CN102676536B - OsLIS-L1基因控制水稻株高和花粉育性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻植株株高和育性基因OsLIS-L1的DNA片断的分离克隆、功能验证和应用。所述的DNA片断突变体后导致水稻植株半矮，大部分花粉败育。本发明揭示了该基因在控制水稻株高及育性等农艺性状分子机理等方面的应用。

Description

OsLIS-L1基因控制水稻株高和花粉育性的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及利用水稻T-DNA随机插入突变体库，通过突变体表型的筛选鉴定，采用正向遗传学的方法，分离克隆一种控制水稻株高和花粉育性的新基因OsLIS-L1，并通过等位突变体分析，转基因互补实验及RNAi(RNA干涉)抑制实验证明了OsLIS-L1基因的功能。同时还涉及利用该基因在水稻制种上的应用。

背景技术

水稻作为重要的粮食作物，世界上约一半的人口以其为主食。同时，由于水稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的共线性，而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入功能基因组时代，而高通量、高效率的研究基因功能的方法是构建饱和的突变体库(Springer P S.Gene traps：tools for plant development and genomics.Plant Cell，2000，12：1007-1020；Ramachandran S，Sundaresan V.Transposons as tools for functionalgenomics.Plant Physiol Biochem，2001，39：243-252)。通过先找目标基因的突变体再观察其突变表型来研究基因的功能或先筛选突变表型再找突变的基因并验证两者之间的必然关系来研究基因的功能，也即是所谓的反向遗传学及正向遗传学两种方法。目前构建饱和突变体库的方法有以下两种：一是利用射线辐射或化学诱变剂处理种子等物理或化学的方法；二是利用反转座转座子或转座子或T-DNA的遗传转化的方法。其中由于T-DNA的插入拷贝数低、插入位点的稳定遗传及插入位点的随机等特性，采用T-DNA的遗传转化创造突变体的方法是目前构建水稻饱和突变体库的常用方法(Wu等，Development of enhancer traplines for functional analysis of the rice genome.Plant J，2003，35：418-427；Jeon J S等，T-DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice.Plant J，2000，22：561-570；Sallaud C等，Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice(Oryzasativa L.)functional genomics.Thero Appl Genet，2003，106：1396-1408)。对已有的突变体库开展表型突变体的筛选，通过正向遗传学的方法来鉴定重要的发育调控研究基因是开展基因功能研究的有效方法之一。基于水稻全基因组测序已完成，筛选突变体库来阐释基因的功能已显端倪(Lee S Y等，Functional analysis of the flowering time gene OsMADS50，the putative SUPPRESSOR OFOVEREXPRESSION OF C01/AGAMOUS-LIKE20(SOC1/AGL20)ortholog in rice.Plant J，2004，38：745-764；Jung K H等，Rice Undeveloped Tapetuml Is a Major Regulator of Early Tapetum Development.PlantCell，2005，17：2705-2722；Kumar M等，A candidate gene OsAPC6 of anaphase-promoting complexof rice identified through T-DNA insertion.Funct Integr Genomics，2010，10：349-358；Li X等，FLEXIBLE CULM 1encoding a cinnamyl-alcohol dehydrogenase controls culm mechanical strength inrice.Plant Mol Biol，2009，69：685-697；Yuan W等，Mutation of the rice gene PAIR3results inlack of bivalent formation in meiosis.Plant J，2009，59：303-315；Chang Y等，Replication proteinA(RPAla)is required for meiotic and somatic DNA repair but is dispensable for DNA replicationand homologous recombination in rice.Plant Physiol，2009，151：2162-2173)。

株高是水稻的重要农艺性状之一，它可以提高植株的丰产潜力，抗倒伏和肥料的耐久性。20世纪60年代以矮化育种为标志的“绿色革命”和70年代的水稻杂种优势利用，使水稻产量有了前所未有的突破。自此以后，株高的遗传基础得到了广泛研究。造成植株矮化的因素有很多，其中赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)是决定株高的2个最重要因素。目前，已经在水稻中克隆了与赤霉素(GA)有关的植株矮化突变体，如sdl，d1，d18(Sasaki A等，Green revolution：a mutant gibberellin-synthesis gene in rice.Nature，2002，416：701-702；Ueguchi-TanakaM，等，Rice dwarf mutant dl，which is，defective in the alphasubunit of the heterotrimeric G protein，affects gibberellin signal transduction.Proc Nat1 AcadSci USA，2000，97：11638-11643；Itoh H，等，Modification of rice plant height by suppressingthe height-controlling gene，D18，in rice.Breed Sci，2002，52：215-218)等。已经在水稻中克隆了与油菜素内酯(BR)有关的植株矮化突变体，如brd1，brd2，d2(Mori M，NomuraT等，Isolation andcharacterization of a rice dwarf mutant with a defect in brassinosteroid biosynthesis.PlantPhysiol，2002，130：1152-1161；Hong Z等，The rice brassinosteroid-deficient dwarf2 mutant，defective in the rice homolog of Arabidopsis DIMINUTO/DWARFl，is rescued by the endogenouslyaccumulated alternative bioactive brassinosteroid，dolichosterone.Plant Cell，2005，17：2243-2254；Hong Z等，A rice brassinosteroid-deficient mutant，ebisu dwarf(d2)，is causedby a loss of function of a new member of cytochrome P450.Plant Cell，2003，15：2900-2910)等。这些基因的突变或失活会影响赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)的生物合成和信号传导，造成不同程度的植株矮化。最近的研究表明，细胞分裂和细胞膨胀过程中的缺失造成的细胞大小和细胞数目变异也是造成植株矮化的重要因素。比如：DTH8/OsHAP腹合体主要就是通过调控茎节间的细胞延长来控制水稻株高的(Wei X等，DTH8 suppresses flowering in rice，influencing plant height and yield potentialsimultaneously.Plant Physiol，2010，153：1747-1758)；在osh15突变体中，茎节间的细胞数目减少导致植株变矮(Sato Y等，Loss-of-function mutations in the rice homeobox gene OSH15affect thearchitecture of internodes resulting in dwarf plants.EMBO J，1999，18：992-1002)；而在osapc6突变体中，茎节间的细胞大小和细胞数目都减少导致植株变矮(Kumar M等，A candidate gene OsAPC6ofanaphase-promoting complex of rice identified through T-DNA insertion.Funct Integr Genomics，2010，10：349-358)。这些基因的突变或失活会影响水稻的株高，造成不同程度的植株矮化。

植物花药的发育是一个多层次多步骤的过程，它包括花粉囊壁的发育、花粉母细胞的发育、小孢子的产生、花粉粒的成熟等过程，其中任何一个步骤发育不正常，都有可能影响整个植株的育性。花粉发育是一个非常复杂的过程，它涉及到许多基因，了解这些基因在其发育过程中所起的生理生化方面的功能，将对花粉的发育有更为清晰的认识，这将有很大的理论和实际应用价值。目前，通过对雄性不育突变体的研究，已在拟南芥、玉米、水稻等植物中克隆了一些影响雄蕊发育的基因。如玉米中的MSCA1基因调控花粉囊壁细胞的分裂和转化；拟南芥的NOZZLE基因参与调控性器官早期发育过程中的孢子形成；拟南芥的TPD1基因在花粉囊绒毡层细胞的分化过程中起重要作用；拟南芥的EMS1基因控制花粉囊中生殖细胞及其邻近体细胞的命运；水稻的Udt1基因是花粉囊绒毡层早期发育过程中的主要调节子(Chaubal R等，Thetransformation of anthers in the mscal mutant of maize.Planta，2003，216：778-788；SchiefthalerU等，Molecular analysis of NOZZLE，a gene involved in pattern formation and early sporogenesisduring sex organ development in Arabidopsis thaliana.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96：11664-11669；Yang S L等，TAPETUM DETERMINANT1 is required for cell specialization in theArabidopsis anther.Plant Cell，2003，15：2792-2804；Zhao D Z等，The excess microsporocyteslgene encodes a putative leucine-rich repeat receptor protein kinase that controls somatic andreproductive cell fates in the Arabidopsis anther.Genes Dev，2002，16：2021-2031；Plant Cell，2003，15：1281-1295；Plant Cell，2004，16：1008-1020；Jung K H等，Rice Undeveloped TapetumlIs a Major Regulator of Early Tapetum Development.Plant Cell，2005，17：2705-2722)。这些基因的突变或失活会影响花药的发育，造成植株雄性不育。

我国既是水稻生产大国，又是水稻消费大国，提高水稻产量和品质是水稻生产遗传改良的主要性状。20世纪60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育是水稻增产的两次革命，但近几年来水稻的增产幅度不显著。纵观水稻矮化育种，矮秆基因利用单一化现象严重，这是影响新育成品种产量潜力进一步提高的主要原因之一，因此发现和利用新的矮秆基因很重要。杂交育种是提高水稻产量的重要途径，杂交水稻技术的应用在提高水稻产量方面发挥了重要作用。雄性不育系为杂交育种提供了极大的便利和可能。利用雄性不育系进行杂交制种，既能节约劳力、财力，又保证杂交种的纯度，因此在雄性不育的基础上开展杂交优势的利用是水稻作物育种的主要方向之一。目前，获得雄性不育系材料主要有以下几种途径：寻找和利用自然界产生的雄性不育变异株；通过种间或种内杂交和连续多代回交的方法创造不育系；用人工诱变的方法创造不育系；用基因工程的方法创造不育系。因此，矮杆基因和雄性不育在水稻育种过程中发挥着重要作用。本发明通过筛选T-DNA突变体库，分离并克隆了控制水稻株高和花粉育性的基因，丰富了可供利用的基因资源，通过基因工程的方法创造矮杆植株和雄性不育系，对生产矮秆水稻和雄性不育水稻及其在水稻育种上的应用都有非常重要的意义。

WD40蛋白含有约40个氨基酸的保守序列。该序列以色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp，WD)结尾，因此称为WD40基序，而含有此种基序的蛋白称作MD40蛋白。WD40蛋白质中一般含有4-10个串联的WD40基序来形成功能结构(Neer等，The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins.Nature，1994，371：297-300)。WD40蛋白广泛存在于所有真核生物中，研究表明WD40蛋白具有广泛的生物化学和细胞生物学功能，如参与细胞分裂和胞质移动、细胞程序性死亡、光信号感受和传导、细胞运动、花发育、开花等过程(Smith等，The WD repeat：a common architecture for diverse functions.Trends BiochemSci，1999，24：181-185；van Nocker and Ludwig，The WD-repeat protein superfamily in Arabidopsis：conservation and divergence in structure and function.BMC Genomics，2003，4：50)。例如，拟南芥中的CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1(COP1)基因，该蛋白的N末端有一个卷曲的螺旋(coiled-coil)结构域，接着有一个锌指结构域，C末端有7个WD40重复单元，COP1是光形态建成和开花期的重要调控子(von Arnim等，Genetic and developmental control of nuclear accumulation of COP1，a repressor of photomorphogenesis in Arabidopsis.Plant Physiol，1997，114：779-788；Holm等，Two interacting bZIP proteins are direct targets of COP1-mediated control of light-dependentgene expression in Arabidopsis.Genes Dev，2002，16：1247-1259；Liu等，COP1-mediatedubiquitination of CONSTANS is implicated in cryptochrome regulation of flowering in Arabidopsis.Plant Cell，2008，20：292-306)。水稻中发现的Rice Immature Pollen 1(RIP1)基因，编码含有5个保守WD40基序的蛋白。研究发现RIP1在花药发育的晚期大量表达，该基因丧失功能突变体表现雄性不育(Han等，Rice Immature Pollen 1(RIP1)is a regulator of late pollen development.Plant CellPhysiol，2006，47：1457-1472)。本发明采用T-DNA标签的技术在水稻中分离获得OsLIS-L1基因，该基因编码一个类似于类型1的人类致无脑回畸形的基因编码蛋白(lissencephaly type-1-like homologymotif protein)，该蛋白在C末端含有9个WD40重复单元，突变体表型分析、基因表达分析和基因功能验证实验表明OsLIS-L1基因能调控水稻株高和花粉育性。

发明内容

本发明的目的采用T-DNA插入法分离克隆水稻功能基因技术，从水稻T-DNA随机插入突变体oslis-11中克隆的新的控制水稻株高和花粉育性基因OsLIS-L1及其编码蛋白，通过遗传转化方法将所述的基因OsLIS-L1转化到水稻植物体内，以调控水稻水稻株高和花粉育性。

所述的OsLIS-L1基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它编码的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：2所示。

本发明克隆的水稻OsLIS-L1基因的T-DNA插入失活突变体表现为半矮和育性低(见实施例1)，我们得到了OsLIS-L1基因的两个等位突变体体，分别表示为oslis-11-1和oslis-11-2，它们具有非常相似的突变表型，并且突变表型也与在OsLIS-L1基因内的T-DNA插入共分离(见实施例2)。通过观察野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间和不同时期花药的半薄切片，得到了株高变矮和低育性的细胞学证据。野生型的OsLIS-L1基因转化突变体oslis-11-2后植株恢复正常的表型(见实施例4)，此外，通过RNAi(RNA干涉)抑制该基因的表达得到和突变体相似的半矮和低育性表型(见实施例4)。OsLIS-L1基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达，但在茎和穗中表达量相对要高些(见实施例5)。

本发明克隆的OsLIS-L1基因是控制水稻株高和花粉育性的新基因，有利于理解水稻茎和花粉的发育过程；通过基因工程的方法创造矮秆水稻和水稻雄性不育系，开拓了矮杆基因和雄性不育的资源。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1.利用已有的水稻T-DNA插入突变体库(该水稻T-DNA插入突变体库的构建方法参见Wu等，Developmentof enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.Plant J，2003：418-427；Zhan等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchyas revealed by analyzing 13，804T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library.Plant J，2007：947-959)，表型筛选得到一个半矮和低育性的突变体(该突变体命名为oslis-11-1，其在水稻T-DNA插入突变体库中的原始编号为03Z11AI23)，突变体的筛选鉴定方法见实施例1第1部分中详细描述。

2.采用Tail-PCR方法(Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levelsof the genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804T-DNA flanking sequences from anenhancer-trap mutant library.Plant J，2007：947-959)分离oslis-11-1突变体的侧翼序列，通过序列分析显示T-DNA插入OsLIS-L1基因(LOC_Os08g06480，http://rice.plantbiology.msu.edu/)的第21个内含子中(实施例1第2部分)。

3.通过T-DNA插入与突变性状的共分离验证(按实施例1的第3部分T-DNA插入与突变表型的共分离检测执行)证明本发明获得的候选基因OsLIS-L1的突变表型与T-DNA插入共分离。

4.索取OsLIS-L1基因的韩国等位突变体oslis-11-2，通过表型分析及共分离检测进一步证明OsLIS-L1家系的突变表型与T-DNA插入共分离。(见实施例2)。

5.分析了野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间和不同时期花药的半薄切片，结果显示突变体变矮是由于茎第一节间细胞数目变少所致，而突变体的低育性是由于花粉败育导致的(见实施例3)。

6.基因功能互补实验和RNAi(RNA干涉)抑制实验(见实施例4)证明了本发明获得的候选基因OsLIS-L1的失活是引起oslis-11突变表型的原因，OsLIS-L1基因控制水稻的株高和花粉育性。

7.利用RT(Reverse transcription反转录)-PCR研究OsLIS-L1基因的表达模式，证明OsLIS-L1基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达，但在茎和穗中表达量相对要高些(见实施例5)。

更详细的技术发明细节将由下述实施例给出。

本发明的优点在于：

1.本基因的成功克隆进一步证实了采用T-DNA标签法克隆基因的可行性，而且该方法克隆基因速度快，效率高。

2.本发明提供了一个调控水稻株高和花粉育性的基因OsLIS-L1及其编码蛋白，有利于理解水稻茎和花粉的发育过程。

3.利用本基因构建的不同载体，通过基因工程的方法创造矮秆水稻和水稻雄性不育系，拓展了矮杆基因和雄性不育基因在水稻育种中的应用。

附图说明

SEQ ID NO：1是本发明克隆的OsLIS-L1基因的cDNA序列，序列全长为3402bp。

SEQ ID NO：2是OsLIS-L1基因编码的氨基酸序列，编码1133个氨基酸。

图1.水稻oslis-11-1突变体的表型。图中：图1A：左边野生型植株(WT)与右边oslis-11-1突变体抽穗期的表型，oslis-11-1突变体与野生型(WT)相比半矮。图1B：抽穗期的花粉用1％的I2-KI染色后，显微观察，左边为oslis-11-1突变体，大部分不着色，右边为野生型植株(WT)，花粉着色正常。

图2.OsLIS-L1基因与突变表型的共分离验证。图中：图2A：OsLIS-L1基因的结构和T-DNA插入位点分析。蓝色方框表示5’末端，浅蓝色方框表示3’末端，红色方框表示OsLIS-L1基因的外显子。L1，R1表示跨oslis-11-1家系T-DNA的两条基因组引物，NTLB5表示位于oslis-11-1家系T-DNA上的边界引物；L2，R2表示跨韩国等位突变体oslis-11-2家系T-DNA的两条基因组引物，iAPL1表示位于韩国等位突变体oslis-11-2家系T-DNA上的边界引物。图2B：T1代共分离实验胶图。植株基因型的确定：OsLIS-L1纯合T-DNA插入植株当L1和NTLB5配对时可以扩增出目标产物约0.7kb，由于T-DNA插入片段太大，L1与R1配对无扩增产物；野生型植株由于无T-DNA插入，故L1和NTLB5配对无扩增产物，但L1与R1配对扩增能得到目标产物约1kb；而OsLIS-L1杂合T-DNA插入转基因植株用L1和R1配对以及L1和NTLB5配对时都可以得到目的产物。植株表型：20个T1代单株中第8、9、10、20株为突变表型。由图可知突变植株的基因型均为OsLIS-L1纯合T-DNA插入，而正常植株的基因型为野生或杂合型，这一结果表明突变表型与OsLIS-L1基因内的T-DNA插入共分离。

图3.oslis-11-1等位突变体oslis-11-2的表型。图中：图3A：左为oslis-11-2突变体，右为野生型植株(WT)，突变体与野生型相比半矮。图3B：抽穗期的花粉用1％的I2-KI染色后，显微观察，左边为oslis-11-2突变体，花粉大部分不着色，右边为野生型植株(WT)，花粉着色正常。图3C：T1代共分离实验胶图。植株表型：20个T1代单株中第2、7、13、17株为突变表型。

图4.野生型和oslis-11-2突变体茎各节间长度统计和茎第一节间半薄切片观察。图中：图4A：野生型和oslis-11-2突变体在成熟期茎各节间长度显示。图片显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间长度差距明显，而其它茎节间长度差距不明显。从左自右分别为oslis-11-2突变体的第一、第二、第三、第四和第五茎节间，野生型的第一、第二、第三、第四和第五茎节间。图4B：野生型和oslis-11-2突变体在成熟期茎各节间长度统计结果。结果显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间长度差距明显，而其它茎节间长度差距不明显。图4C和图4D：野生型(C)和oslis-11-2突变体(D)茎第一节间半薄切片横切。结果显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间细胞层数无差别。图4E和图4F：野生型(E)和oslis-11-2突变体(F)茎第一节间半薄切片纵切。结果显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间细胞大小无差别。注：从穗往下为第一节间。

图5.野生型和oslis-11-2突变体不同时期花药的半薄切片观察。图中：(A)、(C)、(E)、(G)、(I)、(K)、(M)和(O)分别表示野生型花药在减数分裂早前期、小孢子母细胞时期、减数分裂时期、四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期、有丝分裂时期和成熟花粉期的花药横切片。(B)、(D)、(F)、(H)、(J)、(L)、(N)和(P)分别表示oslis-11-2突变体在减数分裂早前期、小孢子母细胞时期、减数分裂时期、四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期、有丝分裂时期和成熟花粉期的花药横切片。E，表皮细胞；En，药室内壁；ML，中层；T，绒毡层；Ms，小孢子母细胞；Tds，四分体；Msp，小孢子；MP，成熟花粉；SPC，第二层壁细胞；SC，造孢细胞。Bars＝50μm。

图6.本发明设计的功能互补载体pC2301-OsLIS-L1结构示意图。

图7.本发明设计的RNAi(RNA干涉)载体pDS-OsLIS-L1结构示意图。

图8.基因功能互补实验和RNAi(RNA干涉)抑制实验。图中：图8A：基因功能互补实验。左边为转基因阴性植株，表现为oslis-11-2突变表型，右边为转OsLIS-L1基因阳性恢复野生型表型的植株。图8B：RT-PCR检测了3株恢复正常表型(前3个)和1株阴性植株(最后1个)中OsLIS-L1基因的表达量，结果显示3株恢复正常表型的植株中OsLIS-L1基因的表达量也恢复到正常水平，而1株阴性植株中OsLIS-L1基因的表达量和突变体一样几乎检测不到。以GAPDH做为内标。图8C：RNAi(RNA干涉)抑制实验。左边为阳性植株，表现为突变表型，右边为阴性植株，表现为野生型。图8D：抽穗期的花粉用1％的I2-KI染色后，显微观察，左边为阳性植株，花粉大部分不着色，右边为阴性植株，花粉着色正常。

图9.RT(Reverse transcription反转录)-PCR分析OsLIS-L1基因的表达模式。抽穗期时OsLIS-L1基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达，但在茎和穗中表达量相对要高些。另外，该基因在突变体中的表达量几乎检测不到，表明T-DNA的插入严重影响了该基因的正常表达。以GAPDH做为内标。

具体实施方式

实施例1：OsLIS-L1基因的分离克隆

1.oslis-11-1突变体的获得

所用的水稻T-DNA插入突变体库由湖北省武汉市华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室利用载体pFX-E24.2-15R构建而成(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis ofthe rice genome.Plant J，2003，35：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertionsat various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804T-DNA flanking sequencesfrom an enhancer-trap mutant library.Plant J，2007，49：947-959)。2005年，从T0代突变体库(见http://rmd.ncpgr.cn/，Zhang等，RMD：a rice mutant database for functional analysis of the ricegenome.Nucl Acids Res，2006，34：D745-D748)挑选出3000份水稻转基因品种“中花11号(为中国农业科学院作物科学研究培育的常规水稻品种)”的种子，经浸种、催芽后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料种两行，每行10株，为一个家系。种植密度为5寸×8寸，种植地点为武汉华中农业大学的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。在水稻整个生育期田间记载突变体的表型，对于同一家系内突变植株的表型一致、符合典型的3∶1分离的家系并及时抽提DNA进行PCR阳性检测，对于一个家系内的所有突变体单株PCR均为阳性的家系作为后续研究的材料。

PCR阳性检测的引物位于T-DNA区段上，一对引物的序列分别是GV-F：5-GGCATCGGTAAACATCTG CT-3，GV-R：5-GCCTCAAGAAGCTCAAGTGC-3，PCR产物大小为611bp，反应体系的总体积为20μl，具体包含：DNA模板1μL；10倍体积的Taq酶反应缓冲液2μl；2mM dNTP 1.5μL；25mM镁离子1.2μL；10μM引物(GV-F+GV-R)0.2μL；0.3单位Taq酶，加双蒸水至20μL。反应程序为：94℃变性5分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃1分钟，共进行30个循环，72℃延伸5分钟。

通过实施例1得到一个突变体，该突变体从外观上看植株半矮和低育性如图1A所示，申请人将这个突变体命名为oslis-11-1。取抽穗期的花粉用1％的I2-KI染色后，显微观察如图1B所示，野生植株的花粉正常着色，且花粉粒呈正常的圆形，突变体的花粉染色结果，大部分都不着色，显示该突变体是雄性育性降低的突变体。至成熟时，考种发现突变体oslis-11-1结实率仅为11.3％，株高为野生型株高的56.0％。水稻oslis-11突变体和野生型考种结果见表1所示。

表1水稻oslis-11突变体和野生型考种结果

2.分离oslis-11-1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列

利用Tail-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)技术(Zhang等，Non-random distributionof T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library.Plant J，2007，49：947-959)我们分离了这个家系的侧翼序列。对侧翼序列数据在The Rice Genome Annotation Project网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上做BLAST分析显示该位点位于水稻第8染色体的LOC_Os08g06480上。根据预测T-DNA位于一个基因的内含子中，如图2A所示，该基因由25个外显子组成，含有3,402bp，该基因编码一个类似于类型1的人类致无脑回畸形的基因编码蛋白(lissencephalytype-l-like homology motif protein)，该蛋白在C末端含有9个WD40重复单元，申请人将这个基因命名为OsLIS-L1。

Tail-PCR方法分离得到的oslis-11-1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列如下：

caaaggcgaaacgtgcgtctctatatttgagcggccgcctcgttctaaaa

ggattctcctggatgatgtatgtgttttcaatgtagtcgactattctcca

catattgttggaaaggtttacctgtgcatcagctccttatttacaagcat

attcagtgactgcgaaattgtctgcccattgattttttttgaatgtgcgt

taagcttgcttttaacctatgccatatggttaagacagaaggaatcaatt

atcactgaaacaagctctcagctgtttaaattttaatcttcagttagttg

aaggtcactgagcatttctattgcacataagggtgagaggtgagagagaa

aatcatatttcttaaaacttattttacaaattttcacaagaatcggttca

atggggaaagagaaacgcacacacattttttggactatttaaatcattgc

ggggagacacaattaaaagaaatttcactcaccttcgtaaacacggacat

tataatttggaatggaagagtccttcatttcaaatgcaaatgatattatt

ggcctagagggtggaatgccaggaatgtcgcaccagtgggagtgccattg

aaagatctatggacctggaaaaaaatcaaaaattttaacggcaacaactt

tgaaataccacattttttctggaaaaggcactctatgaccttgcctttgg

gttaatacccatggtttcggcctacacaccggaaaagattcattaccttg

gatgctatcttggttgaaacaaggagactttgcccaccggtttccacatt

taaatagggattatttttgggcgaac

3.T-DNA插入与突变表型的共分离检测

为了证实oslis-11-1半矮和低育性的突变表型是由于OsLIS-L1基因内的T-DNA插入引起，本发明对20株T1代单株进行了T-DNA插入位点与突变表型的共分离检测。共分离检测的具体步骤为：(1)在oslis-11-1T-DNA插入位点两侧设计一对基因组引物L1：5-ATGTCCGTGTTGACGAGGTG-3；R1：5-AAAGCAGTGTAGGCATGTAGGG-3，在T-DNA上设计一条载体引物NTLB5：5-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3，如图2A所示。配对扩增验证T1代及T2代各单株的基因型，如图2B所示。并将基因型与表型对应，看是否符合共分离。其中：引物L1+R1的产物大小约为1kb，引物L1+NTLB5的产物大小约为0.7kb，由于T-DNA转入基因组的片段有10kb以上，所以当T-DNA插入L1与R1之间，且位点纯合时，则由于片段过大而不能扩增。因此，当一个单株分别用引物L1+R1及引物L1+NTLB5扩增后出现三种情况：L1+R1有目标带扩增，而L1+NTLB5则没有；L1+R1及L1+NTLB5都有目标带扩增；L1+R1没有目标带扩增，而L1+NTLB5则有目标带扩增。该三种情况分别对应三种基因型，即为野生型(W)，该位点没有T-DNA的插入；杂合型(H)；突变型(M)。(2)应用CTAB法(参照Liu等，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice andthe precise location of the S 5locus in the molecular map.TAG，1997，95：809-814)从20株T₁代单株中分别抽提总DNA作为模板，用引物(L1+R1及L1+NTLB5)进行PCR扩增。反应总体积为为20μL，具体包含：DNA模板1μL；10倍体积的Taq酶反应缓冲液2μl；2mM dNTP 1.5μL；25mM镁离子1.2μL；10μM引物(L1+R1及L1+NTLB5)0.2μL；0.3单位Taq酶，加双蒸水至20μL。反应程序为：94℃变性5分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃1分钟，共进行30个循环，72℃延伸5分钟。(3)将反应产物经琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶上的带型判定各个单株的基因型，如图2B所示。实验结果显示，20株T₁代单株中，其中属于野生型单株有：1、2、13、14、17、18；属于杂合型单株有3、4、5、6、7、11、12、15、16、19；属于突变型单株有8、9、10、20。突变体oslis-11-1家系T1代突变性状记录为8、9、10、20半矮低育性。T-DNA插入水稻基因组，造成内源基因的失活，往往在转化当代T0代看不到突变表型，而在T1中出现1∶2∶1的分离，其中约1/4的单株由于突变位点的纯合而可能表现出突变表型。由此可见，突变体oslis-11-1家系T1分离群体的半矮低育性的突变表型与基因型完全对应。

由于T1代家系单株较少，为进一步验证oslis-11-1家系的突变表型与基因型的对应关系，将T1代单株进行T2代共分离检测。在T2代中种植T1代的第1、2、13、14、17号野生基因型单株后代及第3、4、5、6、7号杂合基因型单株的后代，其中前者每株系种20株，后者每株系种40株，其他种植方式及表型观察同T1代。结果T2代的突变表型与T1代观测到的突变表型完全一致且与基于PCR检测的基因型完全对应也即是所有野生型单株后代都是野生型基因型，正常表型；所有杂合型单株的后代都有突变分离，且分离后的突变表型与基因型也完全对应。

由此可见，该家系的半矮和低育性的突变性状与T-DNA的插入纯合基因型共分离，证明OsLIS-L1基因的突变是造成植株突变表型的根本原因。

实施例2：oslis-11-1等位突变体的鉴定

本发明从韩国POSTECH大学的突变体库中索取了oslis-11-1的等位突变体oslis-11-2(购自韩国POSTECH大学)，种子编号为3A-04974，其中T-DNA插入位点为第13个外显子中(图2A)。2008年在武汉大田种植，我们发现oslis-11-2突变体具有与oslis-11-1非常相似的突变表型，即半矮和低育性(图3A和3B，表1)。一共种植20株，其中第2、7、13、17株具有突变表型。共分离检测所用的引物为L2：5-ATATGGGAAGTTGGCTCACG-3，R2：5-TTAGATCCACAACGCATTGC-3和载体引物iAPL1：5-ACGTCCGCAATGTGTTATTAAG-3。由图3C可知，oslis-11-2家系的突变表型与OsLIS-L1基因内的T-DNA插入是共分离的。这进一步表明oslis-11-2的突变表型也是由OsLIS-L1基因内的T-DNA插入突变引起。

实施例3：野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间和不同时期花药的半薄切片观察

为了进一步找到突变体半矮和低育性的细胞学证据，本发明首先对野生型和oslis-11-2突变体成熟时期茎的不同节间长度进行考察，发现除了第一节间(从穗往下为第一节间)长度有明显差距外，其它节间长度均无明显差距(图4A和4B，表2)。然后本发明采用半薄切片的方法来观察野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间和不同时期花药的细胞形态。

表2水稻野生型和oslis-11-2突变体茎不同节间长度的考种结果

取抽穗期时期茎的第一节间(从穗往下为第一节间)和不同发育时期的来源于野生型和oslis-11-2突变体的花药在50％FAA固定液(50％dH₂O，40％乙醇，10％醋酸)固定24小时(花药发育分为8个时期，详情参考Feng等，Pollen development and its stages in rice(Oryza sativa L.).Chinese J.Rice Sci，2001，15(1)：21-28)。固定后的材料在系列酒精中脱水(70％酒精、90％酒精、95％酒精、无水酒精各顺序放置30分钟)。脱水后的材料用包埋剂Technovit 7100树脂(购自德国Heraeus Kulzer公司)包埋(详细方法参考试剂说明书)，37℃放置3-5天后，包埋块作半薄切片(1微米)(切片机型号为LEICA EM UC6，方法参考仪器使用说明书)。材料用苯胺蓝染色(购自德国Merck公司)，显微镜观察，拍照(所用观察拍照系统为Leica DFC480Digital Camera system)。

茎第一节间半薄切片结果显示，野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间的细胞层数和大小均无明显差别(图4C-4F)，由此可见，目的基因OsLIS-L1的失活引起茎第一节间细胞数目的减少，导致株高变矮。

不同时期花药半薄切片结果显示，野生型和oslis-11-2突变体在花药的前5个时期没有明显差异(图5A-5J)，从花药发育的第6个时期开始到最后，野生型的花药产生正常的花粉(图5K、图5M和图50)。而oslis-11-2突变体花药中花粉粒的发育却开始出现不正常空泡状态，随后产生大量非常不正常的花粉粒，直至发育的最后时期，大量不正常的花粉瓦解并被释放出来，最终导致低育性(图5L、图5N和图5P)。由此可见，目的基因OsLIS-L1的失活产生大量不正常的花粉，导致的低育性表型出现。

实施例4：互补实验和RNAi(RNA干涉)实验验证OsLIS-L1基因功能

1.互补载体的构建

互补载体的构建方法如下：以pCAMBIA2301载体为骨架载体(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)。用NheI(购自Takara公司)酶切“日本晴”BAC克隆OSJNBa0023F18(美国亚利桑那大学Rod Wing教授惠赠。http://ag.arizona.edu/pls/faculty/wing.htm)，用透析袋电洗脱法(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年第二版，321-322页)回收包括整个OsLIS-L1基因编码区及起始密码前约1.4kb和终止密码后约3.2kb共约12.2kb。将回收的目标片段与XbaI(购自Takara公司)(NheI同尾酶)酶切的去磷酸化的的载体质粒pCAMBIA2301连接(所使用的内切酶、碱性磷酸酶均购自Takara公司，连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加800ul LB复苏45分钟，取250ul涂于含50mg/L的卡那霉素、20mg/L的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)及20mg/L的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考上述《分子克隆实验指南》)。挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过PCR筛选阳性克隆、酶切验证及测序验证后得到的目的克隆质粒命名为pC2301-OsLIS-L1(图6)。将构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)菌株中，将含有载体pC2301-OsLIS-L1的农杆菌菌株命名为EHA105-pC2301-OsLIS-L1。

2.RNAi(RNA干涉)载体的构建

根据预测的基因结构，在OsLIS-L1基因的3’末端上设计一对RNAi引物RNAi-L：5-CTGACTAGTGGTACCGTGGAAGTGTTTACCCCATG-3；RNAi-R：5-TCAGAGCTCGGATCCACCAACCACCACTAGCTCAG-3(下划线表示加的酶切位点)。从FL-cDNA克隆质粒(质粒编号AK111830，http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA，Maruyama and Sugano 1994.Oligo-capping：a simple methodto replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides.Gene，138：171-174；Suzuki等，1997Construction and characterization of a full length-enriched and a 5’-end-enrichedcDNA library.Gene，200：149-156)中扩增出该片段，并按照(Chu等，2006.Promoter mutations of anessential gene for pollen development result in disease resistance in rice.Genes Dev 20：1250-1255)描述的方法构建RNAi(RNA干涉)载体。PCR反应体系的总体积为20μl，具体包含：FL-cDNA质粒模板0.1ul(约50ng)、10倍体积的Taq酶反应缓冲液2μl；2mM dNTP 1.5μL；25mM镁离子1.2μL；10μM引物(RNAi-L+RNAi-R)0.2μL；0.3单位rTaq酶(购自Takara公司)，加双蒸水至20μL。反应程序为：94℃变性5分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃1分钟，共进行30个循环，72℃延伸5分钟。将构建好的载体命名为pDS-OsLIS-L1(图7)，将构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)菌株中，将含有载体pDS-OsLIS-L1的农杆菌菌株命名为EHA105-pDS-OsLIS-L1。

3.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.1994，Plant J，6：271-282)将互补菌株EHA105-pC2301-OsLIS-L1导入oslis-11-2突变体的愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有G418抗性的愈伤、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见申请人已经公开的专利，专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346)。按照相同的遗传转化方法将RNAi(RNA干涉)菌株EHA105-pDS-OsLIS-L1导入水稻粳稻品种“中花11号：的愈伤，不同的是用潮霉素筛选抗性愈伤。

本发明研究结果显示，将互补菌株EHA105-pC2301-OsLIS-L1导入oslis-11-2突变体的愈伤，共获得互补转化苗20株，其中2株为阴性，为突变表型；18株为阳性，其中15株恢复正常表型；如图8A所示。此外，申请人还检测了3株恢复正常表型(前3个)和1株阴性植株(最后1个)中OsLIS-L1基因的表达量，如图8B所示，结果显示3株恢复正常表型的植株中OsLIS-L1基因的表达量也恢复到正常水平，而1株阴性植株中OsLIS-L1基因的表达量和突变体一样几乎检测不到。以上结果表明半矮和低育性突变表型确实是由于OsLIS-L1基因突变而造成。为了检测互补后代的遗传稳定性，本发明选取15份恢复正常表型的T0代互补转基因植株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancer trap linesfor functional analysis of the rice genome.2003，Plant J，35：418-427)分析了这些互补转基因植株的拷贝数。结果显示，其中有3份互补转基因植株为单拷贝。大田种植单拷贝家系的T1代，其中恢复正常表型植株为转基因阳性植株，而未恢复正常表型的植株均为转基因阴性植株。这些研究结果直接证明了oslis-11突变体的突变表型确实是由于OsLIS-L1基因的突变而造成的。

另外，本发明研究结果显示，将RNAi(RNA干涉)菌株EHA105-pDS-OsLIS-L1导入水稻粳稻品种中花11号的愈伤，共获得互补转化苗41株，其中4株阴性，37株为阳性，其中12株表型为半矮和育性极低的突变表型，而阴性植株则表型正常，如图8C所示。此外，申请人还检测阳性植株抽穗期花粉通过1％的I2-KI染色后，显微观察发现阳性植株花粉粒几乎都不着色，而阴性植株花粉则碘染正常，如图8D所示。这些研究结果进一步表明oslis-11突变体的突变表型确实是由于OsLIS-L1基因的突变而造成的。

由此可见，通过RNAi技术抑制了OsLIS-L1基因的表达，造成了水稻植株株高和花粉育性的明显降低，进一步证明了OsLIS-L1基因为控制水稻株高和花粉育性的基因，并由此方法可以创建矮杆水稻和水稻的雄性不育系，用于实际水稻育种。

实施例5：RT-PCR初步验证OsLIS-L1基因的表达模式。

用半定量RT-PCR(Reverse-transcript PCR)的方法分析该基因的表达模式，RT-PCR所用引物RT-L1位于第21个外显子上，引物RT-R1位于第23个外显子上。引物RT-L1为：5-ATTGCTATTGGAATGGAGG-3；引物RT-R1为：5-GATTTGCTGGAGATTGGAT-3。其中RT-L1+RT-R1扩反转录产物的产物大小为220bp，RT-L1+RT-R1扩基因组的产物大小为680bp。样品取于抽穗期野生型和突变体的根、茎、叶、叶鞘、穗。RT-PCR反应程序为：94℃变性5分钟，94℃45秒、55℃45秒、72℃1分钟，共进行28个循环，72℃延伸5分钟。RT-PCR的检测结果如图9所示。由此可见，抽穗期时OsLIS-L1基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达，但在茎和穗中表达量相对要高些。该基因在突变体中的表达量几乎检测不到，表明T-DNA的插入严重影响了该基因的正常表达。

通过基因工程的方法创造矮杆植株和雄性不育系，对生产矮秆水稻和雄性不育水稻及其在水稻育种上的应用都有非常重要的意义。

通过植物基因工程技术可以将OsLIS-L1基因在水稻中特定组织部位、特定发育时期抑制表达，通过调控OsLIS-L1基因的时空表达模式和表达量人为控制水稻的株高和育性，创造新的矮杆水稻和雄性不育系，对生产矮秆水稻和雄性不育水稻及其在水稻育种上的应用都有非常重要的意义。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

室温下溶解并定容至1000ml。

3)Fe2EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D  100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA  100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)NM贮存液(1mg/ml)

NAA  100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA  100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS    0.392g

DMSO    10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT  100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlAS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值至6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度26±1℃。

农杆菌培养

(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5-7周。

生根

(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载大田。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应当认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.OsLIS-L1基因控制水稻株高和花粉育性的应用，其特征在于，所述的OsLIS-L1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

Images