CN103760000A

CN103760000A - 一种油棕叶片扫描电镜样品制备方法

Info

Publication number: CN103760000A
Application number: CN201410037752.5A
Authority: CN
Inventors: 曹红星; 冯美利; 刘勇; 郑雪芳; 雷新涛
Original assignee: Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2014-01-26
Filing date: 2014-01-26
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明涉及一种油棕叶片扫描电镜样品制备方法，是取油棕叶片切取小段样品，洗净，用FAA固定液固定，然后用不同的乙醇溶液进行梯度脱水，接着将样品进行冷冻干燥后进行修剪，顺序依次贴在导电胶布上，镀金膜得到扫描电镜样品。本发明操作步骤简便，制备的扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察时图像立体感强、叶片表面结构清晰完整，成本低，有利于开展油棕超微结构的观察和研究，对于获得优良种质资源类型，培育或筛选适合我国栽培的种质资源类型或品种具有重要的意义。

Description

一种油棕叶片扫描电镜样品制备方法

技术领域

本发明属于显微观察样品技术领域，涉及一种扫描电镜样品的制备方法，具体是一种油棕叶片扫描电镜样品制备方法。

背景技术

油棕（Elaeis guineensis Jacq.）属棕榈科的单子叶多年生木本油料作物，是世界上生产效率最高的产油植物，平均每公顷年产油量高达4.27t，是花生的5～6倍、大豆的9～10倍，有“世界油王”之称。油棕作为一种新兴的、潜力巨大的热带优良，将在食用油的供给方面发挥重要的作用，开发利用前景广阔。现今我国的油棕品种都是从国外引进的，对其在我国的适应性难以确定，需要经过长期的引种试种观察，才能确定能否在我国生产上应用，因此，开展油棕种质资源鉴定评价，对种质资源的创新利用至关重要。叶片解剖结构鉴定常作为评价植物适应性强弱的重要手段。

目前在油棕叶片解剖结构方面的研究主要通过石蜡切片的方法制成薄片，用于对其解剖结构的显微观察，但是通过石蜡切片制作的薄片仅能观察叶片的基本结构，而对油棕叶片表面的气孔分布状况、气孔的大小、叶片表面的纹路、表皮细胞垂周壁的样式等超微结构的观察和区别尚不能通过石蜡切片获得，不能够为种质资源的鉴定提供更为直接可靠、直接和稳定的证据，不利于油棕种质资源的鉴定和分类工作的开展。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种油棕叶片扫描电镜样品制备方法，通过脱水、干燥、镀膜等工艺，制备的扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察时叶片表面结构清晰完整，图像立体感强，有利于开展油棕超微结构的观察和研究，对于获得优良种质资源类型，培育或筛选适合我国栽培的种质资源类型或品种具有重要的意义。

本发明所采用的技术方案：

一种油棕叶片扫描电镜样品制备方法，其步骤如下：

1、固定液配制：取酒精、冰醋酸、甲醛按标准方法配制获得FAA固定液。

2、材料前处理：取油棕叶片，洗净擦干后迅速用刀片切取叶片中部、中脉两侧1cm×1cm的小段样品，洗净，再用FAA固定液固定，4℃保存24h，取出用纯水漂洗后，用于下一步的脱水。

3、脱水：分别用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液进行梯度脱水，各20min。

4、干燥：将样品进行冷冻干燥36小时后，放入干燥器内待用。

5、样品台准备：在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，把干燥好的样品修剪出4mm×3mm的平整小段，顺序依次贴在导电胶布上。

6、样品镀膜：将干燥好的样品用离子溅射镀膜仪电流15mA喷金200s，在样品表面均匀镀上一层厚度为l0～50nm的金膜，得到扫描电镜样品，可在扫描电子显微镜下观察。

所述冷冻干燥的温度在-45℃以下。

把制得的扫描电镜样品，用S—3000N（HITACHI）扫描电镜进行观察，图像模式为SE，束流38nA，工作距调到13mm，样品台倾斜度为0，亮度对比度为自动加手动，焦距为手动。加速电压为12KV，放大倍数为100-3000倍。观察到的叶片表面结构清晰，完整，立体感强，在低倍下能看到规律的气孔排列状况，高倍下可以看到表皮细胞的纹路和气孔的形态。

本发明操作步骤简便，制备的扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察时图像立体感强、叶片表面结构清晰完整，成本低，有利于开展油棕超微结构的观察和研究，对于获得优良种质资源类型，培育或筛选适合我国栽培的种质资源类型或品种具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明所提供的扫描电镜样品图像（200X）。

图2是本发明所提供的扫描电镜样品图像（500X）。

图3是本发明所提供的扫描电镜样品图像（2000X）。

图4是本发明所提供的扫描电镜样品图像（3000X）。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、固定液配制：以70%酒精90ml+冰醋酸5ml+甲醛5ml的体积比获得FAA固定液。

2、材料前处理：取2年生油棕幼苗自顶端的第三片叶，洗净擦干后迅速用刀片切成切取叶片中部、中脉两侧约1cm×1cm的小段，放入2ml的离心管，先用纯水冲洗3次，再用FAA固定液固定，4℃保存24h，取出用纯水漂洗后，用于下一步的脱水。（由于干燥后的叶片不容易区分上下表皮，为了观察时的统一，故采取一种直角梯形的方式进行区分，把叶片上表皮朝上的剪一个直角梯形，在叶片镀膜前修片的那一步，让直角梯形的锐角朝前，直角在右边，朝上的为上表皮，朝下的为下表皮）

3、脱水：分别用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液进行梯度脱水，各20min。脱水时严格控制脱水时间，抽取液体时的顺序和速度要一致。

4、干燥：将样品放入Labconco Freezone2.5L冷冻干燥机内干燥，待冻干机里面各项参数稳定后（运行参数在压力0.310mbar～0.370mbar，温度-45～-50℃），把离心管打开放入玻璃瓶内接在干燥机上面。干燥约36小时后，放入干燥器内待用。

5、样品台准备：在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，修剪出平整的约4mm×3mm的小段样品，顺序依次贴在导电胶布上。

6、样品镀膜：将干燥好的样品台用离子溅射镀膜仪电流15mA喷金200s，在样品表面均匀镀上一层厚度为50nm的金膜，完成镀金的样品可在扫描电子显微镜下观察。

7、样品观察：把制得的扫描电镜样品，用S—3000N（HITACHI）扫描电镜进行观察，图像模式为SE，束流38nA，工作距调到13mm，样品台倾斜度为0，亮度对比度为自动加手动，焦距为手动。加速电压为12KV，放大为100-3000倍。拍照时，先放大进行对焦，清晰后，在缩放后拍低倍数的照片能够尽大可能照出清晰的图像。结果如附图，叶片表面结构清晰，完整，立体感强，在低倍下能看到规律的气孔排列状况，高倍下可以看到表皮细胞的纹路和气孔的形态。

实验结果：图1和图2显示了油棕叶片表面的气孔分布状况，通过图2可以近似地求出油棕气孔的大小。图3显示了看似平面的植物叶片在显微镜结构下其实是粗糙不平的，展示了表面的纹路。图4显示了单个气孔的扫描电镜结构。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种油棕叶片扫描电镜样品制备方法，其特征在于，其步骤如下：

1）、固定液配制：取酒精、冰醋酸、甲醛按标准方法配制获得FAA固定液；

2）、材料前处理：取油棕叶片，洗净擦干后迅速用刀片切取叶片中部、中脉两侧1cm×1cm的小段样品，洗净，再用FAA固定液固定，4℃保存24h，取出用纯水漂洗后，用于下一步的脱水；

3）、脱水：分别用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液进行梯度脱水，各20min；

4）、干燥：将样品进行冷冻干燥36小时后，放入干燥器内待用。

5）、样品台准备：在金属样品台上贴好镀碳导电胶布，把干燥好的样品修剪出4mm×3mm的平整小段，顺序依次贴在导电胶布上；

6）、样品镀膜：将干燥好的样品用离子溅射镀膜仪电流15mA喷金200s，在样品表面均匀镀上一层厚度为l0～50nm的金膜，得到扫描电镜样品。

2.根据权利要求1所述的油棕叶片扫描电镜样品制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥的温度在-45℃以下。