代表各分离单株株号，W：wi ld type，H：heterozygous plant，M：homozygous plant。

图2b.显示T1代中第1号单株(W)的后代(T2)的基因型情况。1-20表示T2代各单株株号。

图2c.显示T1代中第12号单株(H)的后代(T2)的基因型情况。1-40表示T2代各单株株号。其中红色的株号为3、12、15、16、28、36、39、40的表型为完全不育。

图2d.显示T1代中第13号单株(H)的后代(T2)的基因型情况。1-40表示T2代各单株株号。其中红色的株号为13、17、26、27、28、31、32的表型为完全不育。

图2e.显示RT-PCR初步分析OsNMS基因的表达模式。所用引物为图1a中的p1、p2。

图2f.显示转启动子的植株开花期叶片GFP不表达。

图2g.显示部分转启动子的植株开花期花器官GFP不表达。

图2h.显示部分转启动子的植株开花期花器官GFP表达，且仅在花丝、花柱、柱头及浆片中表达(绿色显示GFP表达)。

具体实施方式

本发明是利用本室构建的水稻T-DNA随机插入的突变体库，通过正向遗传学的方法分离并克隆影响水稻花粉发育的新基因OsNMS。突变体库的构建是按照Wu et al.(Wuet al.Development of enhancer trap lines for functional analysis of the ricegenome.Plant J，2003，35：418-427)所描述的方法构建而成。为进一步理解本发明的内容与目的，下面就以实施事例详细介绍本发明的具体技术实施步骤。

实施例1：突变体的筛选

突变体库转化当代即T0代植株分别分单株收种后，在正常栽培条件下种植下一代即T1代，每份材料种2行，每行10株，共20株，按5×8寸的栽种密度进行种植。在水稻整个生育期田间记载突变体的表型，对于同一家系内突变植株的表型一致、符合典型的3∶1分离的家系及时抽提各单株的DNA进行PCR阳性检测，对于一个家系内的所有突变体单株PCR均为阳性的家系作为后续研究的材料。PCR阳性检测的引物位于T-DNA区段上，一对引物分别是GV-F：5-GGC ATC GGT AAA CAT CTG CT-3，GV-R：5-GCC TCA AGAAGC TCA AGT GC-3，PCR产物大小为611bp，反应体系的总体积为20μl，DNA1模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL2 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10 uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。

通过本例得到一个突变体Osnms-1，该突变体从外观上看在营养生长期与野生型对照没有任何区别。在生殖生长时期，突变体与对照在抽穗期、穗型等方面也没有明显差别，但在抽穗期，突变体表现为花粉不外露，如图1c所示，而对照如图1d所示。取抽穗期的花粉用1％的I2-KI染色后，显微观察如图1e及1f所示，其中图1e为对照株的花粉染色结果，所有花粉都着色，且花粉粒呈正常的圆形，图1f为突变体Osnms-1的花粉染色结果，所有花粉都不着色，且花粉粒皱褶，形态不正常，显示该突变体是雄性不育的突变体。至成熟时，突变体Osnms-1表现为完全不育，如图1b所示。

实施例2：突变体T-DNA侧翼水稻基因组序列的分离

针对实施例1中得到的突变家系，通过Tail-PCR的方法(Liu et al.Thermalasymmetric interlaced PCR：Automatable ampl ification and sequencing of insertend fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics，1995，25：674-681)分离T-DNA插入位点的侧翼序列，所用的位于T-DNA左边界上的锚定引物从内向外依次为L11：5-GCA AAG AAA TAG AGT AGA TGC CGA CCG-3，L21：5-GTT TCTCCA TAA TAA TGT GTG AGT AGT TCC C-3，LBT3：5-CCA GTA CTA AAA TCC AGA TCC CCCGAA T-3，随机引物为AD2a：5-(AGCT)GT CGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GA A-3。反应体系为：第一轮：DNA模板1.0μl；10×buffer 2.0μl、2mM dNTP 2.0μl、25mMMgCl₂2.0μl、10μM特异性引物L110.2μl、100μM简并引物AD2a0.2μl、Taq酶(Takara公司)1u，加ddH₂O至20μl。第二轮：DNA模板1.0μl、10×buffer 2.0μl、2mM dNTP2.0μl、25mM MgCl₂2.0μl、50％甘油2.0μl、10μM特异性引物L21 0.2μl；100μM简并引物AD2a 0.2μl、Taq酶1u，加ddH₂O至20 μ l。第三轮：DNA模板1.0μl、10×buffer 2.0μl、2mM dNTP 1.5μl、25mM MgCl₂ 1.2μl、 50％甘油2.0μl、10μM特异性引物LBT3 0.2μl、100μM简并引物AD2a 0.2μl、Taq酶1u，加ddH₂O至20μl。三轮反应程序是按照Liu et al(Liu et al.Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 andYAC clones for chromosome walking.Genomics，1995，25：674-681)所述基础上稍加改进。总体积20ul的Tail-PCR产物取7ul在0.8％的琼脂糖胶中检测是否有有效扩增，挑出有有效扩增的剩余产物用去磷酸化酶(SAP Takara公司)及核酸外切酶1(EXOI NEB公司)处理后送上海基因中心测序，测序引物为NTLB5：5-AAT CCA GAT CCC CCG AAT TA-3。

通过本例得到突变体Osnms-1家系T-DNA的插入位点的侧翼序列，对侧翼序列数据在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上做BLAST分析显示该位点位于水稻第10染色体的BAC克隆OSJNBa0060A14上。根据预测T-DNA位于一个开放读码框(ORF)的上游区域，离ATG有566bp，如图1a所示，该ORF由11个外显子(Exon)组成，Exon1至Exon 11的大小分别为30bp、1051bp、560bp、148bp、90bp、61bp、150bp、59bp、135bp、92bp、69bp。内含子Intron1至Intron10的大小分别为118bp、39bp、108bp、1030bp、123bp、92bp、120bp、518bp、745bp、90bp。该基因OsNMS编码一个假定蛋白(Hypothetical protein)，同源性分析找不到任何同源基因或同源蛋白，显示OsNMS是一个新基因。在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上也找不到任何EST，显示该基因可能表达量低或瞬时表达。

Tail-PCR分离得到osnms-1突变体的侧翼序列如下：

ATCGTCGATTAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTTAAGTTGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCACA

ATATATCAAAAGCAAGTTGTGTAGCAATCAAATCATCCAGCTTAGAAATTTAGGTGTGGTACTGTGGTTATGTAA

TGCAGCTCCACCACCACTGTAGTAATTTAAAGTTGACAGTTGTAGTACAACGATGCAGTTATTTGTTACTACTTT

TCAATGCTAGTTTCTTTTCTCTCGACGATCTTTGGAACGGCCATTTTTGTTTTTAGGAATTAAAAATTGTATGGT

TAAAAGACTTGGCCATATCCAATTGCATTCTTAGGGTGTTATAGATGCTCAACACATGCGCCGACCCCTTTGAGG

TTGTGGCTGCTCTTGAAGGGGGCTTTTATGCCCATCATTTGTTGAGACGAGGGCAGTGATTCGGGGGATTTGGAT

TTTAGTCCTGCGGGGCCAAGGCCCATGCTTAAATAAACCCTGCTTTGTTCCATCTCTGTTTGTATTTGCTACTCT

TAAGGGTTTTGGTGAGGGATTGTTTCTCATCTAGGTATTTTGTGTTATCCACCTCCCTGGGTATTCACTATCACC

实施例3：T-DNA与突变性状的共分离验证

根据实施例2得到的突变体Osnms-1家系T-DNA定位结果，设计基因组引物a：5-GAGTGG AGC CTG GAT TGT GT-3，引物b：5-TTG TGA CGC CAA CTG ATA CC-3与T-DNA左边界上引物c：5-AAT CCA GAT CCC CCG AAT TA-3配对扩增验证T1代及T2代各单株的基因型，如图1a所示。并将基因型与表型对应，看是否符合共分离。引物a+b的产物大小约为1kb，引物b+c的产物大小约为0.9kb，由于T-DNA转入基因组的片段约有10kb，所以当T-DNA插入a与b之间，则由于片段过大而不能扩增。因此，当一个单株分别用引物a+b及引物b+c扩增后出现三种情况，情况1：a+b有目标带扩增，而b+c则没有；情况2：a+b及b+c都有目标带扩增；情况3：a+b没有目标带扩增，而b+c则有目标带扩增。该三种情况分别对应三种基因型，即情况1为野生型(W)，该位点没有T-DNA的插入；情况2为杂合型(H)；情况3为突变型(M)。基于以上所述，突变Osnms-1家系T1代20株单株的基因型如图2a所示。其中属于野生型单株有：1、2、6、11、14、18；属于杂合型单株有3、5、9、12、13、16、17、19；属于突变型单株有4、7、8、10、15、20。突变体Osnms-1家系T1代突变性状记录为4、7、8、10、15、20完全不育。T-DNA插入水稻基因组，造成内源基因的失活，往往在转化当代T0代看不到突变表型，而在T1中出现1∶2∶1的分离，其中约1/4的单株由于突变位点的纯合而可能表现出突变表型。由此可见，突变体Osnms-1家系T1分离群体的完全不育的突变表型与基因型完全对应。且该突变属于单基因控制的隐性突变。

由于T1代家系单株较少，为进一步验证Osnms-1家系的突变表型与基因型的对应关系，将T1代单株进行T2代共分离检测。在T2代中种植T1代的第1、2、6、11、14号野生基因型单株后代及第3、5、9、12、13、16号杂合基因型单株的后代，其中前者每株系种20株，后者每株系种40株，其他种植方式及表型观察同T1代。结果T2代的突变表型与T1代观测到的突变表型完全一致且与基于PCR检测的基因型完全对应，如图2b、2c、2d所示，也即是所有野生型单株后代都是野生型基因型，正常表型；所有杂合型单株的后代都有突变分离，且分离后的突变表型与基因型也完全对应。

由此可见，突变体Osnms-1家系的完全不育的突变性状与T-DNA的插入纯合基因型共分离，证明OsNMS基因的突变，影响花粉粒的发育，造成植株的完全不育。

实施例4：等位突变体的获得及共分离验证

为进一步证明OsNMS基因与不育表型的关系，在本室的T-DNA突变体数据库中(http://rmd.ncpgr.cn/)，通过BLAST分析，找到突变体Osnms-1的等位突变体Osnms-2，突变体Osnms-2的T-DNA插入位点位于OsNMS基因的第4个内含子中，与突变体Osnms-1的插入位点相距约2.8kb。同突变体Osnms-1类似，种植突变体Osnms-2家系的T1代分离群体100株，结果有22株表现为完全不育，其抽穗期花粉粒皱褶，碘染也都全不着色，PCR检测也仅有这22株的基因型为突变基因型。由此可见，突变体Osnms-2的不育表型与突变基因型也完全对应。

实施例5：RT-PCR验证OsNMS基因的表达模式。

由于OsNMS基因在公共数据库中没有同源基因及EST，因此用半定量RT-PCR(Reverse-transcript PCR)的方法分析该基因的表达模式，RT-PCR所用引物p1位于Exon7上，引物p2位于Exon9上，如图1a所示。引物p1为：5-GTT AGT AGT GGT GCTAGG AAG G-3；引物p2为：5-GCT TGT CAG CAA CTC CCT TA-3。其中p1+p2扩反转录产物的产物大小为329bp，p1+p2扩基因组的产物大小为967bp。又由于突变体Osnms-1的突变株与对照单株在株高，分蘖数，叶色，叶形等方面没有差别，而在生殖生长时影响花粉的发育，因此样品取于抽穗期的根、茎、叶、叶鞘、稻穗。RT-PCR的程序如下：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃45s、72℃1min 38cycles，72℃延伸5min，RT-PCR的检测结果如图2e所示。由此可见，抽穗期时OsNMS基因在根、茎、叶中不表达，而在叶鞘、稻穗中有表达。OsNMS基因在突变体的根、叶、叶鞘、稻穗中均不表达，显示T-DNA的插入虽位于该基因的上游，但亦可造成该基因的失活，进而表现出完全不育的表型。

实施例6：OsNMS基因启动子的表达分析。

为进一步了解OsNMS基因的表达模式，将OsNMS基因启动子区域通过PCR扩增出来，PCR引物分别为F78PR1：5-TTG GTC GAC AAA TGA ATC GGG GAG ACT GAC A-3，F78PL1：5-CTG AAG CTT AGG TGC AGC TTT TGG GAT AAT-3，左右引物两端分别带有HindIII及SalII的酶切位点及保护碱基。PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10 uM引物0.2ul、50％甘油2ul、0.3单位rTaq酶(Takara公司)。反应程序为：94℃变性3min，94℃ 45s、55℃60s、72℃90s 30cycles，72℃延伸5min，共扩10管，收集PCR产物于1.5ml离心管，加等体积24∶1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心10分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积醋酸钠，-20℃放置30分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，加500ul 75％乙醇放置5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，凉干，加10ul ddH₂O溶解。再将纯化的PCR产物用HindIII及SalI酶切，再纯化，回收，再与已用HindIII及SalI酶切过的p1381进行连接。16℃反应约10小时，反应结束加0.5ul proteinase K，37℃，10分钟。取1ul电转入大肠杆菌(E.Coli)DH10B(购自美国Invitrogen公司)，挑单克隆，扩大培养提取质粒，PCR验证是否含有目标片段，把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，转化水稻粳稻品种中花11号(Hiei等，Efficient transformation of rice(OryzasativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282)。

农杆菌介导的遗传转化步骤如下：

1.愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养4周，温度24-26℃。

2.愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度24-16℃。

3.预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养5天，温度24-26 ℃。

4.农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

5.农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡20分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

6.愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含500ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为500ppm，第二次以后为300ppm，潮霉素每次均为250ppm)

7.分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

8.生根

(1)剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

9.移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

本发明共获得独立转基因水稻植株30株，在苗期检测转基因植株GFP的表达情况，结果根和叶中GFP均不表达。在抽穗开花期检测转基因植株GFP的表达情况，结果茎、叶鞘和叶中GFP均不表达，而在花器官中有表达并且仅在花丝、花柱、柱头及浆片中表达，如图2f、2g、2h所示GFP的表达情况(绿色显示GFP表达)，表达比例为14/30。

Osnms-1突变体在营养生长期与对照没有任何差别，而只在生殖生长期影响花粉的发育，故可推测OsNMS基因应该会在水稻花器官中表达。OsNMS基因启动子的表达分析，证实了OsNMS基因确实是在花器官中表达，同时OsNMS基因在花器官中某些部位的表达与突变表型又吻合很好。首先，突变体的花粉碘染后不着色，显微观察花粉粒皱褶，显示花粉粒中缺乏淀粉之类的营养物质的储备，而水稻花丝的主要作用之一是给花粉粒运输营养物质；其次，突变体在开花期花粉不外露，而水稻浆片的主要作用之一是在开花期吸水膨胀，撑开水稻的内外稃，使花粉外露，便于传粉受精。

实施例7：RNAi(RNA干涉)载体转化验证OsNMS基因功能

根据预测的基因结构，在OsNMS基因的第3个外显子上设计一对RNAi引物F78iR：5-ggg gac aag ttt gta caa aaa agc agg ctC TAA TGT TGG GGC TCG AAA G-3；F78iL：5-ggg gac cac ttt gta caa gaa agc tgg gtC AAA ATC ATC TGG CAT GTC G-3。以转化受体中花11号基因组为模板扩出RNAi片段构建RNAi载体进行转化。PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10 uM引物0.2ul、50％甘油2ul、0.3单位rTaq酶(Takara公司)。反应程序为：94℃变性3min，94℃ 45s、55℃45s、72℃60s 30cycles，72℃延伸5min，共扩10管，收集PCR产物于1.5ml离心管，加等体积24∶1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心10分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积醋酸钠，-20℃放置30分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，加500ul 75％乙醇放置5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，凉干，加10ul ddH₂O溶解。再将纯化的PCR产物连接到RNAi载体pHellsgate 4上，连接体系为：gatway BP clonase 1ul，pHellsgate 4 vector0.5ul，BP reaction buffer 1ul，PCR纯化产物2.5ul，16℃反应约10小时，反应结束加0.5ul proteinase K，37℃，10分钟。取1ul电转入大肠杆菌(E.Coli)DH10B(购自美国Invitrogen公司)，挑单克隆，扩大培养提取质粒，PCR验证是否含有目标片段，把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，转化水稻粳稻品种中花11号(Hiei等，Efficient transformation of rice(OryzasativaL.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJ，1994，6：271-282)。

农杆菌介导的遗传转化步骤基本同实施例6中转化步骤，只是选择培养时用新霉素而非潮霉素筛选。

本发明共获得独立转基因水稻植株46株，PCR检测阳性植株为43株，阳性植株与阴性植株在营养生长期无明显差别，但在成熟期部分阳性植株完全不育或高度不育，具体各转化单株的结实率统计情况见下表。

株号	阳性	结实率	株号	阳性	结实率
						UF78i1-1	YES	8.2％	UF78i1-24	YES	71.3％
UF78i1-2	YES	40.3％	UF78i1-25	YES	82.7％
						UF78i1-3	YES	79.1％	UF78i1-26	YES	71.0％
UF78i1-4	YES	0.0％	UF78i1-27	YES	75.4％
						UF78i1-5	YES	13.7％	UF78i1-28	YES	5.9％
UF78i1-6	NO	76.9％	UF78i1-29	YES	72.9％
						UF78i1-7	YES	77.6％	UF78i1-30	YES	56.7％
UF78i1-8	YES	4.3％	UF78i1-31	YES	47.2％
						UF78i1-9	NO	84.4％	UF78i1-32	YES	57.0％
UF78i1-10	YES	4.4％	UF78i1-33	YES	28.4％
						UF78i1-11	YES	63.0％	UF78i1-34	YES	45.3％
UF78i1-12	YES	78.3％	UF78i1-35	YES	0.0％
						UF78i1-13	YES	34.4％	UF78i1-36	YES	0.0％

UF78i1-14	YES	0.0％	UF78i1-37	YES	0.0％
						UF78i1-15	YES	0.0％	UF78i1-38	YES	60.8％
UF78i1-16	YES	0.0％	UF78i1-39	YES	44.0％
						UF78i1-17	YES	60.0％	UF78i1-40	YES	0.0％
UF78i1-18	YES	0.0％	UF78i1-41	YES	33.0％
						UF78i1-19	YES	11.5％	UF78i1-42	YES	68.6％
UF78i1-20	YES	0.0％	UF78i1-43	YES	0.0％
						UF78i1-21	YES	55.6％	UF78i1-44	YES	7.4％
UF78i1-22	YES	0.0％	UF78i1-45	YES	56.8％
						UF78i1-23	NO	83.9％	UF78i1-46	YES	49.5％

RNAi转基因植株T0代结实率统计情况

3株阴性株的结实率分别为76.9％、84.4％、83.9％，属于正常育范畴。由此可见，通过RNAi技术抑制了OsNMS基因的表达，造成了水稻植株的育性的明显降低，进一步证明了OsNMS基因为控制水稻花粉育性的基因，并由此方法可以创建水稻的雄性不育系，用于水稻配制杂交种。

实施例8：互补实验验证OsNMS基因功能

根据OsNMS基因的序列，在网站(http://www.genome.arizona.edu)上找到包含该基因的日本晴BAC克隆OSJNBa0076L08并提取日本晴BAC克隆OSJNBa0076L08质粒5μg，使用限制性内切酶SalI及NheI(Takara公司)完全消化质粒，将酶切产物使用0.8％琼脂糖凝胶电泳(40v，10小时)，挖取11.6kb的DNA片断回收。取回收产物100 ng，与经过限制性内切酶SalI及XbaI(Takara公司)消化过的双元载体pCABIA2301载体50ng使用T4DNA连接酶(NEB公司)于16℃进行连接反应，pCAMBIA2301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。反应进行16小时后，取连接产物2μl电转化大肠杆菌感受态细胞DH10B(购自美国Invitrogen公司)，转化产物进行兰白斑筛选。挑取白色转化子，使用OsNMS基因特异的引物a和b组合进行PCR阳性克隆的筛选，PCR反应条件如下：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。获得了用于转化的质粒pCNMS，这个核酸片段包含完整的OsNMS基因ORF区，将这个质粒20ng通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中，使用农杆菌介导的遗传转化方法转化osnms突变体(Hiei等，Efficient transformation of rice(OryzasativaL.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJ，1994，6：271-282)，同时将不含OsNMS基因的空载体转化osnms突变体，得到的转基因植株作为对照。

农杆菌介导的遗传转化步骤同实施例6中转化步骤。

本发明共获得独立转OsNMS基因水稻植株66株，PCR检测阳性植株为61株，转空载体的转基因植株32株。结果转空载体的转基因植株全部表现为完全不育，而阳性的转OsNMS基因水稻植株有48株育性得到恢复，结实率为2-78.6％，而阴性的转OsNMS基因水稻植株也都完全不育。互补实验T0代转基因植株结实率统计具体情况见下表。

互补实验转基因植株T0代结实率统计情况

由此可见，通过互补实验，使Osnms-1突变体的不育性状得到恢复，更进一步证明了OsNMS基因为控制水稻花粉育性的基因。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthaleneacetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；G-418(新霉素)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)组织培养的溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后在20-25℃下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O) 2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

11)葡萄糖贮存液 (0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25℃保存备用。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6min母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6min母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6min母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250 ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6min母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6min母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6min母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的新霉素(G-418)或潮霉素(Hgromycin)和500ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6min母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的新霉素(G-418)或潮霉素(Hgromycin)和300ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6min母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmin母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

SEQ ID No.1

<110>华中农业大学

<120>一种控制水稻花粉育性基因及应用

<130>一种控制水稻花粉育性基因及应用

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5500

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>1

<210>2

<211>2445

<212>mRNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2442)

<223>

<400>2

SEQ ID No.2

<110>华中农业大学

<120>一种控制水稻花粉育性基因及应用

<130>一种控制水稻花粉育性基因及应用

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>814

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>1

Claims

1.一种调控水稻花粉育性的基因OsNMS在控制水稻花粉育性上的应用，所述基因OsNMS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。