CN107843470A - 一种皮肤组织切片的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种皮肤组织切片的制作方法，包括如下步骤：脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、染色、封片；在浸蜡与包埋步骤后，还包括将蜡块浸入酒精溶液‑甘油的混合液中浸泡20‑28h的步骤；所述酒精溶液‑甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为55‑65％，酒精溶液与甘油的体积比为(8‑10):1。本发明的方法能够修正因前期组织脱水导致的组织块过硬的现象，使组织块变软，便于切片，且不易出现组织破碎和脱片现象，样本的形态学保持完整；特别是在免疫组化修复过程中，不再出现因组织脱片、破碎等导致的定位不准确或假阴性的现象。

Description

一种皮肤组织切片的制作方法

技术领域

本发明涉及病理组织切片制备技术领域，具体涉及一种皮肤组织切片的制作方法。

背景技术

石蜡切片是组织学研究中重要的实验技术，主要用于镜下观察细胞形态结构，在病理学和法医学等领域扮演着十分重要的角色，为临床和医学科研做出过重大贡献。石蜡切片主要步骤为：标本采集、取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、烘片、染色、封片等；后续还针对石蜡切片发明了原位杂交等一系列切片分析技术。然而，要做好石蜡切片，达到完全稳定样本性状、保持组织形态不因切片操作使其失真的要求，需要很多方面的注意。针对不同的组织，需要有不同细节的特定方法，才能有更好的针对性，从而更好的展现组织样本的展现样本特点而又不因切片操作使其失真。

皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，皮肤组织结构比较复杂，给切片制作带来一定的困难。皮肤结构主要分为三层：表皮、真皮和皮下組织，其中含有丰富的神经末梢及皮肤附属器，如皮脂腺、汗腺等。皮肤不同的部位具有不同的结构组成和特点，如表皮层主要含有角蛋白，真皮层及皮下组织主要含有胶原纤维及弹力纤维。以上不同成分使皮肤各层的硬度和韧性有所差别，在切片中常会出现皱褶、易脱片等现象，而且由于皮肤组织中纤维成分特别丰富而致密，给制片增加了相当的难度。

传统的皮肤组织石蜡切片的制作过程中，在常规取材、脱水、包埋、切片后容易出现如下两种现象：

(1)制作常规HE切片时：组织块过硬，后续切片困难，易脱片和破碎；

(2)进行免疫组织化学染色时：高温高压修复和多次漂洗过后组织破碎严重。

而组织破碎后会导致镜下形态学不完整，免疫组化抗体定位不准确，易出现假阴性，使得皮肤组织切片不能够保持组织形态完整。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种皮肤组织切片的制作方法。该方法能够修正因前期组织脱水导致的组织块过硬的现象，使组织块变软，便于切片，且不易出现组织破碎和脱片现象，样本的形态学保持完整；特别是在免疫组化修复过程中，不再出现因组织脱片、破碎等导致的定位不准确或假阴性的现象。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种皮肤组织切片的制作方法，包括如下步骤：脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、染色、封片；且在浸蜡与包埋步骤后，还包括将蜡块浸入酒精溶液-甘油的混合液中浸泡20-28h的步骤；

所述酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为55-65％，酒精溶液与甘油的体积比为(8-10):1。

优选的，所述酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为60％，酒精溶液与甘油的体积比为9:1。

进一步优选的，浸蜡与包埋后，将蜡块浸入酒精溶液-甘油的混合液中浸泡24h。

优选的，所述脱水步骤为：采用不同浓度的乙醇溶液逐步脱水，先用80％的乙醇脱水30-50min，然后用90％的乙醇脱水30-50min，再用95％乙醇脱水2次，每次40-60min，最后用100％乙醇脱水2次，每次20-40min。

优选的，所述透明步骤为：先用无水乙醇-甲基环己烷混合液中预处理5-10min；取出后再浸入甲基环己烷中20-30min，使之透明。

进一步优选的，所述无水乙醇-甲基环己烷混合液中，无水乙醇与甲基环己烷的体积比为1:2。

优选的，所述浸蜡与包埋步骤为：用质量比为1:1的硬脂酸：石蜡浸蜡预处理10-20min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次40-60min；最后将组织样品常规包埋。

优选的，所述切片步骤为用切片机切片，切片厚度为3-5μm。

优选的，所述染色步骤包括：常规HE染色和免疫组织化学染色。

本发明的有益效果：

本发明首次提出了在浸蜡与包埋的步骤之后进一步增加组织蜡块处理的步骤，并通过一系列的试验，对组织蜡块处理所采用的试剂组成进行了优选，结果发现，采用本发明优选的试剂对蜡块进行处理，可以修正前期因组织脱水导致的组织块过硬的现象，使组织块软化，便于切片；经组织蜡块处理后，制备的切片未出现破碎和脱片现象，形态学保持完整。特别是在免疫组织化学染色的过程中，由于高温高压修复和多次漂洗操作，常规的皮肤组织石蜡切片的制作方法很容易导致组织破碎，使得免疫组化抗体定位不准确，易出现假阴性，而采用本发明的制作方法可以避免出现破碎和脱片现象，免疫组化修复过程中，未再发生因组织脱片、破碎等导致的定位不准确或假阴性的现象。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：实施例1制备的皮肤组织免疫组化切片；

图2：对比例1制备的皮肤组织免疫组化切片。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，在制备皮肤组织切片时，现有的制片方法存在组织块过硬、后续切片困难、易脱片和破碎等问题，特别是在进行免疫组织化学染色时，由于高温高压修复和多次漂洗等操作，使组织破碎严重，导致免疫组化抗体定位不准确，易出现假阴性。基于此，本发明提出了一种新的皮肤组织切片的制作方法，首次在浸蜡与包埋步骤后增加了组织蜡块的处理步骤，并结合脱水、透明等处理步骤的改进，有效解决了切片困难、易脱片和破碎等问题，制备的皮肤组织切片形态学完整，免疫组化染色定位准确，无假阴性或假阳性的结果出现。

在本发明的一种实施方案中，给出了一种皮肤组织切片的制作方法，包括如下步骤：

(1)脱水：采用不同浓度的乙醇溶液逐步脱水，先用80％的乙醇脱水30-50min，然后用90％的乙醇脱水30-50min，再用95％乙醇脱水2次，每次40-60min，最后用100％乙醇脱水2次，每次20-40min。

(2)透明：先用无水乙醇-甲基环己烷混合液中预处理5-10min；取出后再浸入甲基环己烷中20-30min，使之透明。

(3)浸蜡与包埋：用质量比为1:1的硬脂酸：石蜡浸蜡预处理10-20min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次30-50min；最后将组织样品常规包埋。

(4)组织蜡块处理：将包埋后的蜡块浸入酒精溶液-甘油的混合液中浸泡20-28h，所述酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为55-65％，酒精溶液与甘油的体积比为(8-10):1。

(5)切片：用切片机切片，切片厚度为3-5μm。

(6)染色：染色包括常规HE染色和免疫组织化学染色，均采用常规的染色操作。

(7)封片。

脱水是皮肤组织切片制作过程中的关键环节之一，目前一般采用乙醇梯度升级脱水法，本发明在现有的脱水方法上进行了改进，减少了80％、90％乙醇的脱水时间，增加了95％乙醇的脱水时间，并通过系列实验，包括方法的筛选、条件的优化及重复实验，得到了最优的脱水处理方法，采用本发明的脱水处理方法，能够使得表皮、真皮和皮下组织的硬度和韧度达到最好，既不会因真皮及皮下组织中水分未脱净而导致组织块的硬度和韧度不够，也不会因脱水过度导致组织块硬度、脆度过大。

进一步的，本发明还对透明剂进行了优化改良，传统的透明剂一般选择二甲苯，但二甲苯对人体具有较大的毒性，长期接触会导致植物神经系统出现功能紊乱。而以甲基环己烷作为透明剂，其毒性较小，能够减轻组织切片制作过程对人体的伤害。

进一步的，在浸蜡与包埋的过程中，本发明以硬脂酸-石蜡混合溶剂进行预处理，硬脂酸能够协助石蜡进入组织，有效减少了浸蜡的时间，防止浸蜡时间过长造成组织块脆硬。

更为关键的，本发明在浸蜡与包埋的步骤之后增加了组织蜡块处理的步骤，并对用于组织蜡块处理的试剂组成进行了优化考察，结果发现，以60％酒精溶液和甘油按体积比为9:1组成的混合溶液对组织蜡块进行处理时，其处理效果最佳。若改变处理试剂的组成或体积配比，则都会降低对组织蜡块的处理效果。另外，虽然对组织蜡块处理的主要目的是软化组织块，但处理时机的选择却非常关键，本发明在试验过程中曾尝试在脱水之前、脱水之后、浸蜡与包埋之前等多个时间进行上述处理，结果发现对最终切片的制作效果影响欠佳，仍有脱片和组织破碎的情况出现。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：皮肤组织免疫组化切片的制作

具体制作方法包括如下步骤：

(1)组织取材与固定：麻醉处死大鼠，用剪刀修剪背部被毛，剪取大鼠背部皮肤，切取体积1.5cm×1.5cm×0.3cm组织块。放至10％肿性福尔马林固定12h。

(2)脱水：采用不同浓度的乙醇溶液逐步脱水，先用80％的乙醇脱水40min，然后用90％的乙醇脱水30min，再用95％乙醇脱水2次，每次40min，最后用100％乙醇脱水2次，每次30min。

(3)透明：先用无水乙醇-甲基环己烷混合液中预处理10min；取出后再浸入甲基环己烷中20min，使之透明。

(4)浸蜡与包埋：用质量比为1:1的硬脂酸：石蜡浸蜡预处理10min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次40min；最后将组织样品常规包埋.

(5)组织蜡块处理：将包埋后的蜡块浸入酒精溶液-甘油的混合液中浸泡24h，所述酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为60％，酒精溶液与甘油的体积比为9:1。

(6)切片：用切片机切片，切片厚度为3-5μm。

(7)脱蜡、水化：将组织切片依次放入3个装有甲基环己烷的玻璃缸中浸泡，每缸15min；再依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5min；再依次放入2个装有95％乙醇的玻璃缸中，每缸5min；然后再依次放入90％乙醇、85％乙醇、75％乙醇的玻璃缸中，每缸2min，取出，最后用蒸馏水清洗。

(8)抗原修复：将切片浸入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2min，然后停止加热让切片自然冷却。

(9)加一抗：加入稀释好的一抗，加入量根据组织块的大小进行调整，置于湿盒4℃过夜。

(10)加二抗：加入生物素偶联的二抗，加入量根据组织块的大小进行调整，室温放置25min。

(11)显色：加入链亲和素-辣根过氧化物酶，加入量根据组织块的大小进行调整，湿盒内28℃放置5-20min，甩干；然后置于PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干；再滴加新鲜配制的DAB工作液，加入量以能覆盖组织为宜，放置观察反应部位呈现黄褐色时，置装有自来水的玻璃缸中洗涤3次。

(12)复染：浸入苏木精溶液中复染，放置5min后，用水反复洗涤至水不变色，再用1％盐酸酒精分化1-2s后，水冲洗，再用反蓝水洗2min。

(13)脱水与透明：依次放入90％、95％乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出；再依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出；再依次放入2个装有甲基环己烷的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。

(14)封片：滴加适量中性树胶，封片，晾干。

制备的皮肤组织免疫组化切片如图1所示。

实施例2：皮肤组织HE切片的制作

具体制作方法包括如下步骤：

(1)组织取材与固定：采用CO₂麻醉处死大鼠，用剪刀修剪背部被毛，剪取大鼠背部皮肤，皮肤标本大小不超过1.5cm×1.5cm×0.2cm，固定于3.7％多聚甲醛溶液中4℃保存，固定24h后取出，经0.1mol/L的PBS(pH7.4)充分清洗。

(2)脱水：采用不同浓度的乙醇溶液逐步脱水，先用80％的乙醇脱水40min，然后用90％的乙醇脱水30min，再用95％乙醇脱水2次，每次40min，最后用100％乙醇脱水2次，每次30min。

(3)透明：先用无水乙醇-甲基环己烷混合液中预处理10min；取出后再浸入甲基环己烷中20min，使之透明。

(4)浸蜡与包埋：用质量比为1:1的硬脂酸：石蜡浸蜡预处理10min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次40min；最后将组织样品常规包埋.

(5)组织蜡块处理：将包埋后的蜡块浸入酒精溶液-甘油的混合液中浸泡24h，所述酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为60％，酒精溶液与甘油的体积比为9:1。

(6)切片：用切片机切片，切片厚度为3-5μm。

(7)展片：取清洁载玻片，滴1滴粘片剂明胶液于中央，将其涂开，使之在载玻片中央形成具有一定面积的均匀液层，在粘片剂上滴1滴蒸馏水，用镊子将切成片状的蜡带置于蒸馏水上，蜡片皱起的一面朝上，调节蜡片在载玻片上的位置，45℃水浴展片90-120s，使蜡片伸展完全。

(8)脱蜡：将切片置于甲基环己烷中脱蜡1次，10min，再依次置于100％、95％、90％、80％、70％浓度的乙醇中各5min进行复水，再放入蒸馏水中3min。

(9)染色：切片在染色前先进行烘片，烘片条件为60℃，20min，烘片后自然冷却；然后用苏木素-伊红染色。

(10)封片：滴加适量中性树胶，封片，晾干。

对比例1：皮肤组织免疫组化切片的制作

制作方法基本上同实施例1，区别在于：将实施例1的步骤(5)“组织蜡块处理”省略。

制作的皮肤组织免疫组化切片如图2所示。

由图1和图2比较可以看出，采用本发明实施例1的方法制备的皮肤组织免疫组化切片形态学完整，未出现组织破碎，抗体定位准确(图1)；而对比例1制备的皮肤组织免疫组化切片组织破碎严重，形态学不完整，导致抗原定位不准确。

对比例2：皮肤组织免疫组化切片的制作

制作方法基本上同实施例1，区别在于：将实施例1的步骤(5)“组织蜡块处理”所使用的酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液和甘油的体积比调整为7:1。

对比例3：皮肤组织免疫组化切片的制作

制作方法基本上同实施例1，区别在于：将实施例1的步骤(5)“组织蜡块处理”所使用的酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液和甘油的体积比调整为1:2。

结果发现，对比例2和对比例3制备的皮肤组织免疫组化切片，其仍出现不同程度的组织破碎，抗原定位的准确性欠佳。说明用于对组织蜡块处理的溶剂组成对最终制备的皮肤组织免疫组化切片的效果的影响十分关键，只有采用本发明特定配比组成的酒精溶液-甘油混合液对组织蜡块进行处理才能取得好的皮肤免疫组化切片制作效果。

对比例4：皮肤组织HE切片的制作

制作方法基本上同实施例2，区别在于：将实施例2的步骤(5)“组织蜡块处理”省略。

比较实施例2和对比例4制备的切片质量，结果发现，实施例2制备的切片在组织完整性、切片厚度、切片透明度、切片平整性、切片是否松散等项目的评分显著高于对比例4制备的切片；实施例2制备的切片的优级率达95.2％，显著高于对比例4(81.5％)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种皮肤组织切片的制作方法，包括如下步骤：脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、染色、封片；其特征在于，在浸蜡与包埋步骤后，还包括将蜡块浸入酒精溶液-甘油的混合液中浸泡20-28h的步骤；

所述酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为55-65％，酒精溶液与甘油的体积比为(8-10):1。

2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述酒精溶液-甘油的混合液中，酒精溶液的体积浓度为60％，酒精溶液与甘油的体积比为9:1。

3.根据权利要求1或2所述的制作方法，其特征在于，浸蜡与包埋后，将蜡块浸入酒精溶液-甘油的混合液中浸泡24h。

4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述脱水步骤为：采用不同浓度的乙醇溶液逐步脱水，先用80％的乙醇脱水30-50min，然后用90％的乙醇脱水30-50min，再用95％乙醇脱水2次，每次40-60min，最后用100％乙醇脱水2次，每次20-40min。

5.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述透明步骤为：先用无水乙醇-甲基环己烷混合液中预处理5-10min；取出后再浸入甲基环己烷中20-30min。

6.根据权利要求5所述的制作方法，其特征在于，所述无水乙醇-甲基环己烷混合液中，无水乙醇与甲基环己烷的体积比为1:2。

7.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述浸蜡与包埋步骤为：用质量比为1:1的硬脂酸：石蜡浸蜡预处理10-20min；再用纯石蜡浸蜡2次，每次40-60min；最后将组织样品常规包埋。

8.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述切片步骤为用切片机切片，切片厚度为3-5μm。

9.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述染色步骤包括：常规HE染色和免疫组织化学染色。