CN103421820B - 一个控制水稻穗型基因pm1的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻穗形态建成的基因PM1的分离克隆、功能验证和应用。通过外施油菜素类固醇激素（BR）、PM1基因表达分析及构建互补载体遗传转化等实验证明本发明克隆的PM1基因具有调控水稻穗形态的功能。本发明克隆的PM1基因及其编码蛋白可应用于水稻穗型、粒型的遗传改良，具有重要的生产应用价值。

Description

一个控制水稻穗型基因PM1的克隆及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻穗形态建成的基因PMl（PanicleMorphogenesis1）的分离克隆、功能验证，同时涉及该基因在转基因水稻或转基因水稻种子中的应用。本发明克隆的PM1基因及其编码蛋白可应用于水稻穗型、粒型的遗传改良，具有重要的生产应用价值。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人以其为主食，在维护世界粮食安全上发挥着重要的作用。同时，由于水稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、丰富的种质资源、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的共线性，而被视做作物研究的模式植物。我国利用传统杂种优势和常规矮化育种对水稻产量提高做出了卓越的贡献。但随着我国及世界人口的迅速增长、耕地面积的逐年减少，粮食供需矛盾日益凸显。如何改良水稻品质、提高水稻产量是当前植物生物技术亟需解决的课题。水稻产量构成是：单位面积的株数×每株穗数×每穗实粒数×千粒重／1000，由此看来，稻穗的着粒密度、籽粒的形态对水稻产量的贡献极其重要。因此研究水稻穗的发育无论在发育生物学还是在育种上都具有重要的理论意义和实际应用价值。

水稻的稻穗属于无限花序的圆锥花序。小穗是水稻花序（穗）的基本单位。一个小穗包含一对退化的苞片(rudimentaryglumes)，两朵退化的小花即附颖(emptyglumes)和一朵完整的小花(floret)。一朵完整的小花由外向内包括以下结构：外稃、内稃、两片浆片、6枚雄蕊和1枚雌蕊(Komatsu等,FRIZZYPANICLEisrequiredtopreventtheformationofaxillarymeristemsandtoestablishfloralmeristemidentityinricespikelets.Development,2003,130:3841-3850;Chu等,TheFLORALORGANNUMBER4GeneEncodingaPutativeOrthologofArabidopsisCLAVATA3RegulatesApicalMeristemSizeinRice.PlantPhysiol,2006,142:1039-1052)。稻穗的发育始于水稻从营养生长向生殖生长的转换，主要涉及茎尖分生组织(SAM,shootapicalmeristem)和腋生分生组织（AM,axillarymeristem，发育成枝梗和侧生小穗）的发育和调控。水稻穗的发育大致可以分为四个步骤：(1)标志着SAM从营养生长向生殖生长转换的穗原基（第一苞原基）形成；(2)由第一苞原基分化出一次枝梗原基(primarybranchprimordia)；(3)一次枝梗原基分化出二次枝梗原基(secondarybranchprimordia)；(4)一次枝梗和二次枝梗原基上分化出小穗原基(spikletprimordial)，进而产生小穗(Komatsu等,LAXandSPAmajorregulatorsofshootbranchinginrice.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100:11765-11770;Wang等,Theplantarchitectureofrice(Oryzasativa).PlantMolBiol,2005,59:75-84)。

随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。而随着水稻功能基因组研究所取得的巨大进步，一些控制水稻穗形态的基因已经被克隆，极大地提高了研究者对水稻穗形态建成的遗传和分子调控的生物过程的理解。目前已分离克隆的控制水稻穗形态建成的基因有LAX，FZP，SPA,APO1,SP1,DEP1,FON1和FON4等（Komatsu等,TheLAX1andFRIZZYPANICLE2genesdeterminetheinflorescencearchitectureofricebycontrollingrachis-branchandspikeletdevelopment.DevBiol,2001,231:364-373;Komatsu等,FRIZZYPANICLEisrequiredtopreventtheformationofaxillarymeristemsandtoestablishfloralmeristemidentityinricespikelets.Development,2003,130:3841-3850;Komatsu等,LAXandSPA:majorregulatorsofshootbranchinginrice.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100:11765-11770;Ikeda等,RiceABERRANTPANICLEORGANIZATION1,encodinganF-boxprotein,regulatesmeristemfate.PlantJ，2007,51:1030-1040;Li等,Shortpanicle1encodesaputativePTRfamilytransporteranddeterminesricepaniclesize.PlantJ，2009,58:592-605;Huang等,NaturalvariationattheDEP1locusenhancesgrainyieldinrice.NatGenet,2009,41:494-497;Suzaki等,ThegeneFLORALORGANNUMBER1regulatesfloralmeristemsizeinriceandencodesaleucine-richrepeatreceptorkinaseorthologoustoArabidopsisCLAVATA1.Development,2004,131:5649-5657;Moon等,ThericeFON1genecontrolsvegetativeandreproductivedevelopmentbyregulatingshootapicalmeristemsize.MolCells,2006,21:147-152;Chu等,Thefloralorgannumber4geneencodingaputativeorthologofArabidopsisCLAVATA3regulatesapicalmeristemsizeinrice.PlantPhysiol,2006,142:1039-1052）。然而，有关水稻穗形态建成的基因、尤其是一次枝梗轮生相关的基因尚未见报道。本发明的PM1基因突变后，水稻一次枝梗表现出轮生的表型，为研究水稻穗形态建成提供了非常好的遗传材料，并可应用于水稻产量的遗传改良。

本发明的PM1基因突变后水稻的穗型呈现一次枝梗轮生、复粒（即簇生稻表型）及籽粒短圆。从发育生物学角度分析，水稻虽然每个小穗由3朵小花组成，但最后只有中间1朵小花发育成籽粒，其余2朵小花退化。水稻簇生穗的突变体，就是一次枝梗和二次枝梗顶端的小枝梗着生2~3朵花(Jodon,Inheritanceofsomeofthemorestrikingcharactersinrice.JHered.1957,48:181-192)。根据小穗簇生情况不同，将簇生稻分为5级。Ⅰ级簇生：一次枝梗顶端有3粒籽粒簇生，部分二次枝梗顶端有3粒籽粒簇生；Ⅱ级簇生：一次枝梗顶端全部2粒籽粒簇生；Ⅲ级簇生：一次枝梗顶端部分簇生2粒籽粒，部分无簇生；Ⅳ级簇生：一次枝梗顶端无簇生，二次枝梗顶端有2粒簇生；Ⅴ级簇生：所有一次枝梗、二次枝梗的顶端均无簇生（陈红旗等,水稻簇生穗突变体的鉴定及遗传.南京农业大学学报,2002,25:116-118）。相关研究表明：簇生稻基因Cl的功能与枝梗顶部的发育有关，该基因突变后使水稻枝梗顶端生长受阻，从而影响水稻的穂长。通过水稻穗部簇生状况的调查和遗传分析，将水稻簇生基因定位在第6染色体上（郑雷英等,水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析。科学通报,2003,48:264-267;张毅等,水稻小穗簇生性近等基因系的构建及其近等性评价。作物学报,2006,32:397-401;田翠等,水稻小穗簇生突变体的遗传分析及基因的初步定位。分子植物育种,2010,8:29-34）。但迄今为止，水稻簇生基因尚未有分离克隆的报道。而本发明分离克隆的PM1基因定位在第4染色体上，该基因突变后表现为簇生稻的表型，是一个新的控制水稻穗型的功能基因。本发明克隆的PM1基因及其编码蛋白可应用于水稻穗型、粒型的遗传改良，具有重要的生产应用价值。

发明内容

本发明的目的是采用图位克隆技术，利用一个穗型突变体与珍汕97配置F2分离群体，寻找与突变体表型共分离的分子标记，通过分离克隆候选基因PM1并将其转化到突变体植物内，证实PM1具有调控水稻穗型和粒型的功能。

申请人将本发明克隆的调控水稻穗型和粒型基因命名为PanicleMorphogenesis1基因（简称PM1基因），所克隆的基因的核苷酸酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，它编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示，PM1基因编码与BR合成相关的P450基因（CYP724B1）。

本发明克隆的水稻PM1基因的功能失活突变体成熟期表现为植株半矮、叶夹角变小、一次枝梗轮生、复粒稻、粒长变短、粒宽变宽等一系列突变表型（见实施例1），利用本室水稻突变体库总共得到了PM1基因的三个等位突变体，分别表示为pm1-1、pm1-2和pm1-3，它们具有非常相似的突变表型（见实施例1）。通过观察野生型和pm-1突变体幼穗发育各个时期的电镜扫描图片（见实施例4）和PM1基因的表达分析（见实施例2），得到了水稻穗复粒着生的证据。野生型的PM1基因转化突变体pm-1后植株恢复正常的表型（见实施例5），说明该突变表型是由PM1基因突变造成的。此外，由于PM1基因编码与BR合成相关的P450基因（CYP724B1），通过在黑暗条件下施加外源BRs实验（见实施例3），证明该突变体是BR缺失型突变体，进一步确定PM1基因通过控制BR的生物合成来调控水稻的穗型和粒型。

本发明克隆的PM基因是控制水稻一次枝梗轮生、复粒稻等穗形态建成的新基因。具体地说，本发明提供了一种改良水稻穗形态建成的方法，通过基因工程的方法可以创造复粒、粒型短圆的水稻，拓展了水稻复粒穗的资源。通过转基因技术、反义RNA或RNAi等技术调控水稻的穗形态，提高水稻的产量性状。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1.从水稻已有的T-DNA插入突变体库（突变体库的创建方法已经公开发表论文，见Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome，PlantJ（2003）：418-427；Zhang等，Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary，PlantJ（2007）：947-959）筛选鉴定出3个穗形态突变体，分别命名为pm1-1、pm1-2和pm1-3。这3个突变体在成熟期表现为植株半矮、叶夹角变小、一次枝梗轮生、复粒稻、粒型短圆等一系列突变表型，突变表型与T-DNA插入并不共分离，说明突变表型并不是T-DNA插入基因所导致的。具体见实施例1中详细描述。

2.利用突变体与珍汕97杂交构建F2代群体分离群体，突变表型的遗传分析表明，这3个突变体表型都受一对隐性基因控制（见实施例1）。

3.采用图位克隆方法进行基因定位，利用pm1-2和pm1-3两个遗传分离群体，突变体其目标区间定位在RM3866-1和RM17132之间的300kb左右；通过进一步开发分子标记将目标位点定位在标记RM3866-1和X4(InDel)的147kb之间（见实施例1第3部分）。

4.通过杂交实验进行突变体等位性分析表明：pm1-1、pm1-2和pm1-3是等位突变体（见实施例1第4部分）。

5.基因功能互补实验（见实施例5）证明了本发明获得的候选基因PM1的失活是引起pm1-1突突变表型的原因，PM1基因控制水稻的株高、穗型和粒型。

6.利用RT（Reversetranscription反转录）-PCR研究PM1基因的表达模式，及幼穗原位杂交进行PM1基因表达的组织细胞定位（见实施例2）。

7.利用幼穗的电镜扫描实验证明了pm1突变体幼穗发育过程中的突变表型（见实施例4）。

8.在黑暗条件下施加外源BRs实验，证明pm1突变体是一个BR的生物合成相关的突变体（见实施例3）。

本发明的优点在于：

1.水稻穗发育的分子机制尚不清楚，有关水稻穗一次枝梗轮生的基因尚未见报道。本发明克隆的PM1基因控制水稻的小穗复粒和穗一次枝梗轮生等穗的形态性状，通过基因工程手段利用PM1改良水稻的穗型将提高水稻的产量。

2.PM1基因突变体表现出典型的BR缺陷型性状，如植株变矮、叶夹角变小、粒长变短等表型，本项发明证明BR的合成与复粒稻及枝梗着生关系密切。

附图说明

序列表SEQIDNO：1是本发明克隆的PM1基因的核苷酸序列，序列长度为1443bp。

序列表SEQIDNO：2是本发明克隆的PM1基因对应的氨基酸序列，编码480个氨基酸。

图1．突变体的表型图。图1中，A：成熟期整株表型照片。从左到右依次为：野生型中花11号（ZH11）植株，pm1-1突变体的植株，pm1-2突变体的植株，pm1-3突变体的植株。图1的B-E：成熟期穗表型照片，依次为野生型ZH11穗，pm1-1突变体的穗，pm1-2突变体的穗，pm1-3突变体的穗。图1F：成熟期野生型与突变体pm1-1粒宽比较。图1G：成熟期野生型与突变体pm1-1粒长比较。

图2．采用集团混合池（BSA）法分析与目标性状连锁分子标记图。在图2中，A：分子标记RM7396，B：分子标记RM3367，C：分子标记RM252。样品编号1：珍汕97（ZS97）；2：野生型中花11号（ZH11）；3：pm1-1野生池；4：pm1-1突变池；5：pm1-2野生池；6：pm1-2突变池；7：pm1-3野生池；8：pm1-3突变池。结果显示，pm1-1和pm1-3的突变表型与RM7396、RM3367和RM252都连锁，而pm-2的突变表型只与标记RM3367和RM252连锁。

图3．PM1基因定位图。在图3中，A：通过280株F₂分离小群体将基因定位在第4染色体长臂的RM7396和RM3839之间。B：通过F₂分离小群体中的79株突变单株将基因定位在RM17079和RM3839之间。C：通过F₂分离大群体中的1037株突变单株将基因定位在RM3866-1和X4之间的147kb。

图4．预测候选基因的分析。在图4中，A：P450基因区段所设计引物的相对位置。B：pm1-1、pm1-2和pm1-3突变体对P450基因的基因型分析。结果显示，pm1-1突变体在p450-10与p450-4引物之间都扩增不出目标片段，而pm1-2和pm1-3与野生型相比并无差异，说明pm-1突变体在这个区间存在大片段缺失。

图5．突变体等位性分析。在图5中，A：成熟期突变体双杂交材料F₁代植株表型照片（左图为野生型对照）。B：成熟期突变体双杂交材料F₁代植株穗表型照片（左图为野生型对照）。结果显示，F₁代植株表现为突变型，证明突变体pm1-2和pm1-3与突变体pm1-1是等位突变体。C：突变体双杂交材料F₁代植株基因型检测，PCR扩增样品1：ddH₂O，2：ZH11(WT)，3：pm1-1，4-7：pm1-2∕pm1-1的F₁代植株，8-10：pm1-2∕pm1-1的F₁代植株。结果显示，pm1-2∕pm1-1的F₁代植株前两株是真杂交种，pm1-2∕pm1-1的F₁代植株的3株都是真杂交种。

图6．RT（Reversetranscription反转录）-PCR分析PM1基因的表达模式。图中显示：孕穗期时PM1基因在根、茎、叶和穗中都有不同程度的表达，但在穗中表达量相对要高很多，而在叶鞘中几乎没有表达。另外该基因在pm1-1突变体中的表达量几乎检测不到，表明pm-1突变体中该基因的大片段缺失严重影响了该基因的正常表达。以GAPDH做为内标。

图7．组织原位杂交实验。在图7中，A-C：为野生型幼穗，其中图7A是正义链探针的杂交图（对照），B、图7C是反义链探针的杂交图。D-F是pm1-1突变体材料，其中D是正义链探针的杂交图，E、F是反义链探针的杂交图。由B-C和E-F杂交结果说明PM1在野生型的幼穗有表达，突变体中检测不到其表达。Bar=100μm。

图8．暗条件下幼苗对油菜素类固醇激素（BR）的反应分析。在黑暗条件下施加不同浓度外源BR植株的表型图，1-3是野生型植株，4-6是pm-1突变体植株，依次的浓度梯度是CK、10^-7M和10^-6M，图中红色箭头标示的是中胚轴的位置，白色箭头标示的是胚芽鞘的长度。

图9.油菜素类固醇激素（BR）处理中胚轴的出现率的折线图，图中显示随着外源BR施加浓度的增大，突变体的中胚轴出现率得到了一定程度的恢复。

图10.油菜素类固醇激素（BR）处理胚芽鞘长度柱状图，图中显示随着外源BR施加浓度的增大，突变体的中胚轴出现率得到了一定程度的恢复，在10^-6M时突变体的胚芽鞘几乎也野生型一样长。

图11．幼穗发育电镜扫描图。在图11中，A-E：野生型材料。F-G：pm1-1突变体材料。A、F：穗原基形成期图片，Bar=50μm。B、G：一次枝梗原基形成期图片，Bar=50μm。C、H：二次枝梗原基形成期图片，Bar=100μm。D、I：小穗原基以及花原基形成期图片，Bar=200μm。E、J：D、I中红色方框区的放大图片，Bar=200μm。

图12.互补实验所用pCAMBIA2301载体图。

图13.M1基因互补遗传实验图。在图13中，A：EHA105-pC2301-PM-25N18转基因互补植株表型（左）和突变体对照植株表型（右）。B：空载体pC2301转化植株仍然为pm1突变体表型。

具体实施方式

实施例1:PM1基因的分离克隆

1、pm1突变体的获得

本发明所鉴定的突变体来自水稻T-DNA插入突变体（该水稻T-DNA插入突变体库的构建方法参见Wu等,Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ，2003,35:418-427;Zhan等,Non-randomdistributionofT-DNAinsertionsatvariouslevelsofthegenomehierarchyasrevealedbyanalyzing13,804T-DNAflankingsequencesfromanenhancer-trapmutantlibrary.PlantJ，2007,49:947-959）。突变体的筛选鉴定方法是：从上述水稻T-DNA插入突变体库（见http://rmd.ncpgr.cn/）中将T0代转基因水稻种子，经过常规的浸种、催芽程序后种植于大田后得到每个T₁代家系共20棵植株，植株按5寸×8寸的间距种植于武汉华中农业大学的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。通过表型筛选获得3个成熟期表现为植株半矮、叶夹角变小、一次枝梗轮生、复粒稻（每个小枝梗上着生1-3颗谷粒）、粒长变短、粒宽变宽等一系列突变表型的突变体，申请人把这3个突变体命名为PanicleMorphogenesis1（简称pm1）（3个突变体分别命名为pm1-1、pm1-2和pm1-3）。这些突变体已经收集在水稻突变体库中，突变表型如图1所示。前期研究结果表明它们的突变表型与T-DNA插入无关。

2、PM1基因定位群体的构建及遗传分析

以纯合突变体(pm1-1、pm1-2和pm1-3)为父本，籼稻品种珍汕97(OryzasativaL.ssp.indicacv.zhenshan97)为母本，分别配置F₁杂交种，并由F₁自交收获F₂代种子作为遗传定位群体。2007、2008年种植F₂代，突变体性状的分离均符合单个隐性基因控制的分离比（3:1）。2009年初在温室每个杂交组合F₂代种植40株，其中pm1-3群体种植80株，用于遗传分析和做Bulk池用于BSA法初步定位基因（在F₂代群体中随机取8株突变表型单株的DNA样等量混合成突变体池，再随机取8株野生型单株的DNA样等量混合成野生池）。2009年夏季在武汉种植3个组合的F₂代大群体，pm1-1群体共4884株，pm1-2群体共710株，pm1-3共群体2900株，用于基因定位。在pm1-1的F₂大群体中随机取280株用于小群体初定位。田间种植情况，每行10株，密度16.5cm×26.4cm。3个组合的F₁代植株都表现出野生型性状，F₂代小群体材料经过卡方检测，野生型表型与突变体表型之比符合孟德尔3:1的分离比率（表1），说明这3个突变体的突变表型都是由单基因控制的隐性突变体。

表1PM1基因F₂群体的遗传分析

3、PM1基因定位

在全基因组均匀设计SSR标记，筛亲本多态性（ZH11和ZS97）。应用CTAB法（参照Liu等,Agenome-wideanalysisofwidecompatibilityinriceandthepreciselocationoftheS5locusinthemolecularmap.TAG,1997,95:809-814）抽提水稻基因组总DNA。SSR标记分析方法为：PCR反应体系采用20μL体系：模板1μL，10×PCR（含Mg离子）缓冲液2μL，2mMdNTP1.5μL，10μM引物0.3μL，10U/μLTaq酶（Takara公司）0.2μL。PCR反应程序：94℃变性，5min；94℃，45s，57℃，45s，72℃，1min，30个循环；72℃延伸，7min；25℃保存。PCR产物在4%的聚丙烯酰胺变性胶上分离后按银染标准程序处理观察。在两亲本中共筛选了549对SSR标记，其中有254对SSR标记在亲本中存在多态性，这些SSR标记来源于网站http://www.gramene.org/。

通过BSA法，用两亲本中存在多态性的254对SSR标记分析这3个突变体的Bulk池，pm1-1、pm1-2和pm1-3配置的群体中筛选到的与突变性状连锁的标记是在第4染色体长臂上的RM7396、RM3367和RM252。实验结果见图2所示。

利用随机小群体（F₂代280个单株，其中突变体79株，野生型201株，χ²=1.38＜χ² _0.05=3.84，χ²检测符合3:1的分离比）进行验证BSA法筛到的连锁标记并进行基因定位。结果表明pm1-1的突变表型与BAS法筛到的3对SSR标记真正的连锁。在3个连锁标记之间通过Gramene数据库搜索了均匀分布的10对SSR标记，其中4对SSR标记在亲本中存在多态性。将这些多态性标记分析280株的小群体样，通过STATISTICA5.5软件进行标记基因型和表型分析，将目标区段定位在RM7396和RM3839两标记的4129Kb之间（物理图距是由分子标记引物序列在网站http://redb.ncpgr.cn/上公布的2009年日本晴序列BLAST而来），目标区段更靠近标记RM3839（图3A）。

采用同样方法在RM7396和RM3839之间再均匀搜索20对SSR标记，其中有7对标记在亲本中存在多态性。将这7对标记分析pm1-1配置的群体中的79株突变单株样品，结果将目标位点定位在标记RM17097与RM3839的1049kb之间（图3B）。

用小群体初定位的RM17097与RM3839两对标记分析pm1-1配置的所有F₂大群体的突变单株样（F₂大群体共4884株，其中突变体1037株，野生型3638株，未抽穗的209株，χ²=19.65＞χ² _0.05=3.84，χ²检测其比例偏离了孟德尔的理论分离比例（3:1），突变体的数目偏少。推测这种情况的出现可能是由于还有一部分没有抽穗，调查结果不准确。另外，pm1-1突变体的出芽率比野生型低，推测携带该基因的种子的出芽率低，这可能也是突变株比例偏低的原因之一）。其中标记RM17097检测到73个重组交换单株，RM3839检测到57个重组交换单株。将Gramene数据库搜索到的两标记之间已有的21对SSR标记和自己设计的7对SSR标记、7对InDel(Insert/Deletion)标记、4对CAPS(cleavedamplifiedpolymorphicsequence)标记筛亲本多态性，其中有7对标记（RM17108、RM3866-1、X4、RM17121、RM17132、RM17140和RM17143）在亲本中存在多态性。将这7对标记进行重组交换单株分析，将目标位点定位在标记RM3866-1和X4(InDel)的147kb之间（图3C）。

本发明新设计的SSR，InDel和CAPS标记，是根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上公布的水稻籼稻品种93-11(OryzasativaL.ssp.indicacv.93-11)和粳稻品种日本晴(OryzasativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare)在该区段的基因组序列和BLAST工具，进行序列比对，利用PrimerPremier5软件设计引物，新设计的标记信息见表2。InDel和CAPS标记的PCR反应体系和反应程序与SSR标记一致，InDel标记PCR产物在4%的聚丙烯酰胺变性胶上分离后按银染标准程序处理观察。CAPS标记的PCR产物的酶切采用10μl反应体系：5μlPCR产物，0.5μl限制性内切酶（购自日本Takara公司），其它成份参照Takara公司提供的试剂说明书进行，37℃酶切3h左右后取5μl酶切产物在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离，溴化乙锭（EB）染色后在紫外透射仪下观测。

表2PM1基因定位中新开发的标记

注：标记产物的大小是根据Nipponbare的序列确定的，不同品种中可能会有所变化。

由pm1-1群体的定位结果，将标记RM3866-1和RM17132用于pm1-2和pm1-3的连锁位点验证。其中pm1-2采用F₂大群体的94个突变单株用于验证，标记RM3866-1筛到1个重组交换单株，标记RM17132筛到2个重组交换单株；pm1-3采用F₂大群体的305个突变单株用于验证，标记RM3866-1筛到13个重组交换单株，标记RM17132筛到14个重组交换单株。结果表明pm1-2和pm1-3的突变表型性状与标记RM3866-1和RM17132紧密连锁，其目标区间应该在RM3866-1和RM17132之间的300kb左右。

4、候选基因预测及pm1-1、pm1-2和pm1-3突变体的等位性分析

根据TIGR数据库中提供的基因注释信息，在47kb定位区间内注释有21个候选基因。根据http://crep.ncpgr.cn/上提供的基因表达谱和TIGR数据库中提供的基因注释信息，初步预测候选基因可能是一个编码细胞色素P450基因（LOC_Os04g39430）。

在P450基因共设计15对引物（p450-1、p450-2、p450-3、p450-4、p450-5、p450-6、p450-7、p450-8、p450-9、p450-10、p450-11、p450-12、p450-13、p450-14和p450-15），其中有10对引物（p450-1、p450-2、p450-3、p450-4、p450-8、p450-9、p450-10、p450-13、p450-14和p450-15）在野生型ZH11的DNA样中能扩出清晰的目标片段，并且这10对引物覆盖包括P450基因全基因组序列及其前后2kb左右的9.6kb左右的片段（这10对引物的相对位置如图4A所示，其引物信息如表3所示）。以pm1-1、pm1-2和pm1-3的突变体DNA样品为模版，利用这10对引物的进行突变体与野生型之间的比较PCR扩增。以ddH₂O为阴性对照，ZH11野生型为阳性对照，结果表明pm1-1突变体在p450-10与p450-4引物之间区域都扩增不出目标片段，说明pm1-1突变体在这个区间可能存在大片段缺失，而pm1-2和pm1-3与野生型相比并无差异，结果如图4B所示。

表3p450基因区段引物序列

注：产物的大小是根据水稻品种日本晴基因组序列确定的，不同品种之间可能会有差异。

根据基因预测结果，2010年夏在大田以pm1-1突变体为母本，pm1-2和pm1-3突变体为父本进行杂交，构建双突变体F₁材料。2010年冬季在温室种植F₁代植株，通过突变体对P450基因的基因型分析结果，可以用p450-2和p450-8两对引物进行F₁植株杂合型检测，鉴定真杂交种（如图5C），再通过F₁代真杂合的植株的表型观察结果显示，真杂合的F₁代植株仍表现为pm1的突变表型（如图5A、B），结果证明突变体pm1-2和pm1-3与突变体pm1-1是等位突变体。

实施例2:PM1基因表达分析

用半定量RT-PCR（Reverse-transcriptPCR）的方法分析该基因的表达模式。设计RT-PCR引物RT-P2覆盖该基因第4-9外显子。引物序列是：P2-F5-GATATCAAGCACTGTGAAGGGT-3，P2-R5-CGGGGATGATTTGATGAACT-3，以反转录产物为模版扩增产物大小为773bp，以基因组DNA为模版扩增的产物大小为2430bp。取孕穗期野生型和pm1-1突变体的根、茎、叶、叶鞘、穗（1cm、6cm、8cm、11cm、14cm）抽提RNA制备反转录产物，以GAPDH做为内标。RT-PCR反应程序为：94℃变性，5min；94℃，45s，60℃，45s，72℃，45s，30个循环；72℃延伸，7min；25℃保存，其中引物P2反应体系是用2×GCbufferⅠ10μL代替10×buffer2μL其他成份不变，RT-PCR的检测结果如图6所示。由此可见，孕穗期时PM1基因在根、茎、叶和穗中都有不同程度的表达，但在穗中表达量相对要高很多，而在叶鞘中几乎没有表达。另外该基因在pm1-1突变体中的表达量几乎检测不到，表明pm1-1突变体中该基因的大片段缺失破坏了该基因的正常表达。

RT-PCR结果显示PM1基因在穗中表达量高，为进一步验证这个结果，我们又进行了原位杂交实验。通过对野生型和pm1-1突变体幼穗取材做组织原位杂交，分析该基因在幼穗中的表达。采用引物P4（P4-F为：5-CCGGTCACTGCCATGATACTT-3，P4-R为：5-GAGCCTTCCTGTGGACAAACT-3）扩增包含该基因cDNA的第4、5、6外显子在内的约480bp的目标片段作为原位杂交探针，扩增的目标片段连于pGEM-T载体上（pGEM-T载体购自于Promega公司，具体用法、用量及步骤参考该产品的说明书），用于原位杂交的正义与反义杂交探针制备，所用的5，端外切酶是NcoⅠ和SalⅠ（所使用的外切酶购自Takara公司，具体用法与用量参考该产品的说明书），探针碱水解为长度约80-90bp的片段。把幼穗材料固定在50%FAA里24小时以上，系列酒精脱水，伊红染色过夜，近一步梯度酒精脱水及二甲苯透明和梯度石蜡侵蜡后，纯石蜡包埋3-4天后切片（切片机为YidiYD-1508A轮转式切片机），切片厚度8μm，然后用地高辛标记的探针与之杂交。杂交后的切片在显微镜下观察，相机拍照（所用观察拍照系统为LeicaDFC480DigitalCamerasystem）。原位杂交所用试剂及具体步骤见后面附录1，原位杂交结果如图7所示，正义探针在野生型和pm-1突变体中都没有表达，反义探针在野生型的幼穗有表达，在幼叶中有微量表达，而在pm1-1突变体中几乎没有表达。原位杂交实验结果也进一步验证了该基因在幼穗中呈现特异的表达模式，该基因突变后导致穗型的的变异。

实施例3:pm1突变体材料对油菜素类固醇激素（brassinosteroid,BR）反应的生理分析

由实施例1和实施例2所预测的基因是一个细胞色素p450基因，前人研究表明一些P450酶在植物油菜素类固醇激素（BR）的合成与钝化中发挥重要作用。BRs是一类类固醇结构的激素物质，其生物合成途径有两条：一条是早期C6氧化途径，一条是后期C6氧化途径。在植物细胞中这两种合成途径一般都是存在的。研究表明：早期C6氧化途径的中间产物对促进黑暗中生长的下胚轴伸长非常有效，后期C6氧化途径中的中间产物在挽救光下突变体的表现型上比早期C6途径的中间产物有效。说明在不同光下，BR的合成和代谢可能是不同的：在黑暗中主要是早期C6氧化途径起作用，在光条件下主要是后期C6氧化途径起作用（Fujioka等,Brassinosteroids.NatProdRep,1997,14:1-10;Choe等,TheDWF4geneofArabidopsisencodesacytochromeP450thatmediatesmultiple22alpha-hydroxylationstepsinbrassinosteroidbiosynthesis.PlantCell,1998,10:231-243）。BR和光信号还可以在信号传递过程中相互作用，研究表明光信号可以调控BR的合成途径，BR的信号转导参与调节不同光照条件下的向性反应。在黑暗条件下水稻正常植株中胚轴和胚芽鞘会生长，而BR缺失或不敏感突变体的中胚轴和胚芽鞘生长就受到了抑制。

为了进一步确定pm1突变体是由预测的细胞色素p450基因的缺失造成的，就要证明该突变体与BR有关。通过在黑暗条件下施加外源BR来观察野生型和突变体的反应，进一步确定pm1突变体是BR缺失突变体还是BR不敏感型突变体。实验方案如下：设置3个处理（CK、BR-10^-7M和BR-10^-6M），每个处理野生型（ZH11）和突变体（pm1-1）各种植45粒种子（在生根管中进行，每个生根管放3粒种子），黑暗条件下28°生长10天左右。ZH11和pm1-1每个处理各随机取30株幼苗测量其胚芽鞘长度，并观察每个处理ZH11和pm1-1的中胚轴的出现率。BR（2-4-Epibrassinollde）由武汉鼎国生物技术有限公司生产。实验结果显示，随着施加外源BR的浓度逐渐增加，pm1-1突变体胚芽鞘长度和中胚轴的出现率都得到了恢复，在10^-6M时突变体的胚芽鞘几乎和野生型一样长，pm1-1突变体在施加外源BR物质时表型能得到恢复（图8；图9；图10），从而证明pm1-1突变体是BR缺失突变体，证实编码细胞色素P450基因LOC_Os04g39430参与植物油菜素类固醇激素（BR）的合成。

实施例4：pm1突变体幼穗发育的细胞学考察。

取pm1-1突变体与野生型植株穗发育不同阶段的幼穗（穗原基形成期、一次枝梗原基形成期、二次枝梗原基形成期、小穗原基以及花原基形成期），在显微镜下用解剖针将幼穗组织剥出来迅速浸泡在2.5％戊二醛固定24小时（放入0-4℃冰箱中）。扫描电镜样品制备根据前人描述的方法制备(Mou等,Deficiencyinfattyacidsynthaseleadstoprematurecelldeathanddramaticalterationsinplantmorphology.PlantCell,2000,12:405-418)。然后经过脱水、中间液代换、临界点干燥、粘样、喷金等步骤，再用扫描电镜观察(S570,Hitachi,Tokyo,Japan华中农业大学电镜室，按照扫描电镜说明书操作，为常规方法)。电镜观察结果显示，pm1突变体与野生型在穗原基形成期、一次枝梗原基形成期以及二次枝梗原基形成期都没有差异，只有在小穗原基以及花原基形成期有差异，在这一时期突变体明显有复粒表型（图11）。这一结果在发育生物学角度证实PM1基因突变后水稻籽粒呈复粒表型。

实施例5：互补实验验证PM1基因功能。

1．互补载体的构建

互补载体的构建方法如下：以pCAMBIA2301载体（图12）为骨架载体（购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html）。用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切“中花11号”BAC克隆a0025N18（BAC号由华中农业大学罗美中教授提供），再用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）回收包括整个PM基因编码区及起始密码前约1.6kb和终止密码后约0.8kb共约6.2kb的目标片段。将回收的目标片段分别与用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切的载体质粒pCAMBIA2301连接（所使用的内切酶均购自Takara公司，连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书）。连接产物通过电转化的方法（电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书）导入大肠杆菌DH10B（购自Promega公司）中，加800μlLB，37℃摇床复苏45分钟，取全部菌液涂于含50mg/L的卡那霉素、20mg/L的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）及20mg/L的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16小时（LA与LB配方参考上述《分子克隆实验指南》）。挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过PCR筛选阳性克隆、酶切验证及测序验证后得到的目的克隆质粒命名为pC2301-PM-25N18。将构建好的载体和空载体pC2301电转入农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105（购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html）菌株中，将含有载体pC2301-PM-25N18的农杆菌菌株命名为EHA105-pC2301-PM-25N18。

2．遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法（Hiei等,Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.1994,PlantJ，6:271-282）将互补菌株EHA105-pC2301-PM-25N18和空载体菌株pC2301导入pm1-1突变体的愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有G418抗性的愈伤、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株（农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见申请人已经公开的专利，专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346）。农杆菌农杆菌介导的遗传转化试剂及配方和方法步骤见附录2。

本发明研究结果显示，将EHA105-pC2301-PM-25N18导入pm1突变体基因型背景的愈伤最后获得T0代（转化当代）互补转基因阳性植株17株，其中12株转基因植株表型恢复野生型穗形态（图13A）。此外，pC2301空载体导入pm1突变体基因型背景的愈伤得到28份对照转基因植株，这28份对照材料仍然保持pm1突变体的穗型（图13B）。遗传互补结果证明PM1是控制水稻穗型和粒型的功能基因，通过遗传操作的手段表达PM1可以改良水稻的穗型、粒型。

附录1：本发明所涉及到的原位杂交所用试剂及配方和方法步骤如下：

（1）所用试剂及溶液配方

1）切片﹑杂交用试剂

二甲苯，氯仿，无水酒精，DEPC水，系列酒精（15%，30%，50%，60%，70%，85%，95%）

2)探针制备用试剂

①酚:（Tris饱和酚pH7.8，下层溶液才是酚），氯仿，无水乙醇，3M醋酸钠（pH4.8）

②200mMEDTA(DEPC-treatedandautoclaved)（进口试剂）

③4MLiCl(DEPC-treatedandautoclaved)（进口试剂）

④200mMNa2CO3(DEPC-treated)PH=11.4（进口试剂）

⑤200mMNaHCO3(DEPC-treated)PH=8.2（进口试剂）

200mMNa2CO3MW=106

配置：Na2CO30.0318g加水到1.5ml现配，不能灭菌。（用分析天平称量）

200mMNaHCO3MW=84

配置：NaHCO30.0252g加水到1.5ml现配，不能灭菌。（用分析天平称量）

4MLiClMW=42.39

配置：LiCl0.2544g加水到1.5ml现配，不能灭菌。（用分析天平称量）

200mMEDTA可用0.5MEDTA稀释，0.5MEDTA配方见后面。

⑥探针转录用聚合酶(T7,T3,SP6)，地高辛标记的dNTP，RNase抑制剂

3)杂交用试剂母液

所有试剂均为进口试剂配制

⑴Tris-Cl

①1MpH7.5500ml

Tris碱60.55g

浓HCl32ml±

调节pH值到7.5

加DEPCH2O到500ml

②1MpH8.0350ml

Tris碱42.385g

浓HCl13ml±

调节pH值到8.0

加DEPCH2O到350ml

③1MpH9.5300ml

Tris碱36.33g

浓HCl1ml±

调节pH值到9.5

加DEPCH2O到300ml

应使溶液冷至室温后，方可最后调定pH值。加水定容到1L，分装后高压蒸汽灭菌。

(2)0.5MEDTAPH=81L

EDTA186.12g

NaOH20g±

用800ml蒸馏水溶解186.12gEDTA，加NaOH调pH值至所需值。待溶液冷至室温后，方可最后调定pH值。加水定容到1L。分装后高压蒸汽灭菌。常温保存

(3)2mg/ml甘氨酸（Glycine）

Glycine1g

DEPCH2O500ml

高压蒸汽灭菌。常温保存

（2）组织固定和包埋

本发明使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。

固定液配方（50%FAA）

无水乙醇100%50ml（50%final）

冰乙酸100%5ml（5%final）

甲醛37%10ml（3.7%final）

DEPC水35ml

固定液配方（70%FAA）

无水乙醇100%70ml（70%final）

冰乙酸100%5ml（5%final）

甲醛37%10ml（3.7%final）

DEPC水15ml

根据固定材料不同选用不同浓度的FAA。一般固定幼嫩的材料选用50%的FAA，如小花、分生组织等；其他比较老的材料选用70%的FAA。

第一天：组织固定

将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶（小瓶预先在180℃烘过）置于冰上，取新鲜材料投入，

冰上真空抽气。缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉底即可，以达到快速彻底固定。换新鲜固定液，4℃过夜。

第二天：脱水

以下系列酒精均用DEPC水稀释无水酒精配制。

Solutiontimenumberofchanges

50%ethanol60minutesone

60%ethanol60minutesone

70%ethanol60minutesone

85%ethanol60minutesone

95%ethanol+伊红（0.1%）overnightone

以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。（*组织可在70%ethanol4℃可存放几个月）

第三天：进一步脱水﹑透明和包埋

以下所有步骤在室温进行并置小摇床上轻摇

Solutiontimenumberofchanges

100%ethanol30minutestwo

100%ethanol60minutestwo

25%二甲苯,75%ethanol60minutesone

50%二甲苯,50%ethanol60minutesone

75%二甲苯,25%ethanol60minutesone

100%二甲苯60minutestwo

100%二甲苯+约1/4volumeParaplastPlus

(paraffin)chipsovemight(不要摇动)

第四天：继续包埋

将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加约1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。

第五天：继续包埋

换蜡两次

第六天：继续包埋

换蜡两次

第七天：继续包埋

换蜡两次

第八天：固定组织于蜡块中

此步对得到理想的组织切片有很大影响，详细步骤和注意事项参见石蜡切片protocol。最后包有材料的蜡块置4℃保存。

包埋所用的熔蜡，温度不能太高，一般控制在70-80度左右，否则容易烫伤材料，造成材料变形，同时包埋时动作要快，一次操作的材料要少，以免来不及包埋，每个小盒（选用底面光滑的纸）的材料摆放整齐、稀松，便于修蜡块。

（3）切片与展片

1）玻片的处理

载玻片用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，蒸馏水冲洗，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、150℃或以上烘5-6小时。盖玻片处理同载玻片处理至95%酒精浸泡保存，不烘（盖玻片小，不易清洗，烘过后会留痕迹）。烘好的载玻片，每张加8ul多聚赖氨酸（进口）用另一张玻片错开来回涂匀，放置于37℃烘箱烘约12h,常温保存待用。

2）切片

切片厚度一般为8μm左右。切片时可以先切12μm，便于成蜡带，等到切到材料时，再调到8μm。

3）展片

将新的载玻片置于预热至42℃的烤片机上，加200ulDEPC-H2O覆盖均匀。用平头镊子将切出的蜡带漂浮在DEPCH2O上，2-3min待蜡带展平后用面巾纸尽量吸走多余的水。（注意多余的水会在烤片过程中产生气泡，严重影响杂交信号）在烤片过程中可快速镜检，寻找理想切片，可节约切片劳动量及载玻片。最后保持玻片在42℃烤片机上过夜使切片粘牢。

（4）探针合成

1）探针线性化

注意选择5’突出末端的内切酶(Avoidtheuseofenzymesthatgenerate3ˊoverhangs-theycanactaspromotersforthepolymerases)酶切质粒（质粒为含有目标基因部分CDS的T载体或含全长mRNA的载体）。

要求质粒终浓度为1ug/ul，加入合适的内切酶及缓冲液（200ul酶切体系），在合适的温度下保温（如37℃，2小时），电泳检查是否酶切完全。酶切后可以加入等体积的水（200ul），这样可以减少后面抽提时的损失。（注：此时应该以混合后体积作为1倍体积）酶切后，加入等体积的酚（Tris饱和的酚pH7.8，下层溶液才是酚）（200ul）:氯仿（200ul）(先加酚，振荡，再加氯仿，振荡)抽提，12000rpm/min，5min，取上清夜到EP管中。再加入等体积的氯仿（400ul）抽提，12000rpm/min，5min，取上清夜到EP管中。再重复一次氯仿抽提，取上清。在上述水相中加入3M的醋酸钠（中和磷酸基团，有助于沉淀DNA），使终浓度达到0.3M（由最所得的上清液的体积决定）。约1分半后再加入2倍冰预冷的无水乙醇，置冰上1小时（推荐是-20℃过夜）。样品取出，冷冻离心，12000rpm/min，10min。弃上清，加入400ul70％乙醇，颠倒混匀后再冷冻离心，12000rpm/min，10min。把残液吸尽后，干燥后加水，使质粒线性化后浓度为1ug/ul，-20℃保存。

2）转录探针

①转录加样：

按顺序加样：

模板(1ug/ul)1ul

DEPCH2O12.5ul

10×Transcriptionbuffer2ul

10×DIGRNAlabelingmix2ul

(40U/ul)HPRI0.5ul

RNAPolymerose(20U/ul)2ul

总体积20ul

注：模板总量为1ug

②转录温度：37度；转录时间>2小时，一般2.5小时。

③转录完成后，取0.5ul，保存于-70℃,用于检测。

④剩余的加入2.5ulDNaseI(invitrogen公司)1U/ul,37℃，25min。

⑤DNaseI消化后，加入1ul0.5MpH8.0EDTA终止反应。取0.5ul置另一管，保存于-70℃,用于检测。

⑥加入2.5ulLicl(4M)+75ul无水乙醇，混匀-20℃，3hrs。

⑦冷冻离心12000rpm/min20min0℃。

⑧弃上清，加入80％乙醇150ul,12000rpm/min10min0℃

⑨重复一次。

⑩100%乙醇12000rpm/min20min0℃，吸干，超净台吹10min。加入DEPC水50ul。

2）碱水解

探针水解时间计算公式

T=(L0-Lf)/(K×L0×Lf)

K=0.11Kb/min，L0=探针初始长度（kb），Lf＝探针终长度（kb）

水解步骤：

①加100mMNaHCO320ul,再加入100mMNa2CO330ul混匀，离心，60℃。水浴探针水解时间。

②水浴后加5ul冰乙酸，再加入10ul3MNaAc,混匀，加2倍体积预冷的无水乙醇混匀。

－20℃>2hrs

③冷冻离心12000rpm/min20min0℃

④弃上清，加入80％乙醇150ul,12000rpm/min10min0℃

⑤100%乙醇12000rpm/min10min0℃，吸干，超净台吹10min

⑥溶于20ulDEPC水。取2ul置于另一管，检测水解大小。

⑦测浓度，-70℃保存

（5）原位杂交

第一天

1）预热ProteinaseKsolution(37℃)

ProteinaseKsolution(100ml)配制：

10ml1MTris(pH7.5)

10ml0.5MEDTA

80mlDEPCH2O

2）脱蜡

100%二甲苯两次，每次5min，100%二甲苯+100%乙醇，3－5min；100%乙醇两次。每次3－5min，95%，85%，70%，50%，30%，15%乙醇各2min；DEPCH2O两次，每次2min。

3）蛋白酶K处理

预热蛋白酶Ｋ溶液，37℃。加入蛋白酶Ｋ11.1ul,使其终浓度为1ug/ml。已配的蛋白酶Ｋ储存液浓度为10ug/ul.37℃，放置40min。用1×PBS洗一遍，放入2mg/ml甘氨酸溶液中2min。用1×PBS再洗一遍。

4）脱水

DEPCH2O两次，每次1min；酒精梯度脱水15%，30%，50%，70%，85%，95%乙醇各约2min，100%乙醇两次，每次3－5min，超净台上吹干1小时。（剪枪头，配预杂交液，剪parafilm）

5）预杂交

剪10个1ml枪头，用于吸取50%硫酸葡聚糖，Triton-X-100，剪parafilm

1ml10×Hybridizationsalts配制：

100ul1MTris(pH7.5)

20ul0.5MEDTA

600ul5MNaCl

280ulDEPCH2O

配预杂交液10ml(现配，不能产生气泡，否则重配)

1.85mlDEPCH2O

5ml甲酰胺

1ml10×Hybridizationsalts

1ml50%硫酸葡聚糖

1ml10×Blockingsolution(3)（黄色的液体:用前要摇匀）

0.15ml10mgmltRNA

预杂交：

取150ul预杂交液加于玻片上，盖上parafilm。42℃预杂交3小时。把玻片放在已比处理好的离心管盒上，盒下放些DEPCH2O用于保湿。不需要放很多。

6）杂交

在预杂交液中加入探针，就为杂交液。一般探针用量400ng/ml。每张玻片所需杂交液为150ul。42℃杂交过夜。操作同预杂交。

第二天

1）2×SSPE洗三次

第一次在烧杯中，使盖上的parafilm漂浮起来。

第二次，第三次在42℃恒温箱中进行，15min/次。

2）0.2×SSPE洗二次

57℃水浴50转/min30min/次

配制1×Blockingbuffer(200ml)

20ml10×Blockingsolution(3)（黄色的液体：用前要摇匀）

18ml10×Maleicacidbuffer(2)

162mlDEPCH2O

3）1×Blockingbuffer23℃(室温)50转/min40min

配制BSAwashingbuffer(500ml)

5gBSA

1.5mlTriton-X-100(油状，用剪口的枪头吸)

50ml1MTris(pH7.5)

15ml5MNaCl

433mlDEPCH2O

定容为500ml。

4）免疫反应

Anti-Digoxigenin-AP稀释，按体积比1：2500，即Anti-Digoxigenin-AP（16ul）：BSAwashingbuffer(80ml)＝1：2500，用Anti-Digoxigenin-AP时需要离心12000rpm/min5min,取上清。（原因：抗体中含有甘油，离心使甘油沉到底部。）

23℃(室温)50转/min2hrs

5）Antibodywashing

1×Blockingbuffer23℃(室温)50转/min15min

BSAwashingbuffer23℃(室温)50转/min15min洗3次。

6）1×PBS4℃放在铝盒中过夜。

如果基因表达丰度很低，显色反应可过夜，则第6步可不做，直接做下一步。

第三天

1）TNM-50buffer洗3次，每次5min，手摇动。

配制TNM-50buffer（500ml):

50ml1MTris(pH9.5)

10ml5MNaCl

25ml1MMgCl2

415mlDEPCH2O

2）显色反应

显色剂就在暗室配：80mlTNM-50buffer，1mlNBT/BCIPstocksolution

避光室温显色，显色时间依基因表达丰度不同，时间1小时至几天不等。由于后续脱水固定过程中要损失一定的颜色，故在不影响观察信号特异性前提下，宜显色时间长点。

3）TE洗2次，每次5min，手摇动。

4）脱水

DEPCH2O两次，每次1min；酒精梯度脱水，15%，30%，50%，70%，85%，95%，100%，100%乙醇每次1min，100%二甲苯+100%乙醇3－5min，100%二甲苯两次，每次5min。

5）封片，37℃烤片2－3天观察。

附录2：本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

（1）试剂和溶液缩写

6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthaleneaceticacid，萘乙酸）；IAA（Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸）；2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH（CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白）；HN（HygromycinB，潮霉素）；DMSO（DimethylSulfoxide，二甲基亚砜）；N6max（N6大量成分溶液）；N6min（N6小量成分溶液）；MSmax（MS大量成分溶液）；MSmin（MS小量成分溶液）

（2）主要溶液配方

1）N6max母液[10倍浓缩液（10X）]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2）N6min母液[100倍浓缩液（100X）]

室温下溶解并定容至1000ml。

3）Fe₂EDTA贮存液（100X）

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁（FeSO₄·7H₂O）2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H₂O）3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4）维生素贮存液（100X）

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5）MSmax母液(10X)

室温下溶解并定容至1000ml。

6）MSmin母液(100X)

室温下溶解并定容至1000ml。

7）2,4-D贮存液（1mg/ml）

2,4-D100mg.

1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8）6-BA贮存液（1mg/ml）

6-BA100mg.

1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9）NAA贮存液（1mg/ml）

NAA100mg.

1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10）IAA贮存液（1mg/ml）

IAA100mg.

1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11）葡萄糖贮存液（0.5g/ml）

葡萄糖125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12）AS贮存液

AS0.392g

DMSO10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13）1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14）KT贮存液（1mg/ml)

KT100mg.

1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

（3）培养基配方

1）诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶（25ml/瓶），封口灭菌。

2）继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶（25ml/瓶），封口灭菌。

3）预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlAS贮存液，分装倒入培养皿中（25ml/皿）。

4）共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlAS贮存液，分装倒入培养皿中（25ml/皿）。

5）悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlAS贮存液。

6）选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值至6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl50mg/ml的G-418（Sulfate）和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中（25ml/皿）。

7）预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl50mg/ml的G-418（Sulfate）和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中（25ml/皿）。

8）分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶（50ml/瓶），封口灭菌。

9）生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中（25ml/管），封口灭菌。

10）LA培养基（LB培养基不含琼脂粉）

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

（4）农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

（1）将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0.15%氯化汞（HgCl₂）15分钟；

（2）灭菌水洗种子4-5次；

（3）将种子放在诱导培养基上；

（4）置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度26±1℃。

农杆菌培养

（1）在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

（2）将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

农杆菌侵染

（1）将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

（2）调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

（3）将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

（4）转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

愈伤洗涤和选择培养

（1）灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

（2）浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

（3）转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

（4）转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。（第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm）

分化

（1）将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

（2）转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5-7周。

生根

（1）拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

（2）然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载大田。

Claims (1)

1.PM1基因在调控水稻品种“中花11号”一次枝梗轮生、小穗复粒表型中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。