CN105241698A - 一种黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法。由样品固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片与展片、染色与封片五个步骤组成，在样品固定后，经流水冲洗1.5-2.5h后再进行脱水处理；从脱水与包埋时间缩短至12.5h，本发明的制作方法用流水冲洗处理既方便又节约成本，且脱水至包埋时间比常规时间短，花较少的时间完整地切除黄石爬鮡皮肤组织，避免了皮肤组织易碎的缺点，有利于大规模进行石蜡切片制作及对黄石爬鮡皮肤组织结构的研究。

Description

一种黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法。

背景技术

黄石爬鮡(EuchiloglaniskishinouyeiKimu-ra)，属鲇形目(Siluriformes)、鮡科(Sisoridae)、石爬鮡属(EuchiloglanisRegan)，主要分布于长江流域的岷江水系和金沙江水系，海拔1800-3600m处，是高山峡谷，陡坡急流及枯洪流量的环境中生活的小型底栖淡水鱼类(诸新洛等1999，唐文家等2011)，并且是鰋鮡鱼类除原鮡外，最为原始的种类，因其生态分布的特殊性，是研究鱼类进化及系统分类学重要材料。由于酷捕，黄石爬鮡的天然资源量急剧减少，已处于濒危状态，亟待采取有效措施加以保护(郭宪光等2004，汪摇松等2004)。

为研究黄石爬鮡皮肤的基本结构及其粘液细胞在鱼体皮肤里的分布情况，为探讨外界环境对鱼体生理机能的影响提供一些直观的参考，需要对黄石爬鮡皮肤作石蜡切片。但由于黄石爬鮡皮肤真皮层中富含有脂肪，制作石蜡切片时经常出现破碎、挤压或切片不完整的现象，且传统石蜡切片的制作时间长，染色效果不理想，为了解决这一问题就需要对常规的石蜡切片制作方法进行改进。

中国专利(CN103257055A)公开的一种三角帆蚌外套膜组织切片的制备方法，组织酒精梯度脱水时省去了95％酒精的梯度，浸蜡时间也减少，大大缩短了传统的制作切片的时间，但此方法对于富含有脂肪的黄石爬鮡皮肤真皮层石蜡切片的制作没有作用，且省去95％酒精梯度对皮肤脱水不彻底，造成组织破碎，真皮层与表皮层脱离等问题，导致黄石爬鮡皮肤组织切片的失败。因此，如何调整脱水和浸蜡时间，是亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是黄石爬鮡皮肤真皮层中富含有脂肪，制作石蜡切片时经常出现破碎、挤压或切片不完整的现象，且传统皮肤切片的制作时间长，染色效果不理想。

为解决上述问题，本发明经过一系列的实验：包括方法的筛选、条件的优化及重复实验，建立了一整套的适用于黄石爬鮡皮肤切片的材料固定、处理和组织切片方法，包括样品固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片与展片、染色与封片五个步骤，且在样品固定后，经流水冲洗1.5-2.5h后再进行脱水处理；脱水与透明、浸蜡与包埋的总时间，即从组织脱水到组织包埋只需要12.5h。

进一步的，所述样品固定步骤为将黄石爬鮡皮肤取下后，用生理盐水清洗后，将皮肤修成1cm×0.5cm×0.5cm大小的组织，投入波恩氏液中固定。所述波恩氏液的配方为：苦味酸饱和水溶液75ml，福尔马林(40％甲醛液)25ml，冰醋酸5ml。

进一步的,所述脱水与透明步骤为用梯度乙醇脱水：先后采用浓度为70％的乙醇处理2-12h、80％的乙醇处理1.8-2.2h、90％的乙醇处理70-80min、第一次95％的乙醇处理40-50min、第二次95％的乙醇处理0.8-1.2h、第一次100％的乙醇处理25-35min、第二次100％的乙醇处理25-35min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯透明预处理25-30min、再用二甲苯处理2次，每次10-20min，使之透明。

优选为先后采用浓度为70％的乙醇处理2h、80％的乙醇处理2h、90％的乙醇处理75min、第一次95％的乙醇处理45min、第二次95％的乙醇处理1h、第一次100％的乙醇处理30min、第二次100％的乙醇处理30min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯透明预处理30min、再用二甲苯处理2次，每次15min使之透明。

进一步的，所述浸蜡与包埋步骤为用体积比为1:1的二甲苯：石蜡进行浸蜡预处理25-35min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次85-95min；最后将组织样品用纸盒进行包埋。

优选为所述浸蜡与包埋步骤为用体积比为1:1的二甲苯：石蜡浸蜡预处理30min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次90min，最后将组织样品用纸盒进行包埋。

进一步的，所述切片与展片步骤为用切片机切片，切片厚度控制在5μm-7μm，经35℃-38℃水浴锅中进行展片，用涂有蛋白甘油的载玻片捞片后，在35℃-38℃的烘箱中进行烘片。

进一步的，所述染色与封片步骤中染色采用H.E染色方法。具体步骤如下：先用第一次二甲苯处理10-15min、第二次二甲苯处理10-13min、再用体积比为1:1的二甲苯：无水乙醇处理2min、第一次100％的乙醇处理2min、第二次100％的乙醇处理2min、第一次95％的乙醇处理2min、第二次95％的乙醇处理2min、80％的乙醇处理2min、70％的乙醇处理2min、苏木精染色20min、自来水冲洗3min、1％盐酸酒精溶液处理5s、水洗后氨水处理15s、再水洗、70％的乙醇处理3min、80％的乙醇处理3min、90％的乙醇处理3min、伊红染色30s、95％的乙醇处理4min、第一次100％的乙醇处理4min、第二次100％的乙醇处理4min、用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯处理5min、第一次二甲苯处理5min、第二次二甲苯处理5min使之透明，然后用中性树胶封片。

所述的蛋白甘油优选为体积比1:1的用纱布过滤的蛋清：甘油。

所述的苏木精染液配方为：Hansen氏苏木素液

甲液：1g苏木素，10ml无水酒精；乙液：20g硫酸铝钾(钾明矾)，200ml蒸馏水；丙液：1g高锰酸钾，16ml蒸馏水；

先将甲液加热溶解，然后将乙液加热溶解，将甲、乙两液混合。再将丙液溶解后缓缓滴入，待全部混合后，再次煮沸一分钟，冷却后过滤，即可使用。

所述的伊红染液优选为1％的伊红染液，0.5-lg伊红(醇溶)用99ml浓度为95％的乙醇溶解。

本发明的有益效果是：

(1)常规传统的石蜡切片的制作，从脱水到包埋需要经过20-35h，由于皮肤结构的特殊性，皮肤内脂肪含量较高，传统皮肤脱水时间和浸蜡时间都会在此基础上适当的延长以获得较好的制片效果；本发明针对了黄石爬鮡皮肤较薄，无鳞的特性进行调整，将脱水与透明、浸蜡与包埋的总时间缩短至12.5h，制得清晰完整切片，组织和细胞相对固定，便于观察。

(2)本发明在样品固定后，经流水冲洗后再进行脱水处理，比较用PBS或50％酒精冲洗更加节省成本，利于后期大量制作切片，增大了制作黄石爬鮡皮肤的成功率。

(3)为制作黄石爬鮡皮肤的石蜡切片提供一种可行高效的制作方法，有利于大规模进行后期的皮肤粘液细胞染色等其他免疫组化方法处理对黄石爬鮡皮肤组织结构的研究。

附图说明

图1是本发明实施例1得到的黄石爬鮡皮肤组织图；

图2是本发明实施例1得到的黄石爬鮡皮肤组织放大图；

图3是本发明对比实施例1得到的黄石爬鮡皮肤组织图Ⅰ；

图4是本发明对比实施例1得到的黄石爬鮡皮肤组织图Ⅱ。

具体实施方式

为使本发明实施的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1、材料固定与预处理

将黄石爬鮡皮肤取下后，用生理盐水清洗，将皮肤修成1cm×0.5cm×0.5cm大的组织，投入波恩氏液中固定至少24h后，用流水冲洗2h后，保存在70％乙醇中2h。

2、石蜡组织切片的制作与观察

(1)脱水与透明程序：80％乙醇处理2h、90％乙醇处理75min、第一次95％乙醇处理45min、第二次95％乙醇处理1h、第一次100％乙醇处理30min、第二次100％乙醇处理30min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理30min、再用第一次二甲苯处理15min、第二次二甲苯处理15min使之透明；

(2)浸蜡与包埋：用体积比为1:1的二甲苯：纯石蜡预处理30min、再第一次纯石蜡透蜡90min、第二次纯石蜡透蜡90min，将组织样品用小纸盒进行包埋；

(3)切片与展片：用切片机切片，切片厚度控制在6μm，经37℃水浴锅中展片，用涂有蛋白甘油的载玻片捞片后，在37℃的烘箱中进行烘片；

(4)染色、封片与观察：染色采用H.E染色方法，具体步骤如下：第一次二甲苯处理15min、第二次二甲苯处理13min、用体积比为1:1的二甲苯：无水乙醇过渡处理2min、第一次100％乙醇处理2min、第二次100％乙醇处理2min、第一次95％乙醇处理2min、第二次95％乙醇处理2min、80％乙醇处理2min、70％乙醇处理2min、苏木精染色20min、自来水冲洗3min、1％盐酸酒精溶液处理5s、水洗后氨水15s、再水洗、70％乙醇处理3min、80％乙醇处理3min、90％乙醇处理3min、伊红染色30s、95％乙醇处理4min、第一次100％乙醇处理4min、第二次100％乙醇处理4min、用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理5min、再用第一次二甲苯处理5min、第二次二甲苯处理5min使之透明，然后用中性树胶封片，封片是轻压盖玻片赶出树胶内的气泡，注意压片时用力要均匀，不宜用力过大，以免压坏盖玻片及样品移位，影响观察，待样片中的树胶在烘箱中烘干后，用刀片刮去多余的树胶。

由附图1和附图2可以看出，使用本实施1的制片方法得到的石蜡切片容易切片，且完整连片，无残缺、重叠，组织结构清晰，层次分明，无假象，脂肪细胞界线清楚，染色对比明显，未见灰染。

对比实施1：

1、材料固定于预处理

将黄石爬鮡皮肤取下后，用生理盐水清洗后，将皮肤修成1cm×0.5cm×0.5cm大的组织，投入波恩氏液中固定至少24h后，保存在70％乙醇中2h。

2、石蜡组织切片的制作与观察

(1)脱水与透明程序：浓度为70％的乙醇处理3h、80％的乙醇处理3h、90％的乙醇处理3h、第一次95％乙醇处理3h、第二次95％乙醇处理3h、第一次100％乙醇处理3h、第二次100％乙醇处理2h；然后第一次二甲苯处理45min、第二次二甲苯处理30min，再用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理30min，使之透明；

(2)浸蜡与包埋：用体积比为1:1的二甲苯：纯石蜡过渡处理1h、再第一次纯石蜡透蜡2h、第二次纯石蜡2h，将组织样品用小纸盒进行包埋；

(3)切片与展片：用切片机切片，切片厚度控制在6μm，经37℃水浴锅中进行展片，用涂有蛋白甘油的载玻片捞片后，在37℃的烘箱中进行烘片；

(4)染色、封片与观察：染色采用H.E染色方法，具体步骤如下：第一次二甲苯处理15min、第二次二甲苯处理13min、用体积比为1:1的二甲苯：无水乙醇过渡处理2min、第一次100％乙醇处理2min、第二次100％乙醇处理2min、第一次95％乙醇处理2min、第二次95％乙醇处理2min、80％乙醇处理2min、70％乙醇处理2min、苏木精染色20min、自来水冲洗3min、1％盐酸酒精溶液处理5s、水洗后氨水15s、再水洗、70％乙醇处理3min、80％乙醇处理3min、90％乙醇处理3min、伊红染色30s、95％乙醇处理4min、第一次100％乙醇处理4min、第二次100％乙醇处理4min、用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯过渡处理5min、再用第一次二甲苯处理5min、第二次二甲苯处理5min使之透明，然后用中性树胶封片，封片是轻压盖玻片赶出树胶内的气泡，注意压片时用力要均匀，不宜用力过大，以免压坏盖玻片及样品移位，影响观察，待样片中的树胶在烘箱中烘干后，用刀片刮去多余的树胶。

如图3所示，传统时间较长脱水包埋实施例条件下，制作的切片，不完整，有大量残缺、重叠，组织结构不清晰；由图4所示，有表皮层脱离的情况出现。证明，传统方法不适于用于制作黄石爬鮡皮肤石蜡切片。

Claims (8)

1.一种黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法，由样品固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片与展片、染色与封片五个步骤组成，其特征在于：在样品固定后，经流水冲洗1.5-2.5h后再进行脱水处理；脱水与透明、浸蜡与包埋的总时间为12.5h。

2.如权利要求1所述的黄石爬鮡皮肤的石蜡切片制作方法，其特征在于：所述样品固定步骤为将石爬鮡皮肤取下后，用生理盐水清洗后，将皮肤修成1cm×0.5cm×0.5cm大小的组织，投入波恩氏液中固定。

3.如权利要求1所述的黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法，其特征在于所述脱水与透明步骤为用梯度乙醇脱水：先后采用浓度为70％的乙醇处理2-12h、80％的乙醇处理1.8-2.2h、90％的乙醇处理70-80min、第一次95％的乙醇处理40-50min、第二次95％的乙醇处理0.8-1.2h、第一次100％的乙醇处理25-35min、第二次100％的乙醇处理25-35min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯透明预处理25-30min、再用二甲苯处理2次，每次10-20min，使之透明。

4.如权利要求3所述的黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法，其特征在于所述脱水与透明步骤为用梯度乙醇脱水：先后采用浓度为70％的乙醇处理2h、80％的乙醇处理2h、90％的乙醇处理75min、第一次95％的乙醇处理45min、第二次95％的乙醇处理1h、第一次100％的乙醇处理30min、第二次100％的乙醇处理30min；然后用体积比为1:1的无水乙醇：二甲苯透明预处理30min、再用二甲苯处理2次，每次15min，使之透明。

5.如权利要求1所述的黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述浸蜡与包埋步骤为用体积比为1:1的二甲苯：石蜡进行浸蜡预处理25-35min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次85-95min；最后将组织样品用纸盒进行包埋。

6.如权利要求5所述的黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法，其具体特征在于：所述浸蜡与包埋步骤为用体积比为1:1的二甲苯：石蜡浸蜡预处理30min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次90min，最后将组织样品用纸盒进行包埋。

7.如权利要求1所述的黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述切片与展片步骤为用切片机切片，切片厚度控制在5μm-7μm，经35℃-38℃水浴锅中进行展片，用涂有蛋白甘油的载玻片捞片后，在35℃-38℃的烘箱中进行烘片。

8.如权利要求1所述的黄石爬鮡皮肤石蜡切片的制作方法，其特征在于：所述染色与封片步骤中染色采用H.E染色方法。