CN104390834A

CN104390834A - 树脂切片的番红与甲基紫混合染色法及其染色液

Info

Publication number: CN104390834A
Application number: CN201410692134.4A
Authority: CN
Inventors: 郑彦坤; 王�忠
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2015-03-04

Abstract

本发明提供了一种树脂切片的番红与甲基紫混合染色法及其染色液，包括以下步骤：(1)染色液配制：配制质量浓度为0.5％的番红溶液和质量浓度为1％的甲基紫溶液；(2)将上述质量浓度为0.5％的番红溶液与质量浓度为1％的甲基紫溶液分别按多种体积比混合后对树脂半薄切片进行染色，在光镜下观察显微结构。本发明的方法针对甲苯胺蓝-O染色缺点，可以满足不同的组织染色要求，且具有成本低、易保存的优点。

Description

树脂切片的番红与甲基紫混合染色法及其染色液

技术领域

本发明属于生物科学与农业科学技术领域，是一种树脂半薄切片的染色方法及其染色液。

背景技术

树脂半薄切片是一种应用非常广泛的形态学研究技术，在植物学、动物学及医学领域的相关研究中更是显得尤为重要。一种好的染色方法，就会起到画龙点睛的作用，将树脂半薄切片技术的优势与特点更加完美的体现出来。甲苯胺蓝-O是一种常用的树脂半薄切片染色剂，它可以将胚乳细胞中的多种结构(如细胞壁、质膜、细胞核、蛋白体和淀粉体等)都同时显现出来。但是，甲苯胺蓝-O具有以下多种缺点：(1)价格昂贵；(2)储存要求高，固体药品也要密闭低温保存；(3)配制过程时，要加碳酸钠等弱碱试剂作为辅助；(4)溶液易沉淀变性；(5)染色时间与温度都需要较为精确的控制，否则会皱片或裂片；(6)因为易受空气中CO₂的影响，对染色时间与温度要求高，所以很难保证同一种组织不同发育天数的切片染色效果一致，最终使得多图拼合图版的外观效果不好；(7)对树脂切片的干燥程度要求高，如果树脂切片受潮，那么此染色剂对切片的染色效果就会大打折扣；(8)染色较为单一，有些组织成分区别不太明显。以上这些甲苯胺蓝-O的染色缺点是我们实验室经过多年经验总结出来的。

发明内容

针对上述现有技术中甲苯胺蓝-O染色缺点，本发明的目的是提供了一种树脂切片的番红与甲基紫混合染色法，以满足不同的组织染色要求。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种树脂切片的番红与甲基紫混合染色法，包括以下步骤：

(1)染色液配制：配制质量浓度为0.5％的番红溶液和质量浓度为1％的甲基紫溶液；

(2)将上述质量浓度为0.5％的番红溶液与质量浓度为1％的甲基紫溶液分别按多种体积比混合后对树脂半薄切片进行染色，在光镜下观察显微结构。

步骤(2)中，将质量浓度为0.5％的番红与质量浓度为1％的甲基紫分别按1：1，1：2，2：1的体积比混合后对树脂半薄切片进行染色。

步骤(1)中，质量浓度为0.5％的番红溶液的配制方法是：用电子天平称取0.5g番红，放入烧杯中；加入100mL 75％的酒精溶解；溶解后过滤，将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。

步骤(1)中，质量浓度为1％的甲基紫溶液的配制方法是：用电子天平称取1g甲基紫，放入烧杯中；加入100ml蒸馏水溶解；溶解后过滤，将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。

本发明的另一个目的是提供一种树脂切片的番红与甲基紫混合染液，其技术方案是：

一种树脂切片的番红与甲基紫混合染液，包括质量浓度为0.5％的番红溶液和质量浓度为1％的甲基紫溶液。

本发明的有益效果是：

本发明与常用的甲苯胺蓝-O染色方法相比，具有以下优点：

(1)无论国产还是进口，与甲苯胺蓝-O相比，番红与甲基紫要便宜的多，而且国产的番红与甲基紫染色效果也不错；

(2)储存要求不高，可在室温下常规保存，保存多年后任然染色效果依然良好，无需像甲苯胺蓝-O那样非常严格的密封；

(3)配制过程简便易行，不需要其它辅助试剂；

(4)溶液不易变性，普通试剂瓶内室温保存即可；

(5)染色时不易产生沉淀，没有严格的温度与时间控制；

(6)同一种组织不同发育天数的切片染色效果可以基本保持一致，大大提高了图的外观效果；

(7)对树脂切片的干燥程度要求不高，甲苯胺蓝-O无法染好的一些受潮样品切片，利用此种方法也可以染好；

(8)可以更加明显地体现出细胞的不同结构与成分。

附图说明

图1是玉米(A,B)，高粱(C,D)和小麦(E,F)颖果的树脂半薄切片，以0.5％番红与1％甲基紫的混合染液染色的效果图；

图2是水稻胚乳组织的树脂半薄切片，以0.5％甲苯胺蓝-O染色的效果图；

图3是高粱胚乳组织的树脂半薄切片，以1％甲基紫单染的效果图；

图4是小麦颖果母体组织的树脂半薄切片的效果图；

图5是不同发育天数的玉米胚乳传递细胞的树脂半薄切片，以0.5％甲苯胺蓝-O染色的效果图；

图6是甲苯胺蓝-O染色失败的例子的效果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

以下以玉米、小麦、高粱胚乳为材料展示本染色方法的具体操作过程：

(1)树脂样品制作与半薄切片

将颖果纵切或横切，取所要观察的部位，先用2.5％戊二醛前固定3小时，然后以pH7.2的0.1mol/L的磷酸缓冲液清洗3次，再用0.5％锇酸后固定3小时。以pH7.2的0.1mol/L的磷酸缓冲液清洗后，乙醇系列脱水，环氧丙烷置换，用低粘性的Spurr树脂浸透与包埋，最终制成样品。用Leica超薄切片机将样品切成1μm半薄切片。

(2)染色剂配制

0.5％番红溶液：用电子天平称取0.5g番红，放入烧杯中；加入100ml 75％的酒精溶解；溶解后过滤，将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。

1％甲基紫溶液：用电子天平称取1g甲基紫，放入烧杯中；加入100ml蒸馏水溶解；溶解后过滤，将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。

(3)染色

按照不同组织的染色需求，可以将0.5％番红与1％甲基紫分别按1：1，1：2，2：1等几种体积比混合，然后对树脂半薄切片进行染色。至于通常的染色需求，1：1的0.5％番红与1％甲基紫即可。

染色效果如附图所示，图1是玉米(A,B)，高粱(C,D)和小麦(E,F)颖果的树脂半薄切片，以0.5％番红与1％甲基紫的混合染液染色，此图未经任何处理。图2是水稻胚乳组织的树脂半薄切片，以0.5％甲苯胺蓝-O染色，图内各图片虽然经过Photoshop软件特殊处理(科研要求，仅限于亮度/对比度、色彩平衡、色相/饱和度调节等不改变图片内容的处理，决不允许图章工具、橡皮擦及涂抹与锐化工具等的使用)，但还是无法掩饰一些不好的染色效果。例如A,B染色过深，C,F染色过浅；图整体颜色单一，不如图1美观。图3是高粱胚乳组织的树脂半薄切片，以1％甲基紫单染。因为采用快染、快拍的省时方法，图片本身的清晰度要比图版1差一些，但是从染色后图版的整体美观程度而言，仍然要比图版2的好一些。图4是小麦颖果母体组织的树脂半薄切片；A,B以0.5％番红与1％甲基紫的混合液(1：1)染色，细胞核染色有点深，但细胞质与液泡明显；C,D以0.5％番红与1％甲基紫的混合液(2：1)染色，细胞核染色适当，但细胞质与液泡不太明显；也就是说，体积比1：1的0.5％番红与1％甲基紫混合染液的染色效果还是相对好一些，能兼顾到更多的细胞结构。图5是不同发育天数的玉米胚乳传递细胞的树脂半薄切片，以0.5％甲苯胺蓝-O染色；图未经任何处理，图版中各图片颜色差异太大，使得图整体不美观。图6是甲苯胺蓝-O染色失败的例子；A中存在一些杂质，是因为染液变质产生沉淀；B中箭头所指是水渍，具体原因可能与烤片时间不足有关；C中产生的小裂纹和D中细胞间的染色反常(如箭头所示)，都是因为烤片时间过久导致的；因此，甲苯胺蓝-O染色法对染色的时间与温度要求都很严格，而本发明的番红与甲基紫混合染色法对时间与温度就没这么敏感。

Claims

1.一种树脂切片的番红与甲基紫混合染色法，其特征在于：包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的树脂切片的番红与甲基紫混合染色法，其特征在于：步骤(2)中，将质量浓度为0.5％的番红与质量浓度为1％的甲基紫分别按1：1，1：2，2：1的体积比混合后对树脂半薄切片进行染色。

3.如权利要求1所述的树脂切片的番红与甲基紫混合染色法，其特征在于：步骤(1)中，质量浓度为0.5％的番红溶液的配制方法是：用电子天平称取0.5g番红，放入烧杯中；加入100mL 75％的酒精溶解；溶解后过滤，将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。

4.如权利要求1所述的树脂切片的番红与甲基紫混合染色法，其特征在于：步骤(1)中，质量浓度为1％的甲基紫溶液的配制方法是：用电子天平称取1g甲基紫，放入烧杯中；加入100ml蒸馏水溶解；溶解后过滤，将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。

5.一种树脂切片的番红与甲基紫混合染液，其特征在于：包括质量浓度为0.5％的番红溶液和质量浓度为1％的甲基紫溶液。