CN102967493B

CN102967493B - 植物组织快速石蜡制片的方法

Info

Publication number: CN102967493B
Application number: CN201210416514.6A
Authority: CN
Inventors: 贺冰
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2012-10-27
Filing date: 2012-10-27
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2032-10-27
Also published as: CN102967493A

Abstract

本发明公开了一种植物组织快速石蜡制片的方法，其步骤包括：取样、固定、脱水及透明、石蜡渗透、包埋及切片、黏片和展片、染色和封固。本发明极大地提高了植物组织石蜡制片固定的效率，较传统石蜡制片需要一天的固定时间提高效率10～20倍；用叔丁醇或正丁醇作为脱水、透明剂简化了脱水与透明步骤，所需脱水及透明时间仅为6～7h，较传统脱水和透明效率提高了3倍以上；提高了植物组织在石蜡渗透的效率和包埋的质量，渗蜡时间共需4～7h，较传统渗蜡方法效率提高1倍以上，有效地解决了渗蜡时温度过高造成组织变硬和变脆等问题。本发明具有实验程序简化、所用仪器设备价格便宜、制片周期短、制片质量高和安全环保等特点。

Description

植物组织快速石蜡制片的方法

技术领域

本项发明涉及生物组织石蜡制片技术领域，特别涉及一种植物组织快速石蜡制片的方法。

背景技术

石蜡制片技术的应用和发展已有150年的历史。在人、动物、植物、昆虫、微生物等研究领域都有广泛的应用，由于可将生物组织材料制成很薄和连续的切片，并且玻片材料保存时间可长达数十年之久。因此成为生物学研究中最为完善的一种制片法。传统的石蜡制片技术广泛应用于植物学、植物解剖学、植物病理学等学科。其过程包括：固定、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、黏片、展片、烤片、熔蜡、染色和封固等多个步骤。然而传统的石蜡制片技术也有缺点：制片步骤繁琐冗长，所需制片设备较为昂贵，通常生物组织制片需要配置生物组织脱水机、包埋机、烤片机和熔蜡箱等较为昂贵的设备；制作过程耗费时日较长，一般需要3～5日甚至更长的时间，操作过程复杂，特别是固定、脱水、透明、渗蜡等步骤，在整个制片过程中耗时最多，其中每一步骤需在规定时间内，制片者须等待各种试剂在组织材料中自然地缓慢替换，这样容易使组织收缩、变硬和变脆，如遇坚硬或易脆的材料时很难切出理想的切片。同时在制片的过程中，长期大量使用多种有毒有机化学试剂，如二甲苯、冰乙酸、正丁醇和石蜡，不仅引起实验室空气的污染而且还严重威胁到制片者的身体健康。因此，有必要对现有技术进行改进。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的一些缺陷，提供一种植物组织快速石蜡制片的方法，可简便快捷地为植物学和植物病理学等学科的教学和科研提供高质量的组织切片。

本项发明的植物组织快速石蜡制片的方法，其步骤如下：

（1）固定将植物组织材料小块放入装有FAA固定液的玻璃瓶中，确保材料完全浸没在固定液中，然后将该玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定35～40℃,﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥60～90min，迅速杀死组织并排出组织材料中的气体直至沉入瓶底。

（2）脱水及透明将（1）处理过的玻璃瓶中的FAA固定液倒出，换成50%的乙醇，将装试验材料的玻璃瓶放入真空干燥箱中干燥，真空干燥箱条件为：35～40℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥20～30min；再将玻璃瓶中50%的乙醇换成60%的乙醇，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上；把60%的乙醇换成70%的乙醇，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上；然后将玻璃瓶中70%的乙醇换成脱水—透明剂Ⅰ液，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件为：35～40℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥40～60min；再将脱水—透明剂Ⅰ液换成脱水—透明剂Ⅱ液，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上；再把脱水—透明剂Ⅱ液换成脱水—透明剂Ⅲ液，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上；最后将脱水—透明剂Ⅲ液换成纯叔丁醇或正丁醇，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件为：40～45℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥60～120min，使植物组织细胞中的水分和乙醇逐渐被纯叔丁醇或正丁醇所替代，完成脱水和透明。

（3）石蜡渗透将经（2）处理的植物组织材料脱水剂换成叔丁醇—石蜡Ⅰ液或正丁醇—石蜡Ⅰ液，将装试验材料的玻璃瓶放入真空干燥箱进行石蜡渗透，石蜡渗透条件为：52～58℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，渗透处理60～120min；然后将叔丁醇—石蜡Ⅰ液或正丁醇—石蜡Ⅰ液换成叔丁醇—石蜡Ⅱ液或正丁醇—石蜡Ⅱ液，继续石蜡渗透，石蜡渗透条件同上；最后将叔丁醇—石蜡Ⅲ液或正丁醇—石蜡Ⅲ液换成纯石蜡液，进一步纯石蜡渗透，石蜡渗透条件同上，使植物组织细胞中的叔丁醇或正丁醇逐渐被纯石蜡所替换。

（4）包埋及切片将经（3）处理的植物组织与纯石蜡溶液一起倒入包埋盒，调整好植物组织的位置，使植物组织与纯石蜡溶液快速冷却，直至石蜡由溶液凝固成石蜡块，将包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成连续的蜡带，蜡带形状为长方形，上下两个长边平行，切片厚度为4～12μm。

（5）黏片和展片将（4）切好的蜡带分割成适宜的片段，用明胶黏贴剂贴于载玻片上，黏片时将蜡片完全伸展，故黏片和展片是在载玻片上连续完成的，将黏贴好蜡带的载玻片水平放入真空干燥箱进行烤片，烤片的条件为：30～33℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，烤片30~40min，之后等待其温度降至室温备用。

（6）染色采用番红—固绿双重染色法染色，其步骤为：

A、将经（5）处理的粘有蜡片的载玻片放入纯二甲苯中10～15min，使石蜡完全溶解；

B、将A处理过的植物组织载玻片转到二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ中过渡处理2～3min；

C、将B处理过的植物组织载玻片转到二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ中过渡处理2～3min；

D、将C处理过的植物组织载玻片在纯乙醇中脱水处理30～60s，再依次转到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分别脱水、透明处理2～3min；

E、将D处理过的植物组织载玻片置入含1%番红染料的60%乙醇溶液的卧式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥条件为：38～42℃，染色 3～5h；

F、将经E染色的植物组织载玻片依次转入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分别脱水、透明处理30～40s；

G、将经F处理的植物组织载玻片置入含1%固绿染料的95%乙醇溶液染缸中，染色45～60s；

H、将G处理过的植物组织载玻片再依次经95%乙醇、无水乙醇、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ液、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ液中分别处理5～10s，最后置于纯二甲苯中脱水、透明10～15s。

（7）封固用二甲苯稀释的加拿大树胶做为封固剂，对经（6）处理的植物组织载玻片进行封固，将封片在室温下自然干燥即可。

所述的FAA固定液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级50%乙醇90份、冰乙酸5份、36～40%甲醛5份。

所述的固定时植物组织取样材料的体积为：2～4mm×2～4mm×2～4mm。

所述的脱水—透明剂Ⅰ液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级95%乙醇50份、叔丁醇或正丁醇35份、蒸馏水15份。

所述的脱水—透明剂Ⅱ液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级95%乙醇40份、叔丁醇或正丁醇55份、蒸馏水5份。

所述的脱水—透明剂Ⅲ液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级95%乙醇25份、叔丁醇或正丁醇75份。

所述的叔丁醇—石蜡Ⅰ液（或正丁醇—石蜡Ⅰ液）是由下列试剂按体积/质量份配制而成：叔丁醇（正丁醇）30ml、石蜡5克。

所述的叔丁醇—石蜡Ⅱ液（或正丁醇—石蜡Ⅱ液）是由下列试剂按体积/质量份配制而成：叔丁醇（正丁醇）30ml、石蜡15克。

所述二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ是由下列试剂按体积比配制而成：二甲苯65份、分析纯级纯乙醇35份。

所述二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ是由下列试剂按体积比配制而成：二甲苯50份、分析纯级纯乙醇50份。

本发明的有益效果

（1）极大地提高了植物组织石蜡制片固定的效率本发明的植物组织石蜡制片固定时材料在真空干燥箱中进行真空抽气，并保持恒定的温度，这样材料中气体会彻底和迅速地抽出，固定液在相对较高的温度下增强了对组织的渗透能力，使细胞各个组分得到充分的沉淀和凝固，避免了由于材料长时间浸泡在固定液中而发生膨胀、变硬等破坏，从而产生显著地光学差异，获得较好的染色和观察效果。使用真空干燥箱后，固定时间仅为60—90min，较传统石蜡制片需要一天的固定时间提高效率10～20倍。

（2）用叔丁醇或正丁醇作为脱水、透明剂简化了脱水与透明步骤叔丁醇或正丁醇可与水、乙醇和二甲苯等溶剂相混合，也是石蜡的溶媒；较二甲苯等脱水剂，叔丁醇或正丁醇不会使组织收缩和变硬，由于叔丁醇或正丁醇兼有脱水和透明两种作用，因此用叔丁醇或正丁醇作为脱水、透明剂处理植物组织可同时起到脱水和透明的作用，这样简化了脱水与透明步骤，节约了大量的时间，且脱水效果比传统的脱水剂二甲苯好。脱水在真空干燥箱中进行，箱内温度和负压可以保持恒定。一方面，由于脱水、透明剂的温度的提升，可避免季节变化造成室温波动对实验试剂凝固点的影响（叔丁醇的凝固点仅为24.0~25.5℃，特别在北方的春季和冬季）；另一方面，在恒温和真空负压下，脱水、透明剂和植物组织内气体加快排出，加速了脱水乙醇和脱水、透明剂叔丁醇或正丁醇对植物组织细胞的渗透，彻底地将组织中水分除去，有利于后期的石蜡渗透。本发明所需脱水及透明时间仅为6～7h，较传统脱水和透明效率（20h以上）提高3倍以上。

（3）提高了植物组织在石蜡渗透的效率和包埋的质量石蜡渗透是指纯石蜡完全替代叔丁醇或正丁醇等试剂进入到组织细胞中的一个渐进过程。在传统的生物石蜡制片中使用玻璃真空干燥器置于数显水浴锅或在熔蜡箱来实现石蜡渗透的温度控制，器或箱内温度不宜精确控制且易受外界温度变化的影响，特别是夏季使用的石蜡的熔点过高（56℃～58℃），浸蜡温度过高会使组织材料收缩，组织材料变脆或变硬；而过低时会影响石蜡的渗透速率造成石蜡渗透不完全，并且组织内部易常混有气泡或包埋时有气泡附着在组织表面，这样切片时易发生断片、掉片和切片蜡带有空洞，往往影响最终切片的质量。真空干燥箱内不必考虑室温变化等因素的影响，并且在真空负压下不同的溶媒经过加温，可加速渗蜡的进程。包埋时，纯石蜡在真空干燥箱内熔化时，由于始终处于真空环境中，比常压下熔点要低一些，可以有效地解决渗蜡时温度过高造成组织变硬和变脆等问题。经过抽气后的纯石蜡溶液结构致密且细腻、色泽清亮且结构性良好，利于维持包埋时组织材料的稳定性，使包埋过程简便易行，保证了包埋的质量。试验结果显示：使用真空干燥箱后，渗蜡时间共需4～7h，较传统渗蜡方法（8～12 h）效率提高1倍以上。

（4）本发明所涉及的植物组织快速石蜡制片方法所需的设备简单、操作简便易行，运行安全环保本发明在植物组织石蜡制片中主要使用的设备就是真空干燥箱，实验设备价格便宜且操作简单，中小型生物实验室均可应用该项技术，免除了传统石蜡制片中所需的脱水机、包埋机、烤片机和熔蜡箱等昂贵的设备，可谓一机多用。在运行时，由于真空泵可将实验产生的有害废气通过胶皮管室外排出，避免了冰乙酸、二甲苯、正丁醇、叔丁醇和石蜡溶液等试剂挥发造成对实验室的空气污染，大大减轻废气对实验人员健康的危害。同时叔丁醇对金属无腐蚀性，可充分保证试验设备的安全性。

总之，本发明的植物组织快速石蜡制片技术，在固定抽气、脱水透明及石蜡渗透等步骤中，可以使植物组织材料始终保持在相对稳定的温度和真空条件下，这样可加速气体分子快速的弥散，加快水分子与有机溶剂的交换和渗透速率，使试验材料的处理时间大幅度地缩短，而其组织结构和细胞形态依然保持完好。这样可以极大地减少材料在各级溶液中长时间处理而引起的组织变形扭曲、脆化收缩，使制片质量显著提高，实验时间大大缩短。制片周期由传统的3～5天缩短到1～2天完成。该项技术具有实验程序简化、所用仪器设备价格便宜，实用性强，一般普通中小型生物实验室均可进行，且制片质量高和安全环保等特点。

下面结合实施例对本发明的植物组织快速石蜡制片的方法作进一步的说明。

实施例1

实验目的：梨果实愈伤组织接种梨褐腐病病原菌（Monilinia fructigena）24h后观察菌丝侵染状态。

植物组织快速石蜡制片的步骤如下：

（1）取样（上午8：00～8:30）梨褐腐病病原菌菌种接种于梨果实愈伤组织上表面，培养24h后混合取材15份，愈伤组织柔软且富含大量水分。选取完整的愈伤组织，体积为3mm×3mm×2mm，共取样10份，然后用FAA固定液浸没在青霉素玻璃瓶中。

（2）固定（上午8:30～10:00）确保愈伤组织材料完全浸没在固定液后，将愈伤组织材料玻璃瓶敞口放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为35℃,﹣0.08Mpa，开机干燥90min，迅速杀死愈伤组织材料并排出愈伤组织材料中的气体直至沉入瓶底。

（3）脱水（上午10:00～下午18:00）固定结束后，将浸没愈伤组织材料的固定液依次换成50%、60%、70%的乙醇，梯度脱水，将愈伤组织材料玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为40℃, ﹣0.08Mpa，开机干燥20min。然后将浸没愈伤组织材料的液体依次换成脱水—透明剂Ⅰ液、脱水—透明剂Ⅱ液、脱水—透明剂Ⅲ液，将愈伤组织材料玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为35℃，﹣0.08Mpa，分别干燥处理60min，最后将浸没愈伤组织材料的试剂换成纯叔丁醇，真空干燥条件为40℃, ﹣0.08Mpa，开机干燥120min。

（4）渗蜡和包埋（下午18:00～22:00）将经过脱水、透明后的愈伤组织材料依次换入叔丁醇—石蜡液Ⅰ液、叔丁醇—石蜡液Ⅱ液和纯石蜡液，将愈伤组织材料玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为58℃, ﹣0.08Mpa，分别进行石蜡渗透60min。将经处理的愈伤组织材料与纯石蜡溶液一起倒入包埋盒，调整好愈伤组织的位置，使愈伤组织与纯石蜡溶液快速冷却，直至石蜡由溶液凝固成石蜡块。

（5）切片、黏片和展片（次日上午8:00～10:30）把包埋好的愈伤组织材料石蜡块经过分割、修整与固着等步骤，然后经滚轮式切片机将蜡块切成连续不断的蜡带，切片厚度为4～6μm。蜡片切好后，将蜡带分割成适宜的片段，用明胶黏贴剂贴于载玻片上，然后将黏贴好蜡带的载玻片水平放入真空干燥箱进行烤片，烤片温度设定30℃,﹣0.08Mpa，烤片时间为40min。

（6）染色 (上午10:30～17:30) 将烤片结束的愈伤组织载玻片放入纯二甲苯中使石蜡溶解10min，再依次转到二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ和二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ中各处理3min，把愈伤组织载玻片移至无水乙醇中处理30s，再依次转到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分别处理2min。之后把愈伤组织载玻片置入含1%番红染料的60%乙醇溶液的卧式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥条件为：38℃，染色5h。然后将愈伤组织载玻片依次转入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分别处理30s，再将愈伤组织载玻片置入含1%固绿染料的95%乙醇溶液的染缸中，染色45s后，将愈伤组织载玻片依次经95%乙醇、无水乙醇、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ和二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ中分别处理10s，最后置于纯二甲苯中脱水、透明15s。

（7）封固用二甲苯稀释的加拿大树胶做为封固剂，对染色结束的愈伤组织载玻片进行封固，将封片在室温下晾干即为愈伤组织石蜡制片玻片。该愈伤组织玻片可在显微镜下观察及显微摄影。

实施例2

实验目的：观察玉米种子萌发时胚根横断面的组织细胞显微结构。

植物组织快速石蜡制片的步骤如下：

（1）取样与固定（上午8：00～9:00）选取玉米种子在低温下萌发（7d）的胚根（下胚轴）组织，用锋利的刀片将整段胚根切成三段（每段长度约为2～3mm），将其浸没在装有FAA固定液的青霉素玻璃瓶中，将胚根材料玻璃瓶敞口放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为40℃,﹣0.07Mpa，开机干燥60min，迅速杀死胚根并排出胚根组织中的气体直至沉入瓶底。

（2）脱水（上午9：00～下午14:30）固定结束后，将浸没胚根的固定液依次换成50%、60%、70%的乙醇，将装有胚根玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为35℃,﹣0.08Mpa，分别开机处理30min，梯度脱水。然后将浸没胚根的试剂依次换成脱水—透明剂Ⅰ液、脱水—透明剂Ⅱ液、脱水—透明剂Ⅲ液，将玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为40℃,﹣0.08Mpa，分别开机处理40min。最后将浸没胚根的试剂换成纯正丁醇，设定真空干燥条件为45℃,﹣0.08Mpa，开机干燥60min。

（3）渗蜡和包埋（下午14：30～下午17:00）将经过脱水、透明后的胚根浸没液依次换成正丁醇—石蜡液Ⅰ液、正丁醇—石蜡液Ⅱ液和纯石蜡液，将胚根玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定真空干燥条件为57℃,﹣0.08Mpa，分别进行石蜡渗透60min。将经处理的胚根与纯石蜡溶液一起倒入包埋盒，调整好胚根的位置，使胚根与纯石蜡溶液快速冷却，直至石蜡由溶液凝固成石蜡块。

（4）切片、黏片和展片（下午17：00～下午19:40）把包埋好的胚根石蜡块经过分割、修整与固着等步骤，然后经滚轮式切片机将蜡块切成连续不断的蜡带，切片厚度为4～6μm。蜡片切好后，将蜡带分割成适宜的片段，用明胶黏贴剂贴于载玻片上。然后将黏贴好蜡带的载玻片水平放入真空干燥箱进行烤片，烤片温度设定为33℃,﹣0.08Mpa，烤片时间为30min。

（5）染色、封固（次日上午8:00～10:00）将烤片结束的胚根载玻片放入纯二甲苯中使石蜡溶解15min，再依次转到二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ和二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ中各处理2min，把胚根载玻片移至无水乙醇中处理60s，再依次转到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分别处理3min。之后把胚根载玻片置入含1%番红染料的60%乙醇溶液的卧式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥条件为42℃，染色3h。然后将胚根载玻片依次转入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分别处理40s；再将胚根载玻片置入含1%固绿染料的95%乙醇溶液的染缸中，染色60s后，将胚根载玻片依次经95%乙醇、无水乙醇、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ和二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ中各处理5s,最后置于纯二甲苯中脱水、透明10s。

（6）封固用二甲苯稀释的加拿大树胶做为封固剂，对脱水后的胚根载玻片进行封固，将封片在室温下晾干即为胚根石蜡玻片。该胚根石蜡玻片可在显微镜下观察及显微摄影。

Claims

1.一种植物组织快速石蜡制片的方法，其步骤如下：

（1）固定将植物组织材料小块放入装有FAA固定液的玻璃瓶中，确保材料完全浸没在固定液中，然后将该玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定35～40℃,﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥60～90min，迅速杀死组织并排出组织材料中的气体直至沉入瓶底；

（2）脱水及透明将（1）处理过的玻璃瓶中的FAA固定液倒出，换成50%的乙醇，将装试验材料的玻璃瓶放入真空干燥箱中干燥，真空干燥箱条件为：35～40℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥20～30min；再将玻璃瓶中50%的乙醇换成60%的乙醇，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上，把60%的乙醇换成70%的乙醇，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上，然后将玻璃瓶中70%的乙醇换成脱水—透明剂Ⅰ液，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件为：35～40℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥40～60min；再将脱水—透明剂Ⅰ液换成脱水—透明剂Ⅱ液，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上，再把脱水—透明剂Ⅱ液换成脱水—透明剂Ⅲ液，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上；最后将脱水—透明剂Ⅲ液换成纯叔丁醇或正丁醇，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件为：40～45℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥60～120min，使植物组织细胞中的水分和乙醇逐渐被纯叔丁醇或正丁醇所替代，完成脱水和透明；

（3）石蜡渗透将经（2）处理的植物组织材料脱水剂换成叔丁醇—石蜡Ⅰ液或正丁醇—石蜡Ⅰ液，将装试验材料的玻璃瓶放入真空干燥箱进行石蜡渗透，石蜡渗透条件为：52～58℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，渗透处理60～120min；然后将叔丁醇—石蜡Ⅰ液或正丁醇—石蜡Ⅰ液换成叔丁醇—石蜡Ⅱ液或正丁醇—石蜡Ⅱ液，继续石蜡渗透，石蜡渗透条件同上；最后将叔丁醇—石蜡Ⅱ液或正丁醇—石蜡Ⅱ液换成纯石蜡液，进一步纯石蜡渗透，石蜡渗透条件同上，使植物组织细胞中的叔丁醇或正丁醇逐渐被纯石蜡所替换；

（4）包埋及切片将经（3）处理的植物组织与纯石蜡溶液一起倒入包埋盒，调整好植物组织的位置，使植物组织与纯石蜡溶液快速冷却，直至石蜡由溶液凝固成石蜡块，将包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成连续的蜡带，蜡带形状为长方形，上下两个长边平行，切片厚度为4～12μm；

（5）黏片和展片将（4）切好的蜡带分割成适宜的片段，用明胶黏贴剂贴于载玻片上，黏片时将蜡片完全伸展，故黏片和展片是在载玻片上连续完成的，将黏贴好蜡带的载玻片水平放入真空干燥箱进行烤片，烤片的条件为：30～33℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，烤片30~40min，之后等待其温度降至室温备用；

（6）染色采用番红—固绿双重染色法染色，其顺序为：

H、将G处理过的植物组织载玻片再依次经95%乙醇、无水乙醇、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ液、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ液中分别处理5～10s，最后置于纯二甲苯中脱水、透明10～15s；

2.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述的FAA固定液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级50%乙醇90份、冰乙酸5份、36～40%甲醛5份。

3.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述的脱水—透明剂Ⅰ液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级95%乙醇50份、叔丁醇或正丁醇35份、蒸馏水15份。

4.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述的脱水—透明剂Ⅱ液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级95%乙醇40份、叔丁醇或正丁醇55份、蒸馏水5份。

5.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述的脱水—透明剂Ⅲ液是由下列试剂按体积比配制而成：分析纯级95%乙醇25份、叔丁醇或正丁醇75份。

6.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述的叔丁醇—石蜡Ⅰ液是由下列试剂按体积/质量份配制而成：叔丁醇30ml、石蜡5克。

7.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述的叔丁醇—石蜡Ⅱ液是由下列试剂按体积/质量份配制而成：叔丁醇30ml、石蜡15克。

8. 根据权利要求6或7所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述的叔丁醇可用等量的正丁醇替代。

9.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ是由下列试剂按体积比配制而成：二甲苯65份、分析纯级纯乙醇35份。

10.根据权利要求1所述的植物组织快速石蜡制片的方法，其特征在于，所述二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ是由下列试剂按体积比配制而成：二甲苯50份、分析纯级纯乙醇50份。