CN102492767A - 一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法，其具体步骤为：材料培养；预处理；固定；保存；解离；染色、涂片和压片；镜检和观察。本发明所述的制备方法成本低、操作过程更为简便快捷并能获得更理想的悬钩子属植物核型分析的染色体标本。

Description

一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法

技术领域

本发明属于细胞遗传学与细胞生物学领域，涉及一种染色体制备方法，尤其涉及一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法。

背景技术

染色体是生物体内在的遗传物质基础，是遗传物质的主要载体。染色体大小、数目和形态(即核型特征)在植物的生长发育和世代繁衍过程中相对稳定，不易受环境条件变化的影响产生变异，能在很大程度上反映物种特性及其遗传差异。因此，不同物种的染色体核型特征甚至染色体数目可为本属植物分类、系统发育和亲缘关系鉴定提供细胞学依据。当对特定类群细胞内染色体数目、形态和核型等进行比较研究时，供核型分析的染色体标本必须核型特征完整、清晰。目前广泛采用制备植物染色体标本的方法有2种，一是常规压片法(具体原理见李懋学和张敩方，1991)，一是酶解去壁低渗法(陈瑞阳等，1979)。

悬钩子属是蔷薇科(Rosaceae)中一个大属，其形态变异异常丰富。据统计，全世界有悬钩子属植物750-1000种(陆玲娣，1983；Thompson，1997)。由于悬钩子属植物多为多年生木本植物，其染色体数目较多和较小(多为1-3um)，若获得理想的能进行核型分析的染色体标本，采用现有的常规压片法和酶解去壁低渗法，方法流程或繁琐，并有一定的技术难度，或效果不尽理想。比如在我们的对比试验中，采用陈瑞阳等(1979)的去壁低渗法制备适于适于悬钩子属植物核型分析的染色体标本，其方法过程繁琐、技术难度较大，特别是合适酶解去壁时间难把握，而且，酶解去壁需要纤维素酶和果胶酶，标本制作成本较高。而采用李懋学等的常规压片法(1991)，制备悬钩子属植物染色体标本操作流程相对去壁低渗法简单，但相对本申请专利保护的染色体标本制作的方法技术流程，还是需要较长的处理时间，并且适合进行悬钩子属植物核型分析的染色体标本的效果较差。因此，在我们采用本申请专利保护的技术方法流程有效地进行悬钩子属植物的28个种类15个品种的50多个样本的染色体核型分析之前，全世界悬钩子涉及染色体核型研究的物种只有8个种(Pool et al.，1981；Iwatsubo & Naruhashi，1991；陈瑞阳，1993；李秀兰等，1993；林盛华，1994)，其中有6个种使用酶解去壁低渗法，2个物种使用常规压片法获得染色体标本，同样的物种，其染色体标本效果不佳。

现有的植物染色体标本制片技术，一是李懋学(1991)的压片法，一是陈瑞阳(1979)的酶解去壁低渗法。

两种技术的取材和预处理的要求和操作一致，前者操作较后者简便，主要的技术流程依次包括材料的培养和取材、预处理、固定、(保存)、解离，染色和压片。但对木本植物的染色体标本的制备来说，其效果远不及陈瑞阳的酶解去壁低渗法(1979，1993，1994，2003，2003，2008)。因此，下面重点介绍陈瑞阳等的酶解去壁低渗法的详细技术流程。

陈瑞阳等的酶解去壁低渗法(1994)

一 设备、药品

(一)设备：

1 研究显微镜，最好具显微照相设备。

2 培养箱，室温至60℃。

3 蒸馏水重蒸设备，以玻璃制品为优。

4 冰箱，0℃。

5 其他用具：眼科镊子、保安刀片、磨口三角瓶(50-100毫升)、移液管(10、20毫升)、烧杯(50、100毫升)、试剂瓶(250、500毫升)、刻度滴管(1、2毫升)、酒精灯、普通载玻板20×20厘米以上、牙签、青霉素瓶。

(二)药品：

1 秋水仙碱、8-羟基喹啉、对二氯代苯、α-溴代萘。

2 纤维素酶(上海酒精二厂，上海东风试剂厂产品)。

3 果胶酶(SERVA)。

4 Giemsa母液0.5克Giemsa粉加33毫升优质丙三醇于研钵中，充分研磨1小时，然在56℃温箱中保温2小时，再加入33毫升甲醇(GR)，混匀装入试剂瓶内保存备用，储存时间越长越好。

5 甲醇AR级以上。

6 冰醋酸AR级以上。

7 磷酸缓冲液：

A液：0.067M磷酸二氢钾：称取KH2PO4 49.118克，置于容量瓶内加蒸馏水至1000毫升。

B液：0.06M磷酸二氢钾：称取无水Na2HPO49.467克，置于容量瓶内加蒸馏水至1000毫升。

使用时根据pH值的要求按表1所列比例混合：

表1

8 Giemsa染色液：(必须临用前配制)100毫升磷酸缓冲液+3-5毫升Giemsa母液。

9 混合酶液：称取纤维素酶、果胶酶各0.5克，加入20毫升蒸馏水即为2.5％的酶液，冰箱内冰冻保存，用前熔化，酶液少配，配好的酶液不要储存过久，免生杂菌。

二 操作规程

(一)取材

作为染色体研究材料，取材部位必须，必须少而精，切忌多而杂，同时材料要新鲜，尽可能保持其生活状态。由于果树多为木本双子叶植物，异花授粉，其种子根尖细胞为一个杂合体，除在特定的隔离区内采集的种子可供染色体分析外，一般不经人工隔离采集的栽培果树种子，不能用于遗传学。我们使用的果树材料大部分是在早春采集的生长旺盛的幼芽或幼叶，休眠芽不适合取材作细胞学观察。幼芽和幼叶的取材，大小因果树的不同而异。

(二)预处理

采集的新鲜幼芽或幼叶用镊子轻轻地剥去外面的叶鳞，具绒毛的叶片要去去掉绒毛，窃取生长锥和叶原基部分，然后立即放入预处理药品中。用于预处理的药品很多，如秋水仙素(Colchicine)；8-羟基喹啉(8-Hydroxyquinoline)；对氯二代苯(P-dichlorobenzene)和α-溴代萘(α-bromonaphthalene)，我们的经验是混合药物处理比单一的药品处理效果为佳，通常采用以0.002M8-羟基喹啉为溶剂，配制0.01-0.2％秋水仙素，对多种植都能取得很好的效果。关于预处理的时间，除活体出来时间可略长外，一般离体处理以2-4小时为宜，时间过长造成材料死亡，对低渗法是不适宜的。至于预处理的开始时间，我们没有硬性规定，而是看材料本身生长状态和环境条件，正常天气，一般上午8:30分开开始取材预处理。遇偶阴雨低温天气，要等气温回升再取材。预处理时的温度，以正常生长温度为宜。材料在预处理中，可以进行整理切割。一般野外采集的材料常带有泥沙，要换入新的预处理液。较大的材料要切得小一些，使预处理药液容易渗入。在预处理结束前，根据试验样品的多少和个人的操作快慢，可提前适当时间进行材料的切割，材料的切割的大小要严格控制在1-2毫米。各样品之间和每次试验切取的材料的大小要尽量一致，不要忽大忽小，造成酶解时间难控制，切取材料量与加入酶液的体积要有一定的比例，一般控制在1∶20-1∶50。材料过多酶解消化不足，会造成试验失败。材料切割时速度要尽量快些，不要使材料干枯死亡。切好的材料要立即放回到小瓶内，滴加预处理药液，待材料全部切完后。一起转入下一步处理。

(三)前低渗

用刻度滴管吸去预处理药液，直接换入0.075M KCl溶液或重蒸水低渗液，在25℃左右低渗30分钟.

(四)酶解去壁

吸去KCl溶液，加入2.5％混合酶液，在25℃左右条件下酶解2-4小时，酶解去壁的时间，因材料不同而异，酶解过程中最好将材料轻轻地摇1-2次，使酶液充分作用，酶解去壁是果树染色体去壁低渗法的关键所在，应严格掌控。

(五)后低渗

在酶解材料瓶中慢慢加入25-30℃的重蒸水轻轻地冲洗2-3次，根据酶解消化的程度，在重蒸水中停留10-30分钟进行后低渗处理，后低渗完，可以有以下两种方法制备染色体标本。

1 悬液法制备染色体标本

固定：向细胞悬液中加入新配制的甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液2-3毫升，使成细胞悬液。

去沉淀：静止片刻使大块组织沉淀，然后向另一小瓶中倒取上层细胞悬液，去掉沉淀物。

去上清液：将上层细胞悬液静止30分钟左右，可见细胞沉淀，用吸管轻轻吸去上层液。留约1毫升左右细胞悬液制备标本。

标本制备：取一张经过充分洗涮脱脂，预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片，用滴管滴2-3滴细胞悬液于其上，立即将一端抬起，并轻轻吹气，促使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干或在80℃烘箱中烤干。

染色：将干燥的片子用20∶1或40∶1Giemsa染色，染色时间因材料不同而异，然后用自来水冲洗，立即将水甩净，空气干燥后显微镜观察。

2 涂片法制备染色体标本

固定：将后低渗材料，用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定30分钟以上。

涂片：将材料放在预先在蒸馏水中冷冻的载玻片上，一滴固定液，然后用镊子迅速挟碎，去掉大块组织残渣。

火焰干燥：将载玻片在酒精灯火焰上微热烤干。染色后各步骤与悬液相同

去壁低渗法简要流程图如图1所示。

采用预先固定的材料，可上述方法作如下改动：

经前低渗处理的材料，用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定，固定时间如超过4小时，将材料转入70％的酒精中保存。

酶解前经蒸馏水冲洗数次并浸泡30分钟，除掉固定液。

酶解时间可以缩短0.5-2小时。

以重蒸水浸泡(后低渗)60-90分钟，以后各步骤与前法相同，经预先固定的材料，分裂相常常较多，但染色体分散度较差，常呈“七零八落”状态，计数时必须注意先固定后酶解，因细胞质膜已失去半渗透性，染色体已不可能因低渗作用而分散到细胞质中，但经较长时间的浸泡，细胞还会吸水而软化膨胀达到染色体散开，只是散开的度不如常规的舒展有规律。(陈瑞阳、宋文芹、李秀兰)。

现有技术主要存在以下缺点：

(1)常规压片法制作的染色体与其背景常常不分明，且染色体不分散，直接影响悬钩子属植物染色体的核型特征，很影响具有木本小染色体特性(1-3um)的悬钩子属植物染色体的制备效果和相应的核型分析如图3所示，所用材料分别为悬钩子属植物插田泡R.coreanus(2n＝2x＝14，A)、茅莓R.parvifolius(2n＝2x＝14，B)以及插田泡R.coreanus和欧洲红树莓R.idaeus的杂种(2n＝2x＝14，C)-为4um(A-B Iwatsubo & Naruhashi，1991；CPool et al.，1981)；

(2)酶解去壁低渗法方法繁琐，并且技术要求较高，同时试剂如购买需要量大的纤维素酶和果胶酶花费较高，大大提高了制作染色体核型的成本，且其悬钩子属植物染色体标本效果不及本申请保护的方法技术流程如图4所示，所用材料分别为茅莓R.parvifolius(2n＝4x＝28，D)、黄树莓R.xanthocarpus(2n＝2x＝14，E)、欧洲红树莓R.idaeus(2n＝2x＝14，F)和绿叶悬钩子R.komarovii(2n＝4x＝28，G)，-为5um(陈瑞阳等，1993；李秀兰等，1993；林盛华，1994)。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种成本低、操作过程更为简便快捷并能获得更理想的悬钩子属植物核型分析的染色体标本的制备方法。其技术方案为：

一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法，其具体步骤为：

1)材料培养

通过茎扦插繁殖获取不定根，取3-5个节位的嫩梢或硬枝，扦插于塑料大棚以蛭石为基质的插床中，进行常规管理，待不定根长至1-2cm时，取健壮插穗的正在生长的根尖；

2)预处理

用0.002mol L^-1 8-羟基喹啉0-4℃下预处理24h；

3)固定

将步骤2)处理的根尖置于卡诺氏固定液I(无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v，)在0-4℃下固定24h；

4)保存

将步骤的材料置于70％的乙醇中，冰箱中冷藏备用；

5)解离

取出步骤4)固定好的根尖，流水冲洗约3min，吸水纸吸干，放入小试管中，加3-5ml的1mol L^-1的HCl于60±0.5℃水浴解离60-90s，然后将HCl溶液用胶头吸管吸出，终止解离，用重蒸馏水洗涤3次，保存在重蒸馏水中备用；

6)染色、涂片和压片

取根尖置于载玻片上，用刀片切除根冠，再切分生区置于载片上，用镊子或解剖针将将材料分割成若干小块，并用解剖针轻轻涂匀；然后加1/2-1滴改良苯酚品红染液于材料上，再用解剖针轻轻涂抹，使小块尽可能分散在染液中，盖上盖玻片；

将正在处理的载玻片一边斜靠在在火柴头上，从上一侧在盖玻片处再滴一滴改良苯酚品红染液，点燃一盏酒精灯，烘烤处理的材料，烘烤1-2min，将载玻片大小的滤纸条折叠，用一手2个指头压住覆有滤纸条盖玻片的两个角，以免盖片移动，另一只手用解剖针头或有橡皮的的铅笔头对准材料轻轻敲击盖玻片，使材料均匀分散为一薄层为止，在显微镜上镜检观察，看材料是否分散以及是否有分裂相，最后用大拇指紧压盖有盖玻片的装片处；

7)镜检和观察

镜检观察，用奥林巴斯BX-51型显微镜观察，若染色体效果不尽理想，重复步骤6)，直至获得理想的染色体标本为止，然后DP70摄像头拍照、CCD分析软件进行照片处理。

进一步优选，所述步骤1)中在扦插后2-4周取材。

进一步优选，步骤7)中所述不尽理想情况为个别染色体不分散，或核型特征不清晰。

本发明的有益效果：

(1)用插穗不定根替代幼叶、茎尖和种子或树体的根尖，不仅保证了研究材料遗传背景的一致性，而且插穗不定根发生容易，处于有丝分裂的细胞多而集中，为提高获得适合核型分析的染色体创造了机会；

(2)预处理采用一定浓度的8-羟基喹啉在低温(0-4℃)进行预处理，使染色体聚缩至合适长度，又因随后的低温改变了细胞质粘度，使得染色体更加清晰和分散；

(3)染色体制作成本低；

(4)解离时间短，上色容易，制作的染色体标本质量高；

(5)本发明所述的制备方法简便、快捷。

附图说明

图1是去壁低渗法简要流程图；

图2是本发明所述方法的流程图；

图3是压片法获得的悬钩子属植物部分物种的染色体标本效果图；

图4是酶解去壁低渗法获得的悬钩子属植物部分物种的染色体标本效果图；

图5是本发明制备方法获得的悬钩子属植物部分物种的染色体标本效果图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。

参照图2，一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法，其具体步骤为：

1)材料培养

通过茎扦插繁殖获取不定根，取3-5个节位的嫩梢或硬枝，扦插于塑料大棚以蛭石为基质的插床中，进行常规管理，待不定根长至1-2cm时，在扦插后2-4周取材，取健壮插穗的正在生长的根尖；

2)预处理

用0.002mol L^-1 8-羟基喹啉0-4℃下预处理24h；

3)固定

将步骤2)处理的根尖置于卡诺氏固定液I(无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v，)在0-4℃下固定24h；

4)保存

将步骤的材料置于70％的乙醇中，冰箱中冷藏备用；

5)解离

取出步骤4)固定好的根尖，流水冲洗约3min，吸水纸吸干，放入小试管中，加约3-5ml的1mol L^-1的HCl于60±0.5℃水浴解离约60-90s，然后快速将HCl溶液用胶头吸管吸出，以终止解离，用重蒸馏水轻轻洗涤3次，保存在重蒸馏水中备用，解离过度或解离不足，都会严重影响染色体标本的质量，前者不易上色和染色体不分散，后者容易导致细胞不软化，一个细胞的染色体很难被清晰处理在一个平面上需要说明的是，一定用重蒸馏水洗涤，并保存在重蒸馏水中；

6)染色、涂片和压片取根尖置于载玻片上，用刀片切除根冠，再切分生区置于载片上，用镊子或解剖针将将材料分割成若干小块，并用解剖针轻轻涂匀；然后加1/2-1滴改良苯酚品红染液于材料上，需要说明的是，切不可多加，否则，材料很容易在压片时随从多余溶液溢出盖片之外，再用解剖针轻轻涂抹，使小块尽可能分散在染液中，盖上盖玻片；

然后将正在处理的载玻片一边斜靠在在火柴头上，从上一侧在盖玻片处再滴一滴改良苯酚品红染液，使其缓缓渗入至整个盖玻片所在的区域，点燃一盏酒精灯，将处理了材料的玻片平置于其上来回轻轻晃动，即酒精灯微微烘烤处理的材料，烘烤1-2min，需要说明的是：烘烤的温度稍高较好，以不烫手为宜，且不能使有材料的染液沸腾，将载玻片大小的滤纸条折叠，用一手2个指头压住覆有滤纸条盖玻片的两个角，以免盖片移动，另一只手用解剖针头或有橡皮的的铅笔头对准材料轻轻敲击盖玻片，使材料均匀分散为一薄层为止。其目的是：使染色剂尽快地渗入到细胞中，使染色体染上颜色，再使细胞破裂，染色体分散，当烘烤温度至合适时，以不烫手为宜，染色体颜色不变，但染色体所处背景的染液颜色很快退去，使染色体核型特征明显和分散，这便于染色体计数和进行核型分析，然后在显微镜上镜检观察，看材料是否分散以及是否有分裂相，最后用大拇指紧压盖有盖玻片的装片处；

7)镜检和观察

镜检观察，用奥林巴斯BX-51型显微镜观察，若染色体效果不尽理想，个别染色体不分散，或核型特征不清晰，重复步骤6)，直至获得理想的染色体标本为止，然后DP70摄像头拍照、CCD分析软件进行照片处理。

参照图5，所用材料分别为前面2种染色体标本方法所用到的悬钩子属植物插田泡R.coreanus(2n＝2x＝14A)、茅莓R.parvifolius(2n＝2x＝14，B)、茅莓(2n＝4x＝28，C)和欧洲红树莓R.idaeus(2n＝2x＝14D)。-为3um。从图4可以看出，本发明技术方案制备的染色体清晰、伸展、染色体核型特征明显。

Claims (3)

1.一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法，其特征在于，其具体步骤为：

1)材料培养

通过茎扦插繁殖获取不定根，取3-5个节位的嫩梢或硬枝，扦插于塑料大棚以蛭石为基质的插床中，进行常规管理，待不定根长至1-2cm时，取健壮插穗的正在生长的根尖；

2)预处理

用0.002mol L^-1 8-羟基喹啉0-4℃下预处理24h；

3)固定

将步骤2)处理的根尖置于卡诺氏固定液I(无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v，)在0-4℃下固定24h；

4)保存

将步骤的材料置于70％的乙醇中，冰箱中冷臧备用；

5)解离

取出步骤4)固定好的根尖，流水冲洗约3min，吸水纸吸干，放入小试管中，加3-5ml的1mol L^-1的HCl于60±0.5℃水浴解离60-90s，然后将HCl溶液用胶头吸管吸出，终止解离，用重蒸馏水洗涤3次，保存在重蒸馏水中备用；

6)染色、涂片和压片

取根尖置于载玻片上，用刀片切除根冠，再切分生区置于载片上，用镊子或解剖针将将材料分割成若干小块，并用解剖针轻轻涂匀；然后加1/2-1滴改良苯酚品红染液于材料上，再用解剖针轻轻涂抹，使小块尽可能分散在染液中，盖上盖玻片；

将正在处理的载玻片一边斜靠在在火柴头上，从上一侧在盖玻片处再滴一滴改良苯酚品红染液，点燃一盏酒精灯，烘烤处理的材料，烘烤1-2min，将载玻片大小的滤纸条折叠，用一手2个指头压住覆有滤纸条盖玻片的两个角，以免盖片移动，另一只手用解剖针头或有橡皮的的铅笔头对准材料轻轻敲击盖玻片，使材料均匀分散为一薄层为止，在显微镜上镜检观察，看材料是否分散以及是否有分裂相，最后用大拇指紧压盖有盖玻片的装片处；

7)镜检和观察

镜检观察，用奥林巴斯BX-51型显微镜观察，若染色体效果不尽理想，重复步骤6)，直至获得理想的染色体标本为止，然后DP70摄像头拍照、CCD分析软件进行照片处理。

2.根据权利要求1所述的适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法，其特征在于，所述步骤1)中在扦插后2-4周取材。

3.根据权利要求1所述的适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法，其特征在于，步骤7)中所述不尽理想情况为个别染色体不分散，或核型特征不清晰。

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